甲狀腺乳頭狀癌中線粒體基因組D環(huán)區(qū)基因突變的研究

浮苗 范希景 傅媛 方莉萍 祝驍濤 王玉 王金華

近年來，越來越多的研究證實(shí)線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）突變以及線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常可能與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[1]。mtDNA的非編碼區(qū)D環(huán)主要調(diào)控DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，幾乎所有與DNA轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和翻譯相關(guān)的調(diào)控序列都位于該區(qū)[2]。D環(huán)區(qū)作為突變的熱點(diǎn)區(qū)域，在乳腺、宮頸、胃、結(jié)直腸、肺、肝、腎等惡性腫瘤中都表現(xiàn)為高突變率[3]，其突變形式主要是單個(gè)堿基的突變、缺失、插入大片段的缺失以及微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）。因此，不可忽視mtDNA D環(huán)區(qū)突變?cè)谀[瘤發(fā)生機(jī)制中的作用。為了研究mtDNA突變?cè)诩谞钕偃轭^狀癌發(fā)病機(jī)制中的作用，筆者對(duì)71例甲狀腺乳頭狀癌患者采用直接測(cè)序法分析各標(biāo)本mtDNA D環(huán)區(qū)突變，為甲狀腺腫瘤病因?qū)W研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為臨床甲狀腺腫瘤的診斷和治療提供參考。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取我院2017年5月至2018年4月病理診斷為甲狀腺乳頭狀癌的患者71例，所有患者均無血緣關(guān)系，無其他組織、臟器腫瘤，無糖尿病等其他現(xiàn)在已知與線粒體突變相關(guān)的疾病。男24例，女47例；年齡18～64歲，中位年齡48歲。在藥物治療或放化療之前采集患者的甲狀腺乳頭狀癌組織和癌旁正常甲狀腺組織（距離癌組織5cm以外）以及靜脈血2ml。癌組織和癌旁正常組織均經(jīng)病理檢查證實(shí)后立即液氮冷凍，其中癌組織在病理醫(yī)師指導(dǎo)下避開鈣化和膠原化區(qū)域取其癌細(xì)胞豐富部位，癌旁正常組織病理切片光鏡下未見腫瘤細(xì)胞。

1.2 方法

1.2.1 DNA抽提 使用DNA提取試劑盒（天根公司），提取甲狀腺腫瘤組織和血液細(xì)胞總DNA。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 D環(huán)區(qū)的PCR擴(kuò)增引物采用primer 5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，由杭州擎科生物公司合成。引物序列如下，L15975F：5′-CTCCACCATTAGCACCCAAAGC-3′，H794R：5′-AGGCTAAGCGTTTTGAGCTG-3′。引物299F GGTGGAAATTTTTTGTTATG，用于測(cè)序時(shí)從mt16184到mt16193遇到poly結(jié)構(gòu)加測(cè)。使用PCR擴(kuò)增試劑盒進(jìn)行PCR（日本TaKaRa公司），在PCR反應(yīng)管中依次加入下列物質(zhì)：2×PCR Premix 25μl，上游引物1μl，下游引物 1μl，模板 DNA 2μl，滅菌雙蒸水補(bǔ)足至終體積為 50μl。PCR 擴(kuò)增：95℃預(yù)變性 5min；94℃變性30s，57℃退火 30s，72℃延伸 40s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸4min擴(kuò)增。取2μl反應(yīng)產(chǎn)物，在1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。對(duì)于擴(kuò)增效果良好且足量的樣品，進(jìn)一步進(jìn)行純化和測(cè)序。

