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    繼代培養(yǎng)時間對抗性黑松體胚發(fā)生的影響

    2019-04-16 02:48:06王艷麗孫婷玉沈李元吳小芹葉建仁朱麗華
    西南林業(yè)大學學報 2019年2期
    關鍵詞:體胚胚性黑松

    王艷麗 孫婷玉 沈李元 吳小芹 葉建仁 朱麗華

    ( 南京林業(yè)大學南方林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心,林學院,江蘇 南京 210037)

    松材線蟲病是由松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)引起的一種毀滅性森林病害,主要危害松屬植物,對森林資源和生態(tài)環(huán)境造成了嚴重的威脅,大量研究表明,松材線蟲病抗性選育已成為防御松材線蟲病危害的重要途徑[1]。日本松材線蟲病抗性育種工作較為先進,先后2次對感病黑松(Pinus thunbergii)和赤松(Pinus densiflora)開展了抗性選育工作,最終篩選出了多個黑松、赤松抗性家系并建立抗病種子園[2]。江蘇省有害生物預防與控制重點實驗室于2004年從日本引進一批抗性種子材料,并建立了抗松材線蟲病黑松、赤松優(yōu)良家系基因資源庫,但種質(zhì)資源有限,遠不能滿足林業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的需要。因此建立優(yōu)良無性系黑松的快繁體系具有重要意義。另外李清清等[3]已對抗松材線蟲病赤松組培苗進行了抗病性測定,抗性家系表現(xiàn)出一定的抗病性,朱麗華等也報道了赤松的微繁殖及其對線蟲的抗性[4]。

    目前,抗性黑松體細胞胚胎發(fā)生及植株再生體系雖已經(jīng)建立[5],但抗性黑松胚性愈傷組織誘導率較低,最高僅為7.8%[6],所以胚性愈傷彌足珍貴,胚性愈傷組織保持十分重要。植物組織培養(yǎng)過程中,繼代培養(yǎng)是其中重要的環(huán)節(jié),而長期繼代則是種質(zhì)資源離體保存的必要手段[7]。已有研究發(fā)現(xiàn),植物細胞在離體培養(yǎng)時,再生頻率和再生植株的質(zhì)量與培養(yǎng)時間密切相關[8]。隨著繼代次數(shù)的增加很多植物愈傷組織的分化率會呈下降趨勢[9],如梨 S 系矮化砧 (Picea wilsonii)[10]、葉毛棗(Ziziphsu mauritiana)[11]、杉木(Cunninghamia lanceolata)[12]、球根海棠(Begonia tuberhybrida)[13]以及一些落葉松屬的樹種[14-15]。也有研究表明,胚性愈傷組織的體胚發(fā)生能力是可以長期保持的,如白杄(Picea meyeri)的胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)3 a其增殖能力和分化潛力仍保持在原來的水平,無明顯降低趨勢[16];青杄(Picea wilsonii)愈傷組織在適宜的繼代條件下,培養(yǎng)3 a繼代40次體細胞胚的分化率仍可達90%以上[17];此外,棉花(Gossypiumspp.)、玉米(Zea mays)等的胚性愈傷組織體胚發(fā)生能力也是能夠長期保持的[18-20]。在長期繼代中愈傷組織是否會保持一定的體胚發(fā)生和植株再生能力,這關系到組培快繁技術的實用化問題。國內(nèi)外文獻雖見對黑松組培技術的相關研究,但有關黑松愈傷組織在長期繼代中分化能力的研究卻很少。因此,通過對抗性黑松胚性愈傷組織體胚發(fā)生及植株再生能力進行了研究,以培養(yǎng)0.5、1.5、3.5 a的胚性愈傷組織為材料,從細胞形態(tài)、愈傷組織增殖率、每克胚性愈傷形成的體胚數(shù)、以及獲得體胚的正常萌發(fā)率和植株成活率等方面,具體評估繼代培養(yǎng)時間對愈傷組織再生分化的影響,以期為抗性黑松體胚發(fā)生快繁體系中篩選出最佳的培養(yǎng)材料,提高組培苗的生產(chǎn)效率。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    黑松未成熟球果采集于抗松材線蟲病黑松優(yōu)良家系基因資源庫(本課題組于2004年從日本良種繁育中心引進抗性種子材料建立[21]),當年從球果中剝離出未成熟合子胚并誘導出具有胚性的愈傷組織,愈傷組織的誘導方法見文獻[5-6]。誘導的抗性黑松37#家系胚性愈傷組織在DCR+2,4-D 0.5 mg/L+KT 0.1 mg/L和DCR+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.5 mg/L 2種增殖培養(yǎng)基交替培養(yǎng),培養(yǎng)時間分別為0.5 a(繼代12次)、1.5 a(繼代36次)和3.5 a(繼代84次)。愈傷組織采用半固體增殖的培養(yǎng)方式,培養(yǎng)周期為15 d。

