下呼吸道感染病原體檢測(cè)方法研究進(jìn)展

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下呼吸道感染(lower respiratory tract infection, LRTI)是常見(jiàn)感染性疾患[1],主要包括慢性支氣管炎、肺炎、支氣管擴(kuò)張等。臨床上LRTI診斷以患者出現(xiàn)咳嗽、咳痰、痰液粘稠，肺部出現(xiàn)濕羅音并伴有發(fā)熱或白細(xì)胞總數(shù)和嗜中性粒細(xì)胞比例增高或X線顯示肺部有炎性浸潤(rùn)性病變?yōu)橐罁?jù)；或以慢性氣道疾患患者穩(wěn)定期繼發(fā)急性感染，并有病原學(xué)改變或X線胸片顯示與入院時(shí)比較有明顯改變或新病變?yōu)橐罁?jù)[2]。LRTI以抗生素治療為主，但治療前必須確定所引起下呼吸道感染的病原體，因此，LRTI病原體快速檢測(cè)十分重要。標(biāo)本類(lèi)型及標(biāo)本質(zhì)量是檢測(cè)的基礎(chǔ)和根本保障，高質(zhì)量的標(biāo)本在快速檢測(cè)中起到重要作用。病原體的檢測(cè)技術(shù)迅速發(fā)展在臨床LRTI的診斷和治療起著重要支撐。目前國(guó)內(nèi)少有對(duì)呼吸道病原體檢測(cè)技術(shù)的綜述報(bào)導(dǎo)。本文將下呼吸道感染標(biāo)本類(lèi)型和病原體檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，旨在指導(dǎo)臨床根據(jù)疾病采集相應(yīng)的樣本類(lèi)型，選擇適宜的檢測(cè)方法，快速確定感染病原體并及時(shí)治療。

1 下呼吸道感染常規(guī)檢測(cè)標(biāo)本種類(lèi)

下呼吸道感染常見(jiàn)標(biāo)本類(lèi)型有痰液、肺泡灌洗液、纖支鏡防污染毛刷、外周血、漿膜腔積液。痰液是氣管、支氣管和肺泡所產(chǎn)分泌物，呼吸道病變時(shí)痰液分泌增多。收集的痰液必須是從肺部咳出且必須新鮮[3]。痰樣本采集易受呼吸道正常定植菌群的影響，一般可通過(guò)定量或半定量檢測(cè)或涂片檢測(cè)來(lái)評(píng)價(jià)其致病性，若白細(xì)胞吞噬作用和白細(xì)胞聚集部位相應(yīng)細(xì)菌的存在或定量培養(yǎng)分離的細(xì)菌濃度≥106cfu/mL，一般可認(rèn)為是致病因子[4]。痰液中病原體最主要的檢測(cè)方法是分離培養(yǎng)法和涂片鏡檢法。肺泡灌洗液可收集到肺部較大范圍病原體樣本，取樣時(shí)應(yīng)保證一定的回收量，而且避免將血液和上皮細(xì)胞帶入樣本[5]。分離細(xì)菌濃度≥104cfu/mL時(shí)則可認(rèn)為是此病原體引起的感染。肺泡灌洗液中病原體的檢測(cè)方法主要有分離培養(yǎng)、涂片鏡檢法、多重PCR等。防污染毛刷可深入肺炎病變部位定向采集樣本[6]，分離細(xì)菌濃度≥103cfu/mL時(shí)則可認(rèn)為是此病原體引起的感染，常用的檢測(cè)方法包括分離培養(yǎng)、熒光定量PCR等。較嚴(yán)重患者的下呼吸道病原體會(huì)蔓延至外周血中，外周血樣本應(yīng)避免劇烈震蕩，通常通過(guò)分離培養(yǎng)以及檢測(cè)病原體的IgM抗體來(lái)確定患者被哪種病原體所感染。常用的IgM檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附法、免疫熒光法、膠體金免疫層析法、熒光免疫層析法、電化學(xué)發(fā)光免疫分析等。漿膜腔積液主要包括胸水、腹水、心包積液，是嚴(yán)重病癥的典型臨床表現(xiàn)。常用的檢測(cè)技術(shù)有分離培養(yǎng)、涂片鏡檢、熒光定量PCR法等。臨床上，痰液最易采集，因而是最主要的標(biāo)本類(lèi)型，但是痰液采集質(zhì)量不易控制，易受正常定植菌群的影響。而肺泡灌洗液和纖支鏡防污染毛刷的樣本類(lèi)型能避免上呼吸道正常菌群的影響，樣本質(zhì)量更高，陽(yáng)性率和合格率更高[7]。

