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無(wú)乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)是牛乳腺炎(Bovine mastitis)的主要致病菌之一，它不僅會(huì)對(duì)奶牛的產(chǎn)乳量造成影響，同時(shí)可通過(guò)“乳腺乳”的傳遞感染人類，是人獸共患病的典型的致病菌之一[1-4]。近年來(lái)由于生態(tài)保護(hù)政策的不斷提升，“禁牧”政策的嚴(yán)格實(shí)施，造成乳牛乳房炎的發(fā)病機(jī)率逐年增多。因此，奶牛乳腺炎的有效防控就顯得極為重要[5-8]。但是目前全球尚無(wú)有效防治牛乳房炎的疫苗上市，傳統(tǒng)的疫苗都存在免疫保護(hù)不佳，散毒，潛伏感染等現(xiàn)象[9]。因此，尋找和探索一種安全，有效，多價(jià)的非全菌體型基因工程亞單位疫苗是解決奶牛乳腺炎防控難的全球性的科學(xué)解決途徑[14-15]。 無(wú)乳鏈球菌中致病的因子有很多，除了莢膜，溶血素，鏈道酶素，鏈激酶以外，更為重要的是其具有的粘附功能，致病因子是其表向的菌毛，其菌毛有PI-1及PI-2(又稱PI-2a，PI-2b)[16-18]。有研究顯示，粘膜免疫可以阻止細(xì)菌有效定植目標(biāo)細(xì)胞。因此，無(wú)乳鏈球菌的菌毛結(jié)構(gòu)成為了眾多學(xué)者關(guān)注和研究的熱點(diǎn)[19]。我們針對(duì)無(wú)乳鏈球菌中具有致病性的PI-2a菌毛島嶼的三個(gè)亞基基因AP1、AP2、BP進(jìn)行探究，將與GBS黏附有關(guān)的AP1基因、具有菌毛錨定的AP2基因和菌毛骨架蛋白BP基因進(jìn)行三基因串聯(lián)，建立表達(dá)的載體，從而獲得多表位融合的蛋白，通過(guò)動(dòng)物的免疫實(shí)驗(yàn)，獲得血清，并將血清純化，并制備多亞單位抗體[20-21]。為后期研制新型基因工程免疫疫苗及快速檢測(cè)試劑提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，同時(shí)也為進(jìn)一步研究牛乳房炎致病菌無(wú)乳鏈球菌的致病機(jī)理提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1重組質(zhì)粒構(gòu)建 AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組原核BL21工程菌由內(nèi)蒙古乳源性致病菌防控工程技術(shù)研究中心構(gòu)建。

1.2主要試劑 在該實(shí)驗(yàn)中利用的主要試劑為NaCl、瓊脂、NaOH顆粒、卡那霉素、IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、KCl、NaHPO4、甘油、KH2PO4、考馬斯亮藍(lán)R-250、Tris、濃HCl、SDS、過(guò)硫酸銨、Acrylamide、BIS、酵母浸粉、Glycine、胰蛋白胨、BPB、異丙醇、醋酸等，均購(gòu)自哈爾濱博仕生物科技有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3只家兔，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供。

1.4AP1-AP2-BP克隆基因的表達(dá)及樣品處理 將AP1-AP2-BP三聯(lián)基因重組工程菌(pET-30(a+)-AP1-AP2-BP/BL21)用終濃度為1.0 mmol/L的IPTG進(jìn)行30 ℃恒溫誘導(dǎo)表達(dá)8～9 h。將誘導(dǎo)完成的培養(yǎng)液分裝、離心，并將獲得的沉淀用PBS緩沖液以1∶10的比例懸浮，再對(duì)其超聲破碎20 min左右，將破碎完全的菌液4 ℃離心20 min，取上清并用孔徑為0.45 μm的濾膜過(guò)濾。

1.5AP1-AP2-BP蛋白粗提取及純化 選用15%～50%的硫酸銨顆粒對(duì)已獲得的樣品進(jìn)行粗提取，優(yōu)化確定其最佳質(zhì)量濃度，并將其4 ℃離心，將獲得的蛋白質(zhì)沉淀用含有20 mmol/L咪唑的PBS緩沖液進(jìn)行懸浮，并將混合液放入透析袋中處理24 h。利用親和層析的方法對(duì)獲得樣品進(jìn)行純化，蛋白層析柱的填料選用Ni NTA Beads 6FF，恒流泵的流速保持在4.5，將樣品過(guò)柱處理。將獲得的純化蛋白AP1-AP2-BP進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳及Protein A280測(cè)量。

