一株寄生曲霉Q527對黃野螟的感染作用及生物學(xué)特性

趙鵬飛，常明山，羅 輯 ，吳耀軍 ，楊 娟 ，楊振德

（1.廣西大學(xué)林學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西優(yōu)良用材林資源培育重點實驗室/廣西林業(yè)科學(xué)研究院，廣西 南寧 530002；3.崇左市森林病蟲害防治檢疫站，廣西 崇左 532200）

【研究意義】黃野螟（Heortiavites soides Moore）隸屬于鱗翅目（Lepidoptera）螟蛾科，是土沉香〔Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg〕生長過程中危害最嚴(yán)重的食葉性害蟲。一齡幼蟲和二齡幼蟲群居生活，把葉子吃到只剩下薄薄的葉脈，三齡幼蟲可啃食整個葉片結(jié)構(gòu)，分散危害，危害面積擴大。黃野螟幼蟲從低齡發(fā)育到高齡時間較短，一般在發(fā)現(xiàn)其危害及準(zhǔn)備防治時，其接近或進入高齡期，暴發(fā)時將受害區(qū)內(nèi)的土沉香全部吃光，造成樹勢下降甚至死亡，嚴(yán)重影響土沉香正常生長［1-2］。在土沉香生產(chǎn)中的防治途徑主要依靠物理防治和化學(xué)防治，物理防治主要是利用殺蟲燈和蜜源植物對黃野螟成蟲進行誘殺和對各代卵期、幼蟲期，或組織人力摘除有蟲枝葉［3］；化學(xué)防治中不同類型殺蟲劑的作用方式存在差異，對黃野螟的防效也存在顯著差異［4］。然而物理防治人工成本過高，防治成本一般; 化學(xué)防治污染環(huán)境，害蟲容易產(chǎn)生抗藥性。由于繁殖迅速、世代重疊、易于爆發(fā)成災(zāi)［5-7］，因此增加了害蟲治理成本和難度，治理過程中也會對寄主和周邊環(huán)境造成影響?？沙掷m(xù)資源發(fā)展的重要研究領(lǐng)域之一就是生物防治，微生物農(nóng)藥的研究與利用正是現(xiàn)代生物防治的一大特點［8］，因此探索新型生物防治措施具有重要現(xiàn)實意義。

【前人研究進展】有關(guān)蟲生真菌對鱗翅目的影響研究已有一些報道，安建梅等［9］研究表明粉質(zhì)擬青霉對黃刺蛾幼蟲有很高的毒力且具有良好的防治效果，致病死亡率為84%。何勁等［10］研究證實4株蟲生真菌對小菜蛾防治中的應(yīng)用和毒力，結(jié)果表明其具有良好的毒殺作用。劉愛英等［11］研究了玫煙色擬青霉和斜鏈擬青霉對煙草粉螟感染力和致病作用，發(fā)現(xiàn)二者具有很好的防控潛力?！颈狙芯壳腥朦c】從自然死亡黃野螟尸體上分離發(fā)現(xiàn)1株對黃野螟具有高侵染力的菌株，黃野螟被侵染2d后蟲體開始出現(xiàn)菌絲體。對該黃野螟寄生菌進行分離鑒定，確定為寄生曲霉Q527（Aspergillus nomiusQ527），曲霉對黃野螟的致死作用和生物學(xué)特性至今國內(nèi)外尚未見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】由于蟲生真菌的防治效果容易受到環(huán)境因子的影響，只有掌握最有利于蟲生真菌的生長條件及產(chǎn)孢特性，才能為有效利用其防治黃野螟危害。為探討寄生曲霉Q527控制黃野螟危害的可能性，本研究測定其對黃野螟的感染作用，并對寄生曲霉Q527生物學(xué)特性進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年8月于廣西壯族自治區(qū)憑祥市東盟林業(yè)產(chǎn)業(yè)園種植區(qū)的土沉香林采集黃野螟幼蟲。將采集幼蟲放入網(wǎng)袋內(nèi)，采集500頭以上，帶回室內(nèi)于人工氣候箱內(nèi)飼養(yǎng)，喂以新鮮土沉香葉片，飼養(yǎng)溫度為26（±1）℃，相對濕度為85%，光周期為16∶8 （L∶D）。

寄生曲霉Q527菌株從自然罹病死亡的黃野螟幼蟲體表分離得到，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定為寄生曲霉Q527（Aspergillus nomiusQ527），保存于廣西林業(yè)科學(xué)研究院森林保護實驗室。