2 下呼吸道感染常見(jiàn)及非常見(jiàn)病原體

下呼吸道感染病原體包括細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體、病毒、寄生蟲(chóng)等。常見(jiàn)細(xì)菌類(lèi)病原體主要有流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌、百日咳桿菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉桿菌、腦膜炎奈瑟菌、溶血葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、陰溝腸桿菌等[8-9]。真菌類(lèi)主要有白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔假絲酵母菌、隱球菌、組織胞漿菌、煙曲霉等[10-11]。病毒類(lèi)主要有腺病毒、呼吸合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、人類(lèi)冠狀病毒、偏肺病毒、鼻病毒、腸病毒等[12-13]。寄生蟲(chóng)主要有毛滴蟲(chóng)、肺吸蟲(chóng)卵、蛔蟲(chóng)蝴、鉤蟲(chóng)蝴及卡氏肺囊蟲(chóng)等。其他類(lèi)還有肺炎支原體、肺炎衣原體、沙眼衣原體等[14]。不常見(jiàn)的下呼吸道感染病原體主要有：人類(lèi)蒼白桿菌、鸚鵡熱衣原體、單增李斯特菌、頭孢霉菌、超鞭毛蟲(chóng)、蠊纓滴蟲(chóng)等等[15-19]。

3 病原體的檢測(cè)方法

3.1 基于病原學(xué)的檢測(cè)方法

3.1.1病原體分離培養(yǎng)法 病原體分離培養(yǎng)法是確定下呼吸道感染病原體的“金標(biāo)準(zhǔn)”，是臨床檢驗(yàn)科進(jìn)行呼吸道分泌物檢測(cè)的常規(guī)方法，也是目前我國(guó)在病原體感染狀況調(diào)查研究方面的重要檢測(cè)方法之一[20]。

3.1.2涂片鏡檢法 涂片鏡檢法是病原學(xué)診斷的經(jīng)典方法，檢測(cè)最為迅速，但特異性較差，要求實(shí)驗(yàn)人員有豐富的經(jīng)驗(yàn)。臨床上將分離培養(yǎng)法和涂片鏡檢法相結(jié)合，提高診斷正確性，降低假陰性、假陽(yáng)性[21]。

3.2 基于分子生物學(xué)的檢測(cè)方法

3.2.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)是體外快速擴(kuò)增特定基因或DNA序列最常用的方法，也是其他分子生物學(xué)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)。DNA模板經(jīng)高溫變性后雙鏈打開(kāi)，低溫復(fù)性時(shí)引物與模板結(jié)合，72 ℃下子鏈延伸，DNA聚合酶聚合游離的脫氧核苷酸。變性、復(fù)性、延伸三步多次循環(huán)擴(kuò)增，富集目的基因。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后排除污染因素后結(jié)果為陽(yáng)性，即確診該病原體的感染[22]。常規(guī)PCR檢測(cè)方法僅用于定性實(shí)驗(yàn)，在定量研究中具有一定的局限性，但它快速、靈敏、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)與其他技術(shù)的結(jié)合對(duì)病原體的檢測(cè)更為有效。

表1 下呼吸道感染檢測(cè)常用標(biāo)本類(lèi)型 Tab.1 Specimen types detection for lower respiratory tract infection