1.6家兔抗AP1-AP2-BP融合抗原的亞單位抗體制備 將飼養(yǎng)的3只家兔進(jìn)行分組，其中2只家兔為實(shí)驗(yàn)組，另1只為對(duì)照組。用鋁膠水溶性佐劑與純化后的AP1-AP2-BP蛋白以1∶5的比例混合，采用腹部皮下肌肉多點(diǎn)注射的方式進(jìn)行免疫，每只家兔免疫抗原含量為0.5 mg/mL，免疫劑量為500 μL/只。每次免疫前采集家兔耳靜脈血液約10 mL，每隔7 d進(jìn)行1次免疫，共免疫4次，從第3次免疫開(kāi)始，免疫劑量調(diào)整為1.0 mL/只。

1.7間接-ELISA檢測(cè)亞單位抗體滴度 根據(jù)檢測(cè)需求將包被抗原AP1-AP2-BP、待測(cè)血清、羊抗兔IgG HRP標(biāo)記抗體進(jìn)行倍比稀釋，根據(jù)檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作，并通過(guò)全自動(dòng)酶標(biāo)檢測(cè)儀讀取檢測(cè)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.8AP1-AP2-BP亞單位抗體的純化 根據(jù)天地人和抗體的親和層析柱說(shuō)明書配置純化Buffer，并用層析柱對(duì)血清IgG進(jìn)行純化，將純化獲得的IgG進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳及Protein A280檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果 將AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)后，對(duì)其SDS-PAGE凝膠電泳，通過(guò)實(shí)驗(yàn)圖片的條帶對(duì)比可以確定AP1-AP2-BP蛋白的分子量大小約為65 kDa，該結(jié)果與預(yù)測(cè)分子質(zhì)量大小相符，條帶清晰，見(jiàn)圖1。

1: IPTG誘導(dǎo)前的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌; 2: IPTG誘導(dǎo)前的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎沉淀; 3: 低分子質(zhì)量蛋白Marker(116～18 kDa); 4: IPTG誘導(dǎo)前的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎上清; 5: IPTG誘導(dǎo)后的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌; 6: IPTG誘導(dǎo)后的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎上清; 7: IPTG誘導(dǎo)后的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎沉淀

2.2IPTG誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化結(jié)果 通過(guò)5組(0.4 mmo1/L，0.6 mmo1/L，0.8 mmo1/L，1.0 mmo1/L，1.2 mmo1/L)不同IPTG終濃度對(duì)菌液進(jìn)行相同條件的8 h培養(yǎng)，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳鑒定后可知，伴隨著IPTG終濃度的不斷提高，其蛋白的表達(dá)量有所增強(qiáng)，但持續(xù)升高IPTG終濃度并沒(méi)有顯著變化，因此，確定IPTG誘導(dǎo)劑終濃度為1.0 mmo1/L，見(jiàn)圖2。

1：低分子量蛋白Marker；2：IPTG誘導(dǎo)前的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎上清；3-7：分別為0.4～1.2 mmo1/L 5個(gè)濃度梯度的IPTG誘導(dǎo)后的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎上清

2.3誘導(dǎo)溫度優(yōu)化結(jié)果 用最佳的IPTG濃度，分別在27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃條件下對(duì)AP1-AP2-BP菌液誘導(dǎo)8 h，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的升高，其蛋白的表達(dá)量也有所提升，而且在30 ℃的時(shí)候，蛋白表達(dá)量有顯著提高。但再繼續(xù)升溫，蛋白表的達(dá)量無(wú)明顯變化，可判定30 ℃是最佳的誘導(dǎo)溫度，見(jiàn)圖3。

1：低分子量蛋白Marker；2：IPTG誘導(dǎo)前的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎上清；3-7：在27 ℃、30 ℃、33 ℃、36 ℃、39 ℃誘導(dǎo)的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎上清

2.4抗原蛋白鹽析處理硫酸銨質(zhì)量濃度優(yōu)化結(jié)果

通過(guò)對(duì)硫酸銨的質(zhì)量濃度設(shè)置，將上清液分為8組進(jìn)行AP1-AP2-BP蛋白的粗提取，經(jīng)SDS-PAGE電泳可知，在硫酸銨的濃度為20%時(shí)，AP1-AP2-BP蛋白的粗提取最理想，該濃度下其雜帶最少，見(jiàn)圖4。

