探討一種新型Wnt替代蛋白激活腦血管Wnt信號(hào)通路對(duì)血腦屏障的保護(hù)作用

曾 毅， 榮先芳， 方 程， 尹美芳， 梁 迅， 暢君雷

腦卒中是由于腦血管突然堵塞或者破裂導(dǎo)致局部腦組織血液供應(yīng)障礙所致的一種急性腦疾病，其中超過75%為缺血性腦卒中[1]。腦血管除了輸送血液、供給養(yǎng)分外，還具有特殊的“血腦屏障”(Blood-Brain Barrier，BBB)功能。血腦屏障高度選擇性的輸送血液中的有益成分進(jìn)入腦組織，而限制血液中的有害物質(zhì)通過，從而保持腦組織微環(huán)境的穩(wěn)定和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能[2]。研究表明，在缺血性腦卒中發(fā)生時(shí)腦血管受到缺血再灌注損傷，血腦屏障遭到破壞，血液中的有害成分，比如炎性因子和免疫細(xì)胞，進(jìn)入腦組織中加劇腦組織損傷[3]。Wnt是一類分泌性糖蛋白，通過與其受體FZD和LRP5/6結(jié)合，誘導(dǎo)依賴于β-catenin的信號(hào)通路(又叫經(jīng)典Wnt信號(hào)通路)激活，進(jìn)而調(diào)節(jié)多個(gè)生物過程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化以及干細(xì)胞自我更新，調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)，促進(jìn)多種組織的生長(zhǎng)和修復(fù)[4，5]。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在胚胎發(fā)育中對(duì)腦血管發(fā)育和血腦屏障形成起核心的調(diào)控作用，主要表現(xiàn)在以下三個(gè)方面：(1)內(nèi)皮細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路功能的缺失特異性影響腦血管發(fā)育和血腦屏障功能，卻并不影響其他器官和組織的血管發(fā)育和功能[6，7]；(2)在小鼠神經(jīng)組織中敲除Wnt7a/7b[6，7]或者在內(nèi)皮細(xì)胞中敲除Wnt的受體FZD4[8]、LRP5/6[9]、受體激活劑Gpr124[10～12]或者Ctnnb1(β-catenin)[13]，均可導(dǎo)致腦血管發(fā)育和血腦屏障功能異常；(3)在體外培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞中激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以顯著上調(diào)血腦屏障功能相關(guān)基因的表達(dá)[14]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性升高可顯著保護(hù)缺血性腦卒中后小鼠的血腦屏障功能，并進(jìn)而減少腦梗死體積、提高小鼠生存率[15]。

天然的Wnt蛋白由于側(cè)鏈的棕櫚油酸酯修飾，導(dǎo)致其水溶性差，難以表達(dá)純化，極大地限制了Wnt蛋白的生物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用[4]。斯坦福大學(xué)的Janda等學(xué)者研發(fā)出一種新型Wnt替代蛋白(Wnt surrogate，Wnt-S)，由FZD受體的中和抗體Vantictumab的單鏈可變區(qū)(scFv，single-chain variable fragment)和LRP5/6結(jié)合蛋白DKK1的C端區(qū)域連接而成，形成一個(gè)新的融合蛋白scFv-DKK1c[16]。Vantictumab的scFv部分能與FZD1，2，5，7，8高親和力結(jié)合，而DKK1的C端區(qū)域能與LRP5/6結(jié)合，因而這種人工合成的Wnt-S蛋白可同時(shí)與FZD和LRP5/6結(jié)合并激活下游的Wnt/β-catenin信號(hào)通路，且易溶于水、容易表達(dá)純化，在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和小鼠體內(nèi)都顯示出良好的生物功能。我們前期合成出Wnt-S的基因片段，通過分子克隆和蛋白表達(dá)純化技術(shù)得到Wnt-S蛋白，探尋Wnt-S蛋白對(duì)人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 HEK293細(xì)胞由北京大學(xué)深圳研究院贈(zèng)送，HEK293F和hCMEC/D3細(xì)胞購自美國(guó)ATCC。限制性內(nèi)切酶EcoRI和XbaI購自NEB公司。感受態(tài)細(xì)胞和T4 DNA連接酶購自TaKaRa。LB培養(yǎng)基粉末(Thermo Fisher)，西班牙瓊脂糖(BIOWEST)，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(TIANGEN)，PEI(Polysciences)，Ni SepharoseTM6 Fast Flow(GE Healthcare)，BCA蛋白定量試劑盒(Solarbio)，一抗稀釋液(日本東洋紡)，ECL發(fā)光液(MILLIPORE)，His-Tag (D3I1O) XP?Rabbit mAb，Anti-rabbit IgGAlexa Fluor594 Conjugate和Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody(CST)，CD31抗體和VE-cadherin抗體，GLUT1抗體和MFSD2A抗體(Abcam)。DMEM高糖培養(yǎng)基和雙抗(HyCloneTM)，澳洲胎牛血清和羊血清(Gibco)，Endothelial Cell Medium(ScienCell)，F(xiàn)reestyleTM293 Expression Medium(Invitrogen)。TRIzol Reagent(Life technologies)，Direct-zol RNA Miniprep(ZYMO RESEARCH)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR qPCR Mix(諾唯贊)。4%組織細(xì)胞固定液，Triton X-100，封片劑(含DAPI)(Solarbio)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分子克隆 將金唯智公司合成的Wnt-S in pUC57-Kan(Wnt-S基因片段兩端有EcoRI和XbaI兩個(gè)酶切位點(diǎn))，用EcoRI和XbaI切下Wnt-S片段(具體方法參照NEB公司這兩種酶的使用說明)，同樣的方法切割pcDNA3.1 (+)載體，分別跑核酸凝膠電泳，紫外下切膠回收純化目的基因片段Wnt-S(1189 bp)和pcDNA3.1 (+)載體(6.4 kb)，用T4 DNA連接酶連接目的片段和載體，再將連接好的質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)胞做轉(zhuǎn)化，均勻涂布在含氨芐青霉素的平板上，待長(zhǎng)出菌落，挑取單克隆于2～5 ml 含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，300RPM搖床上培養(yǎng)8 h，小提質(zhì)粒，EcoRI和XbaI雙酶切該質(zhì)粒，核酸凝膠電泳驗(yàn)證，一條帶大小在6.4 kb，另一條帶大小在1.2 kb，再進(jìn)行大提質(zhì)粒。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前對(duì)HEK293F細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，用20 ml PBS稀釋質(zhì)粒(400 μg)，小心混勻，記為A液，用20 ml PBS稀釋PEI(800 μl)，小心混勻，記為B液(質(zhì)粒：PEI=1∶2，W∶V)，室溫靜置5 min。將B液緩慢加入到A液中，用渦旋振蕩器邊加邊振蕩，室溫靜置20 min。將DNA-PEI混合液緩慢加入到360 ml FreestyleTM293 Expression培養(yǎng)基中，輕輕混勻，使細(xì)胞密度在0.8×106～1.2×106cells/ml，置于37 ℃，8% CO2，125 r/min細(xì)胞培養(yǎng)箱的水平搖床中培養(yǎng)。每天取少量培養(yǎng)基，檢測(cè)細(xì)胞活度，待細(xì)胞活度接近70%時(shí)，停止培養(yǎng)，1000 r/min離心收集上清。