3.2.2基質(zhì)輔助激光解吸電離源聯(lián)用飛行時(shí)間質(zhì)譜 基質(zhì)輔助激光解吸電離源(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)與飛行時(shí)間質(zhì)譜(time of flight mass spectrometry，TOF MS)聯(lián)用已經(jīng)成為生命科學(xué)研究中非常重要的工具。用一定強(qiáng)度的激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質(zhì)樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場(chǎng)的作用下加速飛過(guò)飛行管道，由于離子飛行距離一定,不同質(zhì)荷比的離子通過(guò)飛行管到達(dá)檢測(cè)器的時(shí)間不同，從而達(dá)到檢測(cè)目的。Atqah AbdulWahab等用MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)123株下呼吸道分泌物分離菌進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示對(duì)于常見(jiàn)的下呼吸道病原體如流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌等，都有很好的鑒定性，但其對(duì)罕見(jiàn)的革蘭氏陰性菌的鑒定可能存在一定限制[23]。Atalay A等也用此技術(shù)對(duì)下呼吸道樣本和其他樣本中的曲霉菌株進(jìn)行了檢測(cè)，其中煙曲霉、黃曲霉黑曲霉和土曲霉的檢出率分別為50%、33.3%、12.5%和4.2%，與常規(guī)形態(tài)學(xué)檢測(cè)有良好的一致性[24]。

3.3 基于免疫學(xué)的檢測(cè)方法

3.3.1酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng) 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)采用抗原與抗體的特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接，通過(guò)酶與底物產(chǎn)生的顏色反應(yīng)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)?，F(xiàn)已有多種商業(yè)化酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)試劑盒，可檢測(cè)包括流感病毒、肺炎衣原體、肺炎支原體等多種常見(jiàn)下呼吸道病原體[25]。此方法檢測(cè)快、可同時(shí)檢測(cè)大量樣本，對(duì)設(shè)備要求不高、操作簡(jiǎn)便，但操作規(guī)范性強(qiáng)，每一步操作不謹(jǐn)慎都有可能造成各種檢測(cè)問(wèn)題，假陽(yáng)性較多[26]。近年來(lái)，酶聯(lián)免疫吸附分析雙抗夾心檢測(cè)法開(kāi)始應(yīng)用于下呼吸道感染病原體的檢測(cè)，其具有檢測(cè)時(shí)間短、特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)[27]。

3.3.2凝集法 凝集法是臨床診斷、實(shí)驗(yàn)室研究和細(xì)菌學(xué)鑒定的重要手段之一。用已知細(xì)菌抗血清檢測(cè)待檢細(xì)菌，或用已知病原菌檢測(cè)患者血清中的相應(yīng)抗體。此法快速、簡(jiǎn)便、不受環(huán)境和實(shí)驗(yàn)條件的約束，在實(shí)驗(yàn)室和臨床上廣泛使用。

3.3.3直接免疫熒光法 直接免疫熒光法是直接用熒光標(biāo)記抗體來(lái)檢測(cè)特異性抗原的方法。此方法速度快、特異性強(qiáng)，但其敏感性不高，可能產(chǎn)生交叉反應(yīng)而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，在臨床診斷方面的應(yīng)用有一定局限性[22,28]。

3.3.4間接免疫熒光法 間接免疫熒光法是將樣本中的特異性抗體與包被在固相上的抗原結(jié)合，已結(jié)合的抗體再與熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合，在熒光顯微鏡下即可觀察結(jié)果?，F(xiàn)已有多種商業(yè)化間接免疫熒光法檢測(cè)多種下呼吸道感染病原體試劑盒，為病原體的檢測(cè)和診斷提供了很大方便。西班牙VIRCELL公司生產(chǎn)的呼吸道聯(lián)合檢測(cè)試劑盒可檢測(cè)包括嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎衣原體等9種常見(jiàn)呼吸道病原體。莫偉平等利用此技術(shù)對(duì)13240例呼吸道感染患者血清進(jìn)行檢測(cè)和分析，結(jié)果顯示呼吸道感染的病原體主要為肺炎衣原體和病毒，也證實(shí)了采用間接免疫熒光法檢測(cè)呼吸道病原體的IgM 抗體可作為臨床的診斷和治療的重要依據(jù)[29]。