    1.2 培養(yǎng)基

    增殖培養(yǎng)基采用DCR基本培養(yǎng)基[22],添加麥芽糖15 g/L、肌醇1 g/L、谷氨酰胺0.5 g/L、酸水解干酪素0.5 g/L、維生素C 0.5 mg/L、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸0.25 g/L、瓊脂(Agar)5.4 g/L。

    成熟培養(yǎng)基采用LP為基本培養(yǎng)基[23],添加脫落酸(ABA)10 mg/L、赤霉素(GA3)0.5 mg/L、麥芽糖30 g/L、肌醇1 g/L、谷氨酰胺1.5 g/L、聚乙二醇(PEG 8000)130 g/L、活性炭(AC)1.5 g/L、植物凝膠(Phytagel)3.4 g/L。

    萌發(fā)培養(yǎng)基采用1/2 LP,添加麥芽糖20 g/L、活性炭(AC)1 g/L、瓊脂(Agar)8 g/L。

    誘導生根培養(yǎng)基采用WPM基本培養(yǎng)基[24],添加0.15 mg/L NAA、1 mg/L IBA、1 g/L活性炭和瓊脂5.4 g/L。

    生長培養(yǎng)基采用1/4 WPM基本培養(yǎng)基(大量元素減少),添加硝酸銨5 mg/L、硼酸0.15 mg/L、蔗糖17.5 g/L、肌醇0.1 g/L、卡拉膠9 g/L。

    所有培養(yǎng)基在滅菌前pH調(diào)至5.8,121 ℃高壓滅菌20 min。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 細胞形態(tài)觀察

    取少量抗性黑松愈傷組織置于載玻片上,滴1滴清水,用鑷子打散,采用醋酸洋紅和伊文思藍雙染色法染色(先用1%醋酸洋紅染色,后滴加0.05%伊文思藍),加蓋玻片吸去多余染液,然后將臨時裝片置于蔡司體式顯微鏡下觀察愈傷組織的細胞結(jié)構(gòu)。

    1.3.2 指標測定

    增殖率:稱取一定量抗性黑松胚性愈傷組織(M1),在DCR半固體增殖培養(yǎng)基上生長15 d,稱取愈傷組織質(zhì)量(M2),愈傷組織增殖率=(M2-M1)/M1×100%。

    每克胚性愈傷組織發(fā)育形成成熟體細胞胚數(shù)量:將一定量的增殖愈傷轉(zhuǎn)入LP成熟培養(yǎng)基,2個月后統(tǒng)計形成的體胚數(shù)。以每克愈傷組織形成的成熟胚數(shù)量作為衡量細胞產(chǎn)胚能力的主要參數(shù)。每克愈傷組織形成成熟胚數(shù)量的測定:稱取一定量愈傷組織放入成熟培養(yǎng)基,2個月后統(tǒng)計每培養(yǎng)皿成熟培養(yǎng)基的體胚數(shù)。每培養(yǎng)皿3團胚性愈傷組織,每團1 g,3個重復。每克胚性愈傷組織形成的成熟體細胞胚數(shù)量=愈傷組織出胚數(shù)(個)/愈傷組織質(zhì)量(m)。在此期間,記錄愈傷組織形成成熟體細胞胚的時間。

    體胚萌發(fā)率、畸形率、死亡率:將成熟培養(yǎng)基所得的成熟體細胞胚水平放置1/2 LP萌發(fā)培養(yǎng)基上,每皿15個胚,3個重復,非直射光照培養(yǎng)5 d,再轉(zhuǎn)直射光照培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計體胚的萌發(fā)情況。萌發(fā)率(%)=萌發(fā)正常體胚個數(shù)/接種體細胞胚個數(shù)×100%;畸形率(%)=畸形體胚個數(shù)/接種體細胞胚個數(shù)×100%;死亡率(%)=死亡體胚個數(shù)/接種體細胞胚個數(shù)×100%。

    植株成活率:將正常萌發(fā)的植株轉(zhuǎn)入誘導生根培養(yǎng)基中,生長1個月后形成根、莖、葉完整的再生植株。再將植株轉(zhuǎn)入加WPM營養(yǎng)液,V(蛭石)∶V(珍珠巖)為2∶1的基質(zhì)中。2個月后統(tǒng)計植株成活率。每個處理15棵植株,3個重復。植株成活率=成活株數(shù)/接種株數(shù)×100%。