1.2.3 Wnt-S蛋白表達(dá)純化 組裝好恒流泵，將進(jìn)液管插入平衡液中，出液管插入廢液槽，往填料柱中加入0.5 ml Ni SepharoseTM6 Fast Flow，開啟恒流泵，調(diào)節(jié)速率，使平衡液勻速流出。30 min后，將進(jìn)液管插入含Wnt-S蛋白的上清中，出液管插入干凈的收集瓶中，使液體勻速流過柱子，并且避免將填料沖起。此過程在4 ℃環(huán)境下進(jìn)行，待上清全部流過柱子，再按上述同樣的操作，將收集瓶中的液體再過一次柱子。用20 mmol/ml，40 mmol/ml，60 mmol/ml，80 mmol/ml，120 mmol/ml，160 mmol/ml咪唑(六種濃度的咪唑體積均為10 ml)依次洗脫柱子，并分別收集洗脫液，再將這些洗脫液分別加入10 kDa離心過濾器中，在4 ℃，4000 r/min，15 min條件下離心，濃縮后的液體即為Wnt-S蛋白溶液。

1.2.4 Western blot檢測(cè)Wnt-S蛋白 BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)樣品的濃度，計(jì)算上樣量。取一定量蛋白與5x蛋白上樣緩沖液混勻，置于100 ℃金屬浴中處理5～10 min，配制10%分離膠和5%濃縮膠，進(jìn)行電泳。電泳條件：80 V，30 min，120 V直到溴酚藍(lán)進(jìn)入濃縮膠底部，停止電泳。轉(zhuǎn)膜條件：300 mA，90 min。5%脫脂奶粉溶于TBST封閉1 h，用抗體稀釋液稀釋相應(yīng)一抗，PVDF膜被一抗覆蓋，置于4 ℃，搖床上過夜。TBST洗膜3次，5 min/次，孵二抗，搖床上常溫1 h，TBST洗膜3次，5 min/次，顯影。

1.2.5 免疫熒光染色鑒定hCMEC/D3細(xì)胞 在Chamber Slide的小室中接種1×105個(gè)細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱中過夜。吸掉小室中的培養(yǎng)基，加入適量4%組織細(xì)胞固定液，于4 ℃，15 min。吸掉固定液，預(yù)冷PBS洗3次，5 min/次。預(yù)冷0.2%Triton X-100處理8～10 min。吸掉0.2%Triton X-100，預(yù)冷PBS洗3次，5 min/次。5%羊血清(用PBS稀釋)，37 ℃，封閉1 h。孵相應(yīng)一抗(用1%羊血清稀釋)，4 ℃過夜。吸掉一抗，預(yù)冷PBS洗3次，5 min/次。避光孵相應(yīng)二抗(用1%羊血清稀釋)，4 ℃，1 h。吸掉二抗，預(yù)冷PBS洗3次，5 min/次(避光)。滴封片劑(封片劑：PBS=1∶1稀釋)封片，指甲油固定。固定后，熒光顯微鏡下拍照。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)FZD1-10、LRP5/6和AXIN2的表達(dá) 用Trizol裂解細(xì)胞，RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中總RNA，Nano Drop 2000c檢測(cè)RNA的濃度，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA(具體方法參照諾唯贊的說明書)，然后進(jìn)行qPCR(具體方法參照諾唯贊的說明書)。