4 多病原體同時(shí)檢測(cè)方法

傳統(tǒng)方法每次僅能檢測(cè)一種病原體，但大多數(shù)下呼吸道感染患者為多種病原微生物共同感染，這些病原體所引起的病癥相近，僅靠常規(guī)檢測(cè)難以鑒別診斷。檢測(cè)多種病原微生物的技術(shù)和方法的建立不僅可以成功解決上述難題，在實(shí)驗(yàn)室和臨床樣本的篩選與分離的過(guò)程中也起著十分重要的作用。

4.1多重PCR 多重PCR是在一次PCR反應(yīng)中實(shí)現(xiàn)對(duì)多種DNA模板檢測(cè)和定量的方法。這種方法把多種病原體檢測(cè)集中到一個(gè)封閉體系中反應(yīng)，多反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，根據(jù)不同引物和探針對(duì)各種病原體進(jìn)行定性和定量，既節(jié)約了成本又節(jié)省了時(shí)間，而且靈敏度高，大大提高病原體的檢出率。實(shí)際應(yīng)用中以逆轉(zhuǎn)錄PCR和熒光定量PCR最廣泛。多重逆轉(zhuǎn)錄PCR常用于同時(shí)檢測(cè)多種流感病毒等RNA病毒，此法具有較好的特異性和敏感性。Zhao MC等使用商業(yè)化試劑盒同時(shí)檢測(cè)572份呼吸道樣本中的11種常見(jiàn)呼吸道病毒、以及肺炎支原體和肺炎衣原體，87.5%的樣本中至少有一種病原體的檢出，具有高靈敏度和特異性[30]。多重?zé)晒舛縋CR的應(yīng)用幾乎涵蓋了所有下呼吸道病原微生物的檢測(cè)，N. J. Gadsby等建立了利用多重?zé)晒舛縋CR同時(shí)檢測(cè)并準(zhǔn)確定量包括肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等在內(nèi)的8種常見(jiàn)下呼吸道病原微生物的方法，對(duì)249株陽(yáng)性對(duì)照樣本的準(zhǔn)確定量證實(shí)了此方法的有效檢測(cè)[31]。

4.2多重PCR聯(lián)用毛細(xì)管凝膠電泳 毛細(xì)管凝膠電泳具有電泳和色譜的功能，能夠高效分離病原體，與多重PCR的聯(lián)用使得檢測(cè)效率更快、靈敏度和特異性更高。Stevenson JB等用此技術(shù)建立同時(shí)檢測(cè)流感病毒A、流感病毒B和呼吸合胞病毒的方法，對(duì)30個(gè)陽(yáng)性樣本的檢出率達(dá)93%，另外兩個(gè)樣本因樣本量過(guò)少而未能檢出，此方法的建立和有效檢測(cè)豐富了多病原體同時(shí)檢測(cè)的方法[32]。巢式多重PCR是在普通多重PCR的基礎(chǔ)上再進(jìn)行一次或兩次PCR反應(yīng)，前一次的擴(kuò)增反應(yīng)中出現(xiàn)非特異性片段，則下一次的擴(kuò)增中引物將不能與此片段進(jìn)行匹配結(jié)合，因此它比多重PCR有更好的敏感性和特異性。蔣璐晰等利用巢式多重PCR聯(lián)用毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)建立了同時(shí)檢測(cè)13種下呼吸道病原微生物的方法，對(duì)152個(gè)臨床樣本的檢測(cè)表現(xiàn)出100%的敏感性，在呼吸道病原體分子流行病學(xué)調(diào)查中具有很大潛力[33]。