1.2.3 測(cè)序 測(cè)序委托杭州擎科生物公司進(jìn)行。測(cè)序反應(yīng)所用引物與PCR反應(yīng)引物相同，所有樣品均進(jìn)行雙向測(cè)序。D環(huán)區(qū)的基因序列與劍橋標(biāo)準(zhǔn)序列（revised Cambridge reference sequence，rCRS）進(jìn)行比對(duì)。在某一位點(diǎn)上癌組織、癌旁組織和外周淋巴細(xì)胞堿基一樣，而與數(shù)據(jù)庫不同就認(rèn)為這是一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，如果數(shù)據(jù)庫（MITOMAP、mtDB和mtSNP）沒有記載就是新發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性位點(diǎn)；癌組織與癌旁組織和外周血堿基不一樣，而癌旁正常甲狀腺組織和外周血堿基是一樣（為除外組織特異性多態(tài)），就認(rèn)為該位點(diǎn)在癌組織中發(fā)生突變。在實(shí)驗(yàn)中突變型mtDNA和野生型mtDNA同時(shí)被擴(kuò)增，測(cè)序反應(yīng)時(shí)表現(xiàn)為套峰，即在同一位點(diǎn)出現(xiàn)兩個(gè)堿基，且堿基峰線起降一致，周圍序列測(cè)序基線正常無雜亂峰線即可判定為異質(zhì)性突變。另外為排除系統(tǒng)誤差，對(duì)存在mtDNA突變的區(qū)域重新進(jìn)行PCR反應(yīng)和DNA測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌患者mtDNA D環(huán)區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果 擴(kuò)增各標(biāo)本mtDNA D環(huán)區(qū)，所有樣品均擴(kuò)增出1 543 bp片段，見圖1。

圖1 mtDNA D環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳圖（M：DNA Ladder Marker；1-3：甲狀腺乳頭狀癌組織、癌旁組織、血液mtDNA目的片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；4：陰性對(duì)照）

2.2 甲狀腺乳頭狀癌患者mtDNA D環(huán)區(qū)多態(tài)性變化情況 本研究中，當(dāng)甲狀腺乳頭狀癌組織、癌旁組織及外周血測(cè)序結(jié)果完全一致，而與數(shù)據(jù)庫不同方確定為多態(tài)性變化。71例甲狀腺乳頭狀癌患者中發(fā)現(xiàn)167個(gè)多態(tài)性改變，人均變異數(shù)為2.35個(gè)，146個(gè)位點(diǎn)MITOMAP，mtDB和mtSNP數(shù)據(jù)庫均有記載，但有21個(gè)位點(diǎn)并未見記載，見表1。

表1 甲狀腺乳頭狀癌mtDNA D環(huán)區(qū)新的多態(tài)性變化

2.3 甲狀腺乳頭狀癌患者mtDNA D環(huán)區(qū)點(diǎn)突變情況在71例患者中有9例mtDNA D環(huán)區(qū)點(diǎn)突變，出現(xiàn)了A-G、T-C、C-T、C-A、G-A 等堿基突變，且 66.7%為異質(zhì)性突變。9例患者中有4例[編號(hào)為甲狀腺乳頭狀癌標(biāo)本（Tc）21、Tc34、Tc38、Tc40]線粒體轉(zhuǎn)錄因子 l（mitochon－drial transcription factor l，mtTF1）結(jié)合區(qū)域發(fā)生了突變；另外 5 例（Tc1、Tc16、Tc51、Tc55、Tc62）患者均有突變位于兩個(gè)高變區(qū)：HVR-Ⅰ區(qū)（16024～16324）和 HVR-Ⅱ區(qū)（63～322）。見表 2、圖 2。

表2 9例甲狀腺乳頭狀癌患者mtDNA D環(huán)區(qū)點(diǎn)突變情況

圖2 測(cè)序結(jié)果堿基替換圖（Tc55t、Tc55a、Tc55b分別為甲狀腺乳頭狀癌55號(hào)癌組織、正常組織、血液的測(cè)序結(jié)果）

表3 甲狀腺乳頭狀癌患者mtDNA D環(huán)區(qū)mtMSI分析

2.4 甲狀腺乳頭狀癌患者mtDNA D環(huán)區(qū)mtMSI分析本研究中17例突變患者有8例發(fā)生。幾乎所有的mtMSI均發(fā)生在303-309區(qū)域插入1-2個(gè)C堿基，但有1例甲狀腺乳頭狀癌患者（Tc69）發(fā)生在mtTF1結(jié)合位點(diǎn)，插入1個(gè)（CA）重復(fù)序列，見表3。