1：IPTG誘導(dǎo)后三基因串聯(lián)重組工程菌；2：IPTG誘導(dǎo)后的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎上清；3-5：15%～25%硫酸銨粗提AP1-AP2-BP重組蛋白；6:低分子量蛋白Marker；7-11:30%～50%硫酸銨粗提AP1-AP2-BP重組蛋白

2.5AP1-AP2-BP重組蛋白懸浮緩沖液的優(yōu)化結(jié)果 通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用含20 mmol/L咪唑的PBS溶液做懸浮液處理后的回收率比利用pH值為8.5的Tris-Cl溶液處理后的回收率更高，其效果更為理想，見(jiàn)圖5。

1：低分子量蛋白Marker；2：IPTG誘導(dǎo)后的AP1-AP2-BP三基因串聯(lián)重組工程菌破碎上清；3：含有20 mmol/L咪唑的PBS緩沖液的懸浮液；4：pH值為8.5的Tris-Cl緩沖液的懸浮液

2.6AP1-AP2-BP重組蛋白最優(yōu)純化結(jié)果 通過(guò)對(duì)AP1-AP2-BP蛋白純化過(guò)程的優(yōu)化與改良，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，純化的AP1-AP2-BP蛋白質(zhì)量濃度達(dá)到4.353 mg/mL，與優(yōu)化前直接純化相比回收率提高了81%，見(jiàn)圖6。

1：低分子量蛋白Marker；2：洗滌液洗滌；3-6：洗脫液洗脫

2.7血清中抗體的滴度測(cè)定結(jié)果 對(duì)家兔血清中抗體的滴度進(jìn)行了ELISA測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示，家兔血清在免疫后抗體的水平逐漸上升，且從第3周開(kāi)始抗體的水平明顯提升，在第4周時(shí)抗體滴度達(dá)1∶5 600，該結(jié)果表明家兔經(jīng)過(guò)免疫所產(chǎn)生的抗體具有很高的滴度水平，見(jiàn)圖7。

圖7 抗體滴度的檢測(cè)Fig.7 Detection of antibody titer

2.8抗體的制備 通過(guò)親和層析的方法對(duì)血清進(jìn)行純化，純化得到的IgG的濃度非常理想，通過(guò)Protein A280的測(cè)量，IgG的最高濃度為9.102 mg/mL，表明抗體含量達(dá)到要求，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期，見(jiàn)圖8。

1-4：洗脫液洗脫；5-6：洗滌液洗滌；7：純化的AP1-AP2-BP蛋白；8：低分子量蛋白Marker

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)用層析的方法對(duì)AP1-AP2-BP重組的蛋白進(jìn)行了多次相同條件的純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳可知，在初步純化過(guò)程中在分子量約為33 kDa處出現(xiàn)了明顯雜帶，效果不是很理想。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)重組蛋白的純化過(guò)程進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化處理，首先采用硫酸銨沉淀法對(duì)重組蛋白進(jìn)行了粗提取，其次為提高蛋白回收率對(duì)粗提蛋白懸浮液的選擇進(jìn)行了比對(duì)實(shí)驗(yàn)，最后再對(duì)回收蛋白進(jìn)行親和層析純化，并將獲得的純化蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳處理，且通過(guò)Protein A280比對(duì)了重組蛋白的回收率。

實(shí)驗(yàn)優(yōu)化前測(cè)得AP1-AP2-BP純化蛋白濃度最高為2.396 mg/mL，濃度最低為1.370 mg/mL。實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后測(cè)得AP1-AP2-BP純化蛋白濃度最高為4.353 mg/mL，最低為3.032 mg/mL。且通過(guò)SDS-PAGE凝膠電泳圖對(duì)比分析，不難發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的SDS-PAGE凝膠電泳圖中分子量約為33 kDa處的雜帶明顯減少，而且Protein A280測(cè)得的重組蛋白的純化程度也有顯著提升。

本實(shí)驗(yàn)首次制備兔源牛乳腺炎致病性無(wú)乳鏈球菌PI-2a菌毛島嶼AP1-AP2-BP重組蛋白抗原的亞單位抗體，為下一步制備快速檢測(cè)牛乳中致病性無(wú)乳鏈球菌奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。