4.3DNA微陣列 DNA微陣列就是將樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增和標(biāo)記，再與含有大量不同DNA分子的DNA芯片進(jìn)行雜交反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)相應(yīng)位置雜交探針，實(shí)現(xiàn)基因信息的快速檢測(cè)，具有微型化、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，以及在同一芯片上同時(shí)大信息量平行檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。Gemma A. Cannon等用此技術(shù)建立了同時(shí)檢測(cè)16種病毒和兩種非典型細(xì)菌的呼吸道病原體的方法，其在急性呼吸道病原體鑒定上對(duì)多重逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)具有一定替代性[34]。Keyvani H等應(yīng)用DNA陣列技術(shù)檢測(cè)40個(gè)呼吸道樣本中的呼吸合胞病毒、副流感病毒、鼻病毒、冠狀病毒和流感病毒，檢出率分別為2.5%、7.5%、10%、2.5%、0%，證實(shí)此技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)多種呼吸道病毒[35]。

4.4微球體懸浮芯片技術(shù) 微球體懸浮芯片技術(shù)又稱(chēng)為液相芯片技術(shù)，是一種芯片技術(shù)與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)。微球體懸浮芯片是微球體單元集合。微球體單元標(biāo)記特異探針和特異熒光，待測(cè)樣本標(biāo)記另一種熒光，檢測(cè)時(shí)，樣本中的目標(biāo)分子與探針結(jié)合。流式細(xì)胞儀通過(guò)微球體上的熒光來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的檢測(cè)。目前已有多種商業(yè)化試劑盒。Joan-Miquel等將常用的 ResPlex II Panel v2.0 (Qiagen), MultiCode-PLx (EraGen Biosciences), and xTAG (Luminex) 3種試劑盒進(jìn)行了比較，結(jié)果提示ResPlex II可檢測(cè)更多病原體，MultiCode-PLx相較之下更為方便，xTAG的靈敏度較高。這些檢測(cè)方法共同的不足之處是它們都是開(kāi)放性平臺(tái)，易于產(chǎn)生污染，靈敏度還有待于進(jìn)一步提高[36]。Sefers SE等建立了同時(shí)檢測(cè)包括呼吸道合胞病毒、人類(lèi)偏肺病毒、鼻病毒等12種常見(jiàn)呼吸道病毒的多重PCR聯(lián)用懸浮陣列方法，此方法具有快速、高通量的特點(diǎn)[37]。

4.5依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)和重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù) 依賴(lài)核酸序列的擴(kuò)增技術(shù)(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)是一種簡(jiǎn)單快速的擴(kuò)增核酸的方法，常用于擴(kuò)增RNA，擴(kuò)增過(guò)程中不需要熱循環(huán)儀，在恒定反應(yīng)溫度下即可準(zhǔn)確擴(kuò)增目的RNA，1～2 h的孵育，可以使模板擴(kuò)增109倍[38]。NASBA的反應(yīng)過(guò)程中，靶RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶催化形成RNA-DNA雜交體，在RNA酶作用下雜交體中的RNA被降解，單鏈DNA作為模板合成雙鏈DNA，后者被T7RNA聚合酶不斷轉(zhuǎn)錄出靶RNA，由此進(jìn)入新一輪擴(kuò)增循環(huán)，不斷形成靶核酸。擴(kuò)增產(chǎn)物需基于發(fā)光的檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，其中，酶聯(lián)寡核苷酸捕獲光學(xué)檢測(cè)方法(enzyme-linked oligonucleotide capture，EOC)要比電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)有著更好的靈敏度和特異性[39]。Lok Ting Lau等用NASBA-EOC方法建立了同時(shí)檢測(cè)甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒等9種常見(jiàn)呼吸道感染病毒，檢測(cè)線在10-8～10-11之間，相對(duì)于PCR檢測(cè)技術(shù)來(lái)說(shuō)用時(shí)更少、通量更高[40]。與NASBA相似，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification，RPA)在恒溫下即可進(jìn)行反應(yīng)，不需要熱循環(huán)儀。RPA 反應(yīng)中，重組酶與上下游引物結(jié)合，與同源雙鏈 DNA進(jìn)行鏈交換，單鏈綁定蛋白與親本鏈綁定，阻止其與脫離的模板鏈發(fā)生相互作用，然后DNA 聚合酶從上下游引物的 3′端啟動(dòng)模板合成，形成兩條雙鏈 DNA，如此循環(huán)重復(fù)進(jìn)行擴(kuò)增[41]。RPA 方法操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，無(wú)需昂貴的設(shè)備及相關(guān)的專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，在檢測(cè)的靈敏性和特異性上與熒光定量 PCR 相當(dāng)。在呼吸道疾病病原體檢測(cè)的應(yīng)用上已有少量單種病原體的檢測(cè)[42]，但鮮有同時(shí)測(cè)定多種下呼吸道病原體方法建立的報(bào)導(dǎo)。