3 討論

mtDNA序列在人類基因組中是高度可變的[4]，它在功能上重要的突變對(duì)于確定癌癥的發(fā)病機(jī)制和腫瘤進(jìn)展至關(guān)重要。線粒體DNA誘發(fā)突變的比率比核基因高10～20倍，可能因?yàn)槠淙狈_的DNA保護(hù)和修復(fù)系統(tǒng)，以及在氧化磷酸化過程對(duì)與活性氧（reactive oxygen species，ROS）的累積，所以極易受到致癌物的攻擊[5]。其中D環(huán)區(qū)是mtDNA的非編碼區(qū)，由于富含A、T堿基，而且是mtDNA與線粒體膜的結(jié)合位點(diǎn)，易受脂質(zhì)過氧化物的影響，故D環(huán)區(qū)為mtDNA突變的高發(fā)區(qū)，堿基替換率比mtDNA的其他區(qū)域高6～8倍[6]，尤其是HVR-Ⅰ和HVR-Ⅱ兩個(gè)高變區(qū)。因此，研究mtDNA D環(huán)區(qū)在腫瘤組織中的突變情況對(duì)研究腫瘤發(fā)生的機(jī)制具有重要意義。雖然，目前不能完全確定mtDNA D環(huán)區(qū)的突變與腫瘤的發(fā)生直接相關(guān)，但可以證實(shí)D環(huán)區(qū)具有高度的多態(tài)性。已有報(bào)道證實(shí)，在正常人群中非相關(guān)個(gè)體的mtDNA測(cè)序約有50個(gè)（0.3%）核苷酸互不相同，絕大部分分布于D環(huán)及非編碼區(qū)[7]。本研究中71例甲狀腺乳頭狀癌患者共發(fā)現(xiàn)167個(gè)種系性變異，人均變異數(shù)為2.35個(gè)。由于劍橋mtDNA序列數(shù)據(jù)庫中的信息來源于西方人群，因此mtDNA D環(huán)區(qū)的多態(tài)性及突變性有地域、國家和人種間的差異。某些已被發(fā)現(xiàn)的多態(tài)性位點(diǎn)可能與癌癥的遺傳易感性有關(guān)，但本文中未見報(bào)道的21個(gè)新多態(tài)性位點(diǎn)，由于出現(xiàn)頻率比較低，尚不能進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的關(guān)聯(lián)分析，尚待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量深入研究，以便尋找可能的中國人特異的遺傳易感性位點(diǎn)。

不同腫瘤中D環(huán)區(qū)的改變存在差異，Habano等[8]研究45例結(jié)腸癌患者癌組織和正常組織mtDNA突變時(shí)發(fā)現(xiàn)，44.4%（20/45）D環(huán)區(qū)存在CA不穩(wěn)定和多聚C（PolyC）不穩(wěn)定；Fliss等[9]分析了頭頸部腫瘤、肺癌和膀胱癌中 D環(huán)區(qū)突變率分別為23.1%（3/13）、38.5%（5/13）和28.6（4/14）。關(guān)于甲狀腺腫瘤mtDNA D環(huán)區(qū)突變率的報(bào)道也各不相同；Tong等[10]通過對(duì)72例不同類型的甲狀腺癌HVR-Ⅱ區(qū)序列進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在乳頭狀癌、濾泡癌、未分化癌和髓樣癌的突變率分別為2/35、1/9、1/9 和 1/18，總突變率僅為 5/72（6.9%）；Ding 等[11]檢測(cè)了101例甲狀腺腫瘤患者，包括結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、腺瘤和甲狀腺癌，發(fā)現(xiàn)mtDNA D環(huán)區(qū)突變?cè)诹銮安∽冎屑创嬖冢㈦S腫瘤的發(fā)生而增加；Maximo等[12]通過對(duì)mtDNA D環(huán)區(qū)部分重復(fù)序列研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺良、惡性腫瘤突變率分別高達(dá)50%（15/30）和47.6%（17/36），他們認(rèn)為這些突變反映了甲狀腺腫瘤mtDNA的不穩(wěn)定性。

