HPLC法測(cè)定天山雪蓮提取物固體脂質(zhì)納米粒載藥量與包封率

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新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004

天山雪蓮為菊科植物天山雪蓮Saussureainvolucrata(Kar. et Kir.)Sch.-Bip. 的干燥地上部分，始見(jiàn)于藏藥文獻(xiàn)《月王藥珍》，清代《本草綱目拾遺》中也有記載，維吾爾名為“塔格依力斯”，系維吾爾醫(yī)習(xí)用藥材。天山雪蓮在醫(yī)藥應(yīng)用已有數(shù)百年的歷史，全草入藥，具有補(bǔ)腎活血，祛風(fēng)勝濕、強(qiáng)筋健骨，營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)，調(diào)節(jié)異常體液等作用，用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)疼痛、肺寒咳嗽等癥[1-3]。課題組前期研究已證實(shí)天山雪蓮提取物(Saussureae Involucratae Herba extract, SIHE)中主要活性成分為綠原酸和蘆丁[4-5]。但SIHE的脂溶性不高、口服吸收差，生物利用度低，從而影響藥物的臨床療效。針對(duì)SIHE的這些問(wèn)題，課題組開(kāi)展了許多新劑型如分散片、緩釋片、微乳、磷脂復(fù)合物等的研究[6-9]，旨在提高其生物利用度，但結(jié)果尚不盡人意。固體脂質(zhì)納米粒(Solid lipid nanoparticles, SLN)既具備聚合物納米粒物理穩(wěn)定性高、藥物泄露少的優(yōu)點(diǎn)，又兼具脂質(zhì)體、乳劑毒性低、能大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，是一種極具發(fā)展前景的新型給藥載體系統(tǒng)，日益受到各國(guó)研究研究者的重視[10-11]。SLN可增強(qiáng)與生物膜的粘附性，延長(zhǎng)胃腸道的粘附時(shí)間和滯留時(shí)間，有效地提高藥物生物利用度。采用固體脂質(zhì)納米粒技術(shù)研究天山雪蓮提取物新劑型，以期提高其溶解性、穩(wěn)定性和生物利用度[12]。

包封率和載藥量測(cè)定是制備固體脂質(zhì)納米粒過(guò)程中處方工藝篩選與質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)和處方前研究工作。因此，實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法同時(shí)測(cè)定天山雪蓮提取物固體脂質(zhì)納米粒中2種有效成分的方法，為該制劑的處方工藝研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 日本島津SPD-10AVP型高效液相色譜儀，AB135-S梅特勒-托利多電子天平(瑞士)，BS110S型Sartorius電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)，JA-2003B電子天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)，NS1001L Panda2K型高壓勻質(zhì)機(jī)(意大利Niro Soavi)，R-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，DZKW-S-A型電熱恒溫水浴鍋(北京永光明醫(yī)療儀器廠)，5415R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)，WP-UP-IV-10型Water Purifier實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，Millipore超濾離心管(Microcon YM-10，MWCO為10KDa，USA)。

1.2 樣品與試劑 蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：100080-201409)、綠原酸對(duì)照品(批號(hào)：110753-201415)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；單硬脂酸甘油酯(批號(hào)：F20151002，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)；卵磷脂(批號(hào)：F20160322，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；山崳酸甘油酯(批號(hào)：3545PPD，Compritol 888 ATO)；吐溫-80(批號(hào)：F20161110，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙腈(色譜純，F(xiàn)isher)；甲醇(批號(hào)：20161015，天津市福晨化學(xué)試劑廠)，天山雪蓮提取物固體脂質(zhì)納米粒(SIHE-SLN，自制，批號(hào)：20170315-1，20170315-2，20170315-3)。

2 方法與結(jié)果

2.1 天山雪蓮提取物固體脂質(zhì)納米粒的制備 采用高壓勻質(zhì)法(homogenization technique)制備天山雪蓮提取物固體脂質(zhì)納米粒。稱取處方量的山崳酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯、SIHE、在(80±2)℃水浴下溶于適量無(wú)水乙醇中，揮除溶劑，形成均勻的油相。取一定量的吐溫-80分散于水中，形成均勻的水相，將油相與水相攪拌混合均勻，加入高壓勻質(zhì)機(jī)中進(jìn)行兩次勻質(zhì)乳化(10000 r/min)，冰浴迅速冷卻，即得SIHE-SLN。