4.6雙光子熒光激發(fā)mariPOC○RMariPOC○R是一種用于檢測(cè)呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A、B型、副流感病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型、人類(lèi)偏肺病毒及肺炎鏈球菌病原體的抗原檢測(cè)試劑盒。檢測(cè)過(guò)程中，病原體在聚苯乙烯微粒上形成單克隆抗體-抗原-標(biāo)記的單克隆抗體的免疫復(fù)合物，采用免疫熒光檢測(cè)儀檢測(cè)其熒光信號(hào)。M. Gunell等用mariPOC○R技術(shù)檢測(cè)了共224 585個(gè)樣品，6 897個(gè)樣本檢出陽(yáng)性，并提出此技術(shù)可用于臨床診斷[43]。鄭琦等利用此技術(shù)檢測(cè)人類(lèi)偏肺病毒、腺病毒、肺炎鏈球菌等8種病原體，335例臨床標(biāo)本中的7種呼吸道病毒經(jīng)mariPOC○R法、DFA 鏡檢法檢測(cè)，總陽(yáng)性率分別為38.21%和37.31%，一致率為98.4%，表現(xiàn)出比直接免疫熒光法更高的陽(yáng)性率及快速、智能的特點(diǎn)[44]。

4.716S-Meta分析和宏基因組技術(shù) 16S-Meta分析和宏基因技術(shù)不依賴(lài)于病原體的分離和純化，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物進(jìn)行快速、微量、準(zhǔn)確簡(jiǎn)便地分類(lèi)鑒定和檢測(cè)，在臨床和實(shí)驗(yàn)室病原體檢測(cè)中具有巨大的應(yīng)用潛力[45]。16S-meta分析僅限于對(duì)細(xì)菌的檢測(cè)，是將樣本總DNA提取后擴(kuò)增細(xì)菌16S區(qū)域，測(cè)序完成后可分析樣本中病原體的組成、多樣性及進(jìn)化關(guān)系。測(cè)序技術(shù)運(yùn)用第2代和第3代測(cè)序技術(shù)，其中第2代測(cè)序技術(shù)主要包括Illumina公司的Solexa測(cè)序技術(shù)、羅氏公司的454測(cè)序技術(shù)和ABI公司的SOLiD測(cè)序技術(shù)，以檢測(cè)細(xì)菌16S區(qū)域的某個(gè)或某幾個(gè)高變區(qū)來(lái)進(jìn)行鑒定，具有高通量、低成本的特點(diǎn)。由于測(cè)序讀長(zhǎng)較短，2代測(cè)序的方法一般僅能鑒定到屬水平。Kehrmann J等用Illumina平臺(tái)的第2代測(cè)序技術(shù)對(duì)肺囊蟲(chóng)病患者和未患肺囊蟲(chóng)病患者肺泡灌洗液進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)二者屬水平上的微生物組成主要有葡萄球菌，腸球菌，鏈球菌，埃希氏菌屬，沙雷菌屬，乳桿菌屬，韋榮球菌，奈瑟菌屬和普雷沃氏菌，未能觀察到兩種樣本之間存在顯著差異[46]。隨著3代測(cè)序逐漸興起，其不需PCR富集序列，在高通量測(cè)序的基礎(chǔ)上可以測(cè)更長(zhǎng)的序列，有效避免樣本序列信息丟失的問(wèn)題。