本研究中，71例甲狀腺乳頭狀癌突變率為23.9%（17/71），突變位點(diǎn)涉及 HVR-Ⅰ、HVR-Ⅱ以及 mtTF1結(jié)合位點(diǎn)。與很多學(xué)者的觀點(diǎn)相同對(duì)于mtDNA來說，D環(huán)區(qū)的HVR-Ⅰ、HVR-Ⅱ這兩個(gè)高變區(qū)是突變熱點(diǎn)[13-14]。值得注意的是17例突變患者有5例位于mtTF1結(jié)合位點(diǎn)，占29.4%，其中1例是mtMSI。已知mtTFl是一個(gè)能與線粒體DNA重鏈及輕鏈啟動(dòng)子相結(jié)合的因子，對(duì)線粒體增殖和功能起著重要的調(diào)控作用，是決定線粒體數(shù)量和轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵分子，從而對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響[15]。

因此，可以推測(cè)mtTFl結(jié)合位點(diǎn)的突變可能與甲狀腺腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。mtMSI現(xiàn)象是指線粒體中簡(jiǎn)單重復(fù)序列的增加或丟失，有研究報(bào)道m(xù)tDNA D環(huán)區(qū)最常見的突變集中在nt303-309的PloyC結(jié)構(gòu)中1-3個(gè)堿基C的插入或缺失[16]。本研究中，47.1%（8/17）的突變存在nt303-309區(qū)域1-2個(gè)堿基C插入的改變，高于Tong等[10]只有6.9%的標(biāo)本出現(xiàn)在此區(qū)域，這可能是不同人種和地區(qū)的原因。nt303-309區(qū)域位于保守序列Ⅱ區(qū)，是mtDNA重鏈的復(fù)制起始點(diǎn)。由于D環(huán)區(qū)的單鏈啟動(dòng)復(fù)制機(jī)制，突變可能會(huì)使DNA基因部位出現(xiàn)發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)，增加了mtDNA多聚酶γ在C區(qū)的錯(cuò)配機(jī)會(huì)；同時(shí)，此區(qū)是線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，mtTFA)的結(jié)合位點(diǎn)，是高水平特異性轉(zhuǎn)錄起始所必須的，故而nt303-309區(qū)的突變可能會(huì)導(dǎo)致線粒體轉(zhuǎn)錄異常的發(fā)生[17]。

MtDNA為母系遺傳，可分為同質(zhì)性和異質(zhì)性。正常情況下，大多數(shù)健康個(gè)體不同的細(xì)胞或組織中的mtDNA為同一類型，即同質(zhì)性；但在許多疾病個(gè)體的細(xì)胞中，突變型mtDNA和野生型mtDNA共存，即異質(zhì)性。異質(zhì)細(xì)胞分裂時(shí)突變的mtDNA隨機(jī)分布到子細(xì)胞中，經(jīng)過多代的傳遞mtDNA表型向突變型mtDNA占優(yōu)勢(shì)的方向漂變，當(dāng)突變積累過多時(shí)，能量輸出降低到正常細(xì)胞、組織和器官功能最低需要量以下時(shí)出現(xiàn)疾病癥狀，并越來越嚴(yán)重就會(huì)影響生化和臨床表型，從輕度功能缺陷到重度線粒體完全解體[18]。在本研究中66.7%的突變?yōu)楫愘|(zhì)性突變，與Su等[19]研究結(jié)果相似。這些體細(xì)胞變異可能會(huì)給腫瘤細(xì)胞帶來再生優(yōu)勢(shì)，為腫瘤細(xì)胞的發(fā)展可能提供必要的遺傳多樣性，以滿足進(jìn)化適應(yīng)性和驅(qū)動(dòng)腫瘤進(jìn)展[20]。

綜上所述，甲狀腺腫瘤組織mtDNA D環(huán)區(qū)具有高度多態(tài)性和較高突變率，該區(qū)的基因突變可能與甲狀腺腫瘤的發(fā)生相關(guān)。線粒體功能紊亂是腫瘤發(fā)生的表現(xiàn)之一，可以通過抗氧化劑選擇性基因治療或改變mtDNA變異載量等方法用于臨床治療，這些將可能成為腫瘤診斷和治療的新方法。