    1.3.3 培養(yǎng)條件及數(shù)據(jù)處理

    培養(yǎng)溫度設定為(23±1)℃,光照強度為3000 lx,愈傷組織誘導、增殖和成熟階段均為暗培養(yǎng)方式,萌發(fā)及生根壯苗階段采用光培養(yǎng)方式(光照16 h,黑暗8 h)。數(shù)據(jù)采用Excel處理,用SPSS19.0軟件進行方差分析和差異顯著性檢驗。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 繼代培養(yǎng)時間對愈傷組織形態(tài)的影響

    在繼代培養(yǎng)過程中,肉眼可見細胞團結(jié)構(gòu)逐漸疏松。顯微觀察發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)0.5、1.5 a和3.5 a的細胞團均具有胚性胚柄細胞團(ESM)結(jié)構(gòu)(圖1)。繼代培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織形態(tài)一致性較好,胚柄纖長,染成紅色的胚頭部分(染色體或染色質(zhì))在整個結(jié)構(gòu)中所占面積較大,細胞核物質(zhì)豐富,細胞排列緊密(圖1a)。繼代培養(yǎng)1.5 a的胚性愈傷組織細胞結(jié)構(gòu),長型的胚柄細胞結(jié)構(gòu)明顯增長,胚頭部分減少,細胞排列緊密(圖1b)。培養(yǎng)3.5 a的胚性愈傷組織細胞胚頭結(jié)構(gòu)比培養(yǎng)0.5 a和1.5 a的細胞胚頭結(jié)構(gòu)松散,胚頭結(jié)構(gòu)明顯減少,胚柄細胞縮短變粗,細胞結(jié)構(gòu)一致性差,出現(xiàn)細胞形態(tài)紊亂的現(xiàn)象。另外在培養(yǎng)3.5 a的胚性愈傷組織中,我們還發(fā)現(xiàn)不少無胚頭結(jié)構(gòu)的空泡細胞(圖1c)。

    2.2 繼代培養(yǎng)時間對愈傷組織增殖的影響

    由圖2可知,繼代培養(yǎng)0.5 a和1.5 a的胚性愈傷組織的增殖率分別為200.37%和182.47%,增值率下降不顯著(P>0.05)。而繼代3.5 a的胚性愈傷組織雖然仍有一定的增殖能力,但是胚性愈傷組織增殖率(111.63%)較培養(yǎng)0.5 a和1.5 a的胚性愈傷組織顯著下降(P<0.05)。由此可知,隨著培養(yǎng)時間的增長,胚性愈傷組織的增殖能力呈下降趨勢。培養(yǎng)1.5 a以內(nèi)的胚性愈傷組織較適于繼代增殖培養(yǎng)。

    2.3 繼代培養(yǎng)時間對愈傷組織體細胞胚成熟的影響

    2.3.1 愈傷組織體胚分化至各階段的時間差異

    將繼代培養(yǎng)0.5、1.5、3.5 a的愈傷組織在DCR增殖培養(yǎng)基上繼代1個周期(15 d)后,選取生長狀態(tài)較好的愈傷(圖3a)轉(zhuǎn)至成熟培養(yǎng)基中,于蔡司體式顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),愈傷慢慢開始聚攏,逐漸干燥,愈傷表面抽出的絲狀結(jié)構(gòu)慢慢增粗(圖3b)。一段時間后,愈傷組織表面出現(xiàn)肉眼可見的柱狀胚伸出,至柱狀胚早期階段(圖3c)。之后,柱狀胚逐漸伸長、增粗、顏色白或黃,至柱狀胚階段(圖3d)。柱狀胚頂端清晰可見子葉形狀至子葉胚前期階段(圖3e)。子葉胚顏色(顏色白或黃)加深,子葉伸長,收攏或張開,形狀基本保持不變,形成成熟子葉胚(子葉胚階段)(圖3f)。

    圖1 抗性黑松不同培養(yǎng)時間胚性愈傷組織的形態(tài)觀察Fig. 1 Morphology of embryogenic callus with subculture times of nematode-resistant P. thunbergii

    圖2 不同繼代培養(yǎng)時間愈傷組織的增值率Fig. 2 Proliferation rate of callus vary with subculture time