對(duì)細(xì)菌16S全長(zhǎng)測(cè)序，更有利于對(duì)樣本中微生物到種水平的鑒定，測(cè)序技術(shù)主要有Helicos公司的Heliscope單分子測(cè)序儀、Pacific Biosciences公司的SMRT技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術(shù)，Ian Toma等利用Pacific Biosciences平臺(tái)對(duì)27份疑似肺炎患者的呼吸道樣本進(jìn)行檢測(cè)，在與微生物分離培養(yǎng)方法比較中發(fā)現(xiàn)，有12個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果有高度一致性，3個(gè)樣本檢測(cè)結(jié)果高度不一致，另有7個(gè)樣本未能分離出病原體但在三代測(cè)序技術(shù)中有微生物檢出，提示通過(guò)基于長(zhǎng)序列測(cè)序的方法提供的診斷準(zhǔn)確性顯著提高[47]。宏基因組技術(shù)是對(duì)樣本中所有微生物的全基因序列進(jìn)行測(cè)序，可以更準(zhǔn)確的鑒定到細(xì)菌、真菌、病毒等各種病原體的種水平，可進(jìn)行更深層的基因注釋和功能注釋?zhuān)诒l(fā)流行分析和監(jiān)測(cè)、院感控制和少見(jiàn)、新病原鑒定方面具有突出優(yōu)勢(shì)。楚亞男等利用對(duì)肺炎病人支氣管肺泡灌洗液的全基因序列進(jìn)行454焦磷酸測(cè)序，鑒定了20種呼吸道重癥感染相關(guān)細(xì)菌物種，發(fā)現(xiàn)了兩種呼吸道潛在致病菌microbacteriumlaevaniformans和borreliagarinii，檢測(cè)到4種耐藥基因和6種細(xì)菌侵染所需的毒力因子，為臨床上快速診斷和合理用藥提供了依據(jù)[48]。

表2 16S-meta分析和宏基因組技術(shù)比較及2代和3代測(cè)序比較Tab.2 Comparison of 16S-meta analysis and metagenomic technology and comparison of second and third generation sequencing

5 總結(jié)與展望

分離培養(yǎng)與涂片鏡檢法是臨床治療的重要參考，二者結(jié)合對(duì)實(shí)驗(yàn)室診斷更具有重要意義。雖然分離培養(yǎng)操作過(guò)程復(fù)雜、所耗時(shí)間長(zhǎng)、檢出限制條件多，但仍然是檢驗(yàn)方法中的“金標(biāo)準(zhǔn)”。血清學(xué)方法也是下呼吸道病原體檢測(cè)的重要方法之一，但難以避免會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，影響診斷和病情。而分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展日新月異，以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的多種下呼吸道病原體同時(shí)檢測(cè)的方法具備特異性強(qiáng)、敏感性高、通量高、速度快、省時(shí)、省力的優(yōu)點(diǎn)，尤其是宏基因組技術(shù)的蓬勃發(fā)展，研究層次深和通量高的特點(diǎn)更是病原體檢測(cè)的主流，因此分子生物學(xué)檢測(cè)將成為最重要的檢測(cè)方法。隨著科技的發(fā)展，高度自動(dòng)化的操作和多種病原體快速、高通量檢測(cè)的結(jié)合，更能應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件，更能迎合個(gè)性化治療的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)理念，可能成為未來(lái)下呼吸道病原體檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的趨勢(shì)[49]。