供試培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g和蒸餾水1 L；SDAY培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、酵母浸出物10 g、葡萄糖40 g、瓊脂20 g和蒸餾水1 L；PCA培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g、酵母浸粉2.5 g、葡萄糖1.0 g、瓊脂15.0 g和蒸餾水1 L；PSA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g和蒸餾水1 L；OA培養(yǎng)基：燕麥片30 g、瓊脂20 g和蒸餾水1 L；WA培養(yǎng)基：瓊脂20 g和蒸餾水1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 毒力測定 菌株在26℃條件下培養(yǎng)15 d，用含0.5%吐溫-80的無菌水配制孢子懸浮液，血球板計數(shù)濃度為1.0×108個/mL。幼蟲采用浸漬法接種［12］，將同一批次老熟幼蟲浸入20 mL孢子懸浮液2 min后，把幼蟲挑入放置土沉香葉片的飼養(yǎng)盒中，每盒20頭幼蟲。每個處理3次重復(fù)，設(shè)含0.5%吐溫?zé)o菌水為對照。每天定時觀察記錄發(fā)病特征及死亡情況，持續(xù)觀察7 d。

1.2.2 培養(yǎng)基對菌株生長的影響實驗 將供試菌株在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)7 d。用直徑為5 mm的打孔器在上述PDA培養(yǎng)基中打出菌塊，然后分別接入事先倒好的供試培養(yǎng)基。觀察并記錄生長趨勢和形態(tài)顏色。

1.2.3 pH對菌株生長的影響實驗 分別將菌塊接入 pH為 5、6、7、8、9、10、11、12的 PDA培養(yǎng)基中，放置26℃恒溫培養(yǎng)箱中，每個處理3次重復(fù)。培養(yǎng)5 d，采用十字交叉法測量其菌落直徑培養(yǎng)［13］；培養(yǎng)20d，鏡檢并計算各處理平均產(chǎn)孢量。

1.2.4 高溫對菌株生長的影響實驗 分別將菌塊和孢子懸浮液放入無菌離心管內(nèi)，放置溫度為35、40、45、50、55、60、65 ℃的水浴鍋內(nèi)加熱10 min后，接入PDA培養(yǎng)基，放置26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每個處理3次重復(fù)，直徑計算同1.2.3，分生孢子萌發(fā)率計算方法參照杜奕君等［14］并略有改進。

1.2.5 不同碳和氮源對菌株生長的影響實驗 采用真菌生理培養(yǎng)基［15］分別以葡萄糖、可溶性淀粉、乳糖和麥芽糖為碳源測定菌株對不同碳源的利用；分別以蛋白胨、硝酸鉀、硫酸銨和硝酸鈣為氮源測定菌株對不同氮源的利用，以不加入碳源和氮源的培養(yǎng)基為對照。將菌塊接入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基中，放置26 ℃恒溫培養(yǎng)箱，每個處理3次重復(fù)，直徑和產(chǎn)孢量計算同1.2.3。

1.2.6 光照對菌株生長的影響實驗 分別將接入菌塊的培養(yǎng)皿置于光照、光暗12 h交替和全黑暗的26℃恒溫培養(yǎng)箱中，每個處理3次重復(fù)。直徑和產(chǎn)孢量計算同1.2.3。

數(shù)據(jù)處理和計算均采用Excel和SPSS 22.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 寄生曲霉Q527菌株的殺蟲活性

用曲霉Q527孢子懸浮液對健康的黃野螟幼蟲進行接種，在保濕的無菌環(huán)境下培養(yǎng)數(shù)天后，從頭部和腹部的關(guān)節(jié)處長出了菌物（圖1，封三）。菌物從最初的白色變?yōu)槊鼽S色，經(jīng)分離純培養(yǎng)，在PDA培養(yǎng)基上逐漸形成淺黃色至淡綠色的菌落。用純培養(yǎng)菌種接種健康的黃野螟，再次出現(xiàn)大量試蟲死亡，死蟲經(jīng)保濕無菌培養(yǎng)數(shù)天后又長出形態(tài)相似的菌物。將這些菌物再分離純化培養(yǎng)在PDA培養(yǎng)基上后，得到的菌株形態(tài)特征及菌落與孢子特征均與原接種菌株一致。上述結(jié)果表明，由科赫氏法則確定寄生曲霉Q527為黃野螟的致死病原菌。

圖1 黃野螟幼蟲感染過程Fig. 1 Infection process map of Heortiavites soides larvae

不同空間尺度下西南高原山地基本農(nóng)田質(zhì)量景觀格局分析（內(nèi)文第120～129頁）圖版

黃野螟幼蟲經(jīng)菌株Q527接種處理，接種后1 d行動遲緩，食量降低，蟲體開始發(fā)暗，蟲體飽滿保持原有形狀，接種后2 d逐漸開始死亡，蟲體出現(xiàn)變褐、變黑及僵硬的癥狀，可見白色的菌絲從病發(fā)區(qū)長出，接種后3 d蟲體產(chǎn)生大量菌絲并被其覆蓋。接種后4 d蟲體逐漸干癟體積縮小，菌株的顏色轉(zhuǎn)為黃綠色。在室內(