    觀察愈傷組織體胚分化成熟過程發(fā)現(xiàn),不同繼代培養(yǎng)時間的愈傷組織分化至體胚各階段的時間存在差異(表1)。培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織在18 d觀察到肉眼可見的柱狀胚前期階段,而培養(yǎng)1.5 a和3.5 a的胚性愈傷組織分別在21 d 和25 d觀察到該現(xiàn)象。在隨后的發(fā)育過程中,培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織達到柱狀胚階段、子葉胚前期階段和子葉胚階段分別用了26、32、46 d;而1.5 a的胚性愈傷組織分別用了30、40、63 d;3.5 a的胚性愈傷組織發(fā)育更為緩慢,達到柱狀胚階段、子葉胚前期階段和子葉胚階段分別用了38、55、74 d,培養(yǎng)時間越長體胚成熟所需時間越長,體胚發(fā)育能力越弱。因此認為,隨著培養(yǎng)時間的延長,胚性愈傷組織細胞在逐漸老化,以致于不同培養(yǎng)時間的愈傷組織形成體胚的時間不一致。

    圖3 抗性黑松體細胞胚成熟觀察Fig. 3 Developmental stages of somatic embryo of nematode-resistant P. thunbergii

    2.3.2 培養(yǎng)時間對胚性愈傷組織產(chǎn)胚數(shù)量的影響

    每克愈傷形成的體胚數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果見圖4。

    圖4 每克愈傷形成的體胚數(shù)量Fig. 4 Somatic embryos yiels of per gram callus

    由圖4可知,不同培養(yǎng)時間的胚性愈傷組織體胚分化能力差異顯著,培養(yǎng)0.5 a胚性愈傷組織每克可生產(chǎn)77個體細胞胚;而培養(yǎng)1.5 a每克可生產(chǎn)31個體細胞胚;培養(yǎng)3.5 a每克可生產(chǎn)5個體細胞胚。培養(yǎng)1.5 a的胚性愈傷組織產(chǎn)胚能力較培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織顯著(P<0.05)下降;培養(yǎng)3.5 a的胚性愈傷組織產(chǎn)胚能力較培養(yǎng)0.5 a和1.5 a的胚性愈傷組織均顯著(P<0.05)下降。因此,認為短期(0.5 a)培養(yǎng)的胚性愈傷組織較1.5 a和3.5 a培養(yǎng)時間的胚性愈傷組織更容易誘導產(chǎn)生體細胞胚,但隨著培養(yǎng)時間的延長,胚性細胞的分化能力會降低。

    2.4 繼代培養(yǎng)時間對體胚萌發(fā)與再生植株成活的影響

    培養(yǎng)時間對體胚萌發(fā)及生長的影響結(jié)果見圖5,體胚萌發(fā)及植株生長發(fā)育情況見圖6。培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織的體胚萌發(fā)率為84.5%,再生植株的成活率為73.3%;而培養(yǎng)1.5 a和3.5 a的胚性愈傷組織的萌發(fā)率分別為51.1%和11.1%,再生植株的成活率分別為50.0%和6.7%。培養(yǎng)3.5 a的胚性愈傷組織的萌發(fā)率和植株成活率較培養(yǎng)1.5 a的胚性愈傷組織顯著(P<0.05)下降;并且培養(yǎng)1.5 a的胚性愈傷組織的萌發(fā)率和植株成活率較培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織也呈顯著(P<0.05)下降趨勢。但是,研究發(fā)現(xiàn)隨著培養(yǎng)時間的增長,畸形率和死亡率呈上升趨勢。培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織的畸形率為8.9%,死亡率為6.9%;而培養(yǎng)1.5 a和3.5 a的胚性愈傷組織的畸形率分別為26.7%和37.8%,死亡率分別為22.3%和40.0%。研究顯示體細胞胚的萌發(fā)和再生植株成活率隨培養(yǎng)時間的增長呈顯著下降,而萌發(fā)的畸形率與死亡率隨培養(yǎng)時間的增長則呈顯著上升趨勢。

    圖5 培養(yǎng)時間對體胚萌發(fā)及生長的影響Fig. 5 The effects of sub-culture time on germination and growth of regenerated plant

    圖6 抗性黑松體胚萌發(fā)及植株的生長發(fā)育Fig. 6 Somatic embryo germination and plant growth of somatic embryos of nematode-resistant P. thunbergii

    3 結(jié)論與討論

    目前,許多學者對松樹的組織培養(yǎng)進行了相關研究,也取得了一定進展。2015—2017年,本實驗室先后報道了抗性黑松[5-6]、抗性赤松的體胚發(fā)生[21,25],但至今抗性黑松的體胚發(fā)生仍存在一些問題,如胚性愈傷組織的誘導率較低,獲得胚性愈傷組織材料極為有限,所以胚性愈傷組織的保持與維持就顯得極為重要。