2.2 包封率及載藥量的HPLC測(cè)定方法研究

2.2.1 供試品溶液的制備 精密量取3.0 mLSIHE-SLN，置于10 mL量瓶中，加入甲醇于60℃水浴破壞10 min，用甲醇稀釋至刻度，過(guò)0.45 μm微孔濾膜，作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取綠原酸對(duì)照品和蘆丁對(duì)照品19.25 mg、25.74 mg置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得含綠原酸和蘆丁質(zhì)量濃度分別為192.5 μg/mL和257.4 μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.3 色譜條件 采用Shim-pack VP-ODS C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.4%磷酸(B)，梯度洗脫(0～15 min, A-B=13∶87; 16～40 min,A-B=15∶85)；雙波長(zhǎng)檢測(cè)：257 nm(檢測(cè)蘆丁)，327 nm(檢測(cè)綠原酸)；流速為1 mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.4 專屬性試驗(yàn) 精密量取空白固體脂質(zhì)納米粒及含藥固體脂質(zhì)納米粒各3 mL，置于10 mL量瓶中，加入甲醇于60℃水浴破壞10 min，用甲醇稀釋至刻度，離心，取上清液過(guò)濾。精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液2 mL至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度。按上述色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果見(jiàn)圖1。樣品色譜中與對(duì)照品色譜相同保留時(shí)間處有色譜峰，而陰性樣品無(wú)相應(yīng)峰，說(shuō)明樣品中其他成分對(duì)綠原酸和蘆丁這2個(gè)成分的測(cè)定無(wú)干擾，且2個(gè)成分與相鄰峰的分離度均大于1.5。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以對(duì)照品質(zhì)量濃度X(μg·mL-1)對(duì)其峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。見(jiàn)表1。

表1 回歸方程及線性范圍

2.2.6 穩(wěn)定性考察精密 量取3.0 mL SIHE-SLN，置于10 mL量瓶中，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法，制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h測(cè)定。結(jié)果表明綠原酸和蘆丁在24 h內(nèi)的RSD分別為1.24%、0.95%，說(shuō)明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 精密量取混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液0.5、1.0、4.0 mL分別置于10 mL量瓶中，定容至刻度。于1 d內(nèi)間隔相等時(shí)間分別測(cè)定5次計(jì)算日內(nèi)RSD(%)；連續(xù)測(cè)定3 d，進(jìn)行日間精密度測(cè)試，求日間精密度的RSD(%)。結(jié)果見(jiàn)表2。日內(nèi)、日間精密度RSD均小于2.0%，說(shuō)明日內(nèi)、日間精密度良好。

表2 日內(nèi)和日間精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取3.0 mL SIHE-SLN，置于10 mL量瓶中，共6份，按照“2.2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法平行制備6份供試品溶液，制備成供試品溶液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定并計(jì)算。結(jié)果綠原酸和蘆丁的含量平均值(n=6)分別為125 μg/mL和173 μg/mL；RSD分別為1.02%和1.14%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的SIHE-SLN 1.5 mL，置10 mL量瓶，共6份，分別精密加入“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL，依照供試品溶液制備方法同法操作，按上述色譜條件測(cè)定并計(jì)算回收率，結(jié)果綠原酸和蘆丁的平均回收率分別為(98.5±0.12)%和(99.4±0.21)%，RSD分別為1.06%和1.27%。

2.2.10 超濾法回收率試驗(yàn) 取適量處方比例的輔料與混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液混合，配置成高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度溶液，取200 μL置于超濾離心管中(MWCO為10kDa)，離心(12 000 r/min)15 min，吸取濾液，即得,進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 超濾法回收率試驗(yàn)測(cè)定結(jié)果 (n=5)

2.2.11 SIHE-SLN的載藥量與包封率測(cè)定 游離天山雪蓮提取物藥量(WF)測(cè)定：精密量取SIHE-SLN混懸液，置超濾離心管中(MWCO為10kDa)，離心(12 000 r/min)15 min，吸取濾液，進(jìn)行測(cè)定。

SIHE-SLN總藥量(WT)測(cè)定：精密量取SIHE-SLN混懸液3.0 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇適量，水浴加熱至溶液澄清，放冷至室溫，用甲醇稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。進(jìn)行測(cè)定。按公式：包封率=(WT-WF)/ WT×100%和載藥量=(WT-WF)/Ws×100%(WT為SIHE-SLN總藥量，WF為游離藥物量，Ws為載體材料的總量)，分別計(jì)算2種成分的包封率和載藥量。測(cè)定3批樣品，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 3批樣品包封率與載藥量的測(cè)定結(jié)果

3 討論

測(cè)定藥物包封率的方法主要有透析法、葡聚糖凝膠柱法、超濾法等。采用透析法雖簡(jiǎn)單，費(fèi)用低，但費(fèi)時(shí)。在室溫條件下，透析95%以上的游離藥物需要多次更換透析介質(zhì)，耗時(shí)24 h。采用葡聚糖凝膠柱法分離天山雪蓮提取物固體脂質(zhì)納米粒中的游離藥物，用蒸餾水作為洗脫劑時(shí)，對(duì)有效成分溶解能力較小，難以洗脫下來(lái)，造成游離藥物的回收率低，改用對(duì)有效成分溶解能力較大的乙醇水溶解洗脫時(shí)，雖然回收率高，但葡聚糖凝膠的結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，逐漸塌陷。超濾法是在離心力的作用下，利用篩分原理對(duì)大分子和小分子物質(zhì)進(jìn)行分離。由于操作準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便樣品不必進(jìn)行稀釋，不存在被包封藥物泄露的問(wèn)題，可有效分離游離藥物與固體脂質(zhì)納米粒。因此，更適合天山雪蓮提取物固體脂質(zhì)納米粒制備工藝優(yōu)化時(shí)包封率的測(cè)定。

試驗(yàn)表明該色譜方法準(zhǔn)確可靠、簡(jiǎn)單快速、可用于天山雪蓮提取物固體脂質(zhì)納米粒中不同成分的包封率和載藥量的同時(shí)測(cè)定，為處方工藝研究奠定了良好的基礎(chǔ)。