2 結(jié) 果

2.1 Wnt-S蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建 核酸電泳的結(jié)果顯示W(wǎng)nt-S in pcDNA3.1 (+)質(zhì)粒成功構(gòu)建(見圖1)。

a：Lane1為Marker；Lane2，3中3 kb左右的條帶為pUC57載體，1.2 kb左右的條帶為Wnt-S；Lane5和6中6.4 kb左右的條帶為pcDNA3.1載體，還有一個(gè)切割下的小片段小于250 bp，所以在圖上沒有顯示。B：Lane1為Marker；Lane3、4、5中6.4 kb左右的條帶為pcDNA3.1載體，1.2 kb左右的條帶為Wnt-S

圖1 核酸電泳結(jié)果

2.2 Wnt-S蛋白的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和表達(dá) Western blot結(jié)果表明在轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞上清中檢測(cè)到了Wnt-S蛋白，其表達(dá)純化的最佳條件為轉(zhuǎn)染后5 d收集上清，120 mmol/ml咪唑洗脫(見圖2)。

a：取轉(zhuǎn)染0～6 d的上清，檢測(cè)Wnt-S。B：梯度濃度20～160(mmol/ml)咪唑洗脫Wnt-S。一抗Anti-His，Rabbit(1∶1000)，二抗Anti-Rabbit(1∶10000)

圖2 Western blot結(jié)果

2.3 hCMEC/D3內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定 免疫熒光染色結(jié)果顯示，hCMEC/D3細(xì)胞高表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞Marker CD31、VE-cadherin和血腦屏障Marker GLUT1、MFSD2A(見圖3)。

2.4 Wnt-S蛋白對(duì)hCMEC/D3細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活作用 首先，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果顯示HEK293和hCMEC/D3細(xì)胞中FZD1-10和LRP5/6的表達(dá)情況(見圖4A、圖4B)。其次，實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果顯示加Wnt-S蛋白和Wnt3a蛋白處理后，HEK293和hCMEC/D3細(xì)胞中AXIN2表達(dá)顯著性上調(diào)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路被顯著激活(見圖4C、圖4D)。

一抗CD31(1∶50)，一抗VE-cadherin(1∶100)；一抗GLUT1(1∶500)，MFSD2A(1∶500)。二抗Anti-Rabbit(1∶10000)。EC：內(nèi)皮細(xì)胞；BBB：血腦屏障

圖3 免疫熒光染色結(jié)果

a：HEK293細(xì)胞中Wnt受體FZD1-10和LRP5/6表達(dá)情況。B：hCMEC/D3細(xì)胞中Wnt受體FZD1-10，LRP5/6和細(xì)胞Marker(CD31和MFSD2A)表達(dá)情況。C：加藥處理24 h后，HEK293細(xì)胞中AXIN2的表達(dá)情況。D：加藥處理24 h后，hCMEC/D3細(xì)胞中AXIN2的表達(dá)情況。(ns：無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)

圖4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果

3 討 論

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了19種不同的哺乳類Wnt蛋白，這些蛋白與10種FZD受體雜亂的結(jié)合，形成了不同的生物學(xué)功能[4，5]。Wnt翻譯后通過蛋白質(zhì)棕櫚化作用形成了棕櫚油酸酯修飾，這個(gè)修飾對(duì)于Wnt蛋白的分泌和其與FZD相互作用的關(guān)鍵位點(diǎn)形成至關(guān)重要[17～19]。然而，棕櫚油酸酯化使天然Wnt蛋白變得非常疏水，這嚴(yán)重阻礙了Wnt重組蛋白的制備和應(yīng)用，也不利于進(jìn)一步了解Wnt信號(hào)通路的分子機(jī)制、FZDs亞型的功能意義、以及將Wnt蛋白作為一種新的治療藥物[16]。本文中，我們發(fā)現(xiàn)人工合成的Wnt替代蛋白具有與天然Wnt3a蛋白類似的生物學(xué)功能，都能激活hCMEC/D3細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路。Wnt-S蛋白的優(yōu)勢(shì)在于能與多個(gè)FZD受體(FZD1，2，5，7，8)結(jié)合，且水溶性高、容易表達(dá)純化和大規(guī)模制備，可能具有更廣闊的生物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景。而鑒于Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)腦血管血腦屏障功能維持起重要的調(diào)控作用，這提示我們?cè)谀X卒中發(fā)生后，Wnt-S可能作為一種新的治療手段去保護(hù)或修復(fù)腦缺血再灌注后受損的血腦屏障，改善患者預(yù)后。