    先前的研究發(fā)現(xiàn):在胚性胚柄細胞團(ESM)結(jié)構(gòu)中,胚柄是由胚頭基部的分生組織細胞分裂、分化而成的,它對胚頭可提供結(jié)構(gòu)上的支持和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的作用,也是合成生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和儲存一些產(chǎn)物的場所[26]。然而在長期的繼代培養(yǎng)過程中,發(fā)現(xiàn)愈傷組織的胚頭結(jié)構(gòu)會減少,胚柄細胞也出現(xiàn)縮短增粗的現(xiàn)象。胚性愈傷組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化很可能會導致愈傷胚性能力的退化。這與都小龍等對吉粳88愈傷組織細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的研究中報道相似[27]。

    胚性愈傷組織是由胚柄和大量胚性細胞團以及原胚組成的,所以本身就具有一定的分裂能力,可以保持一定的增殖能力。但是研究中發(fā)現(xiàn)抗性黑松胚性愈傷組織增殖率隨著培養(yǎng)時間的增長而降低,這可能與顯微觀察發(fā)現(xiàn)胚頭減少,胚性細胞與原胚團降低有關。在對白云杉(Picea glauca)、黑云杉(Picea mariana)[28-29]、青杄[17]及思茅松(Pinus kesiyavar.langbianensis)[30]的研究中,也觀察到了相似的現(xiàn)象。因此認為在胚性細胞的增殖培養(yǎng)時間不宜過長,最好不要超過1.5 a。且在增殖過程中,要及時將細胞形態(tài)一致性較好的胚性愈傷組織保存。

    在培養(yǎng)時間對體胚產(chǎn)量的研究中發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)0.5 a的愈傷組織產(chǎn)胚能力較強,每克可生產(chǎn)77個體細胞胚,而培養(yǎng)3.5 a的愈傷僅為5個。隨著培養(yǎng)時間的增長,每克愈傷產(chǎn)胚數(shù)量呈顯著(P<0.05)下降趨勢。另外,培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織形成子葉胚的時間為46 d,培養(yǎng)1.5 a胚性愈傷組織需要63 d,而培養(yǎng)3.5 a的胚性愈傷組織需要74 d,培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織形成子葉胚的時間要比培養(yǎng)3.5 a的胚性愈傷組織縮短28 d,培養(yǎng)時間越長體胚成熟過程越慢。這可能與胚性愈傷組織形態(tài)紊亂,胚頭比例下降,胚性逐漸喪失有關。在對杉木(Cunninghamia lanceolata)、海棠(Malusspp.)以及毛葉棗(Ziziphsu mauritiana)的研究中也有發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織在長期繼代過程中會出現(xiàn)形態(tài)發(fā)生能力喪失的現(xiàn)象[9-15]。研究證實了在松屬樹種中這個現(xiàn)象仍然存在。另外,研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)時間對體胚萌發(fā)和再生植株的成活也具有非常大的影響。培養(yǎng)1.5 a的胚性愈傷組織的萌發(fā)率(51.1%)和植株成活率(50.0%)較培養(yǎng)0.5 a的胚性愈傷組織的萌發(fā)率(84.5%)和植株成活率(73.3%)顯著下降;培養(yǎng)3.5 a的胚性愈傷組織的萌發(fā)率(11.1%)和植株成活率(6.7%)較培養(yǎng)1.5 a的胚性愈傷組織也呈顯著下降趨勢。而隨著培養(yǎng)時間的增長,萌發(fā)的畸形率和死亡率則由8.9%和6.9%上升到37.8%和40.0%(圖5)。體胚的萌發(fā)和再生植株成活率都隨著培養(yǎng)時間的延長顯著下降,而萌發(fā)的畸形率與死亡率與培養(yǎng)時間則呈顯著上升趨勢。這與薛美鳳等對棉花胚性愈傷組織長期繼代的結(jié)果相一致[8]。

    因此,隨著繼代培養(yǎng)時間的增長,胚性愈傷組織的增殖能力、產(chǎn)胚能力以及體胚萌發(fā)和再生植株成活能力均下降,而萌發(fā)的畸形率和死亡率在逐漸增加。因此,在抗性黑松體胚發(fā)生過程中要及時對培養(yǎng)的胚性愈傷組織進行更新?lián)Q代,以保持體胚發(fā)生良好的原始材料;在胚性愈傷組織培養(yǎng)過程中要對胚性細胞形態(tài)進行及時的跟蹤觀察,確保細胞的形態(tài)維持良好;短期培養(yǎng)的胚性愈傷組織(0.5 a)為抗性黑松體胚發(fā)生較為理想的初始材料,且愈傷組織繼代培養(yǎng)時間不宜超過1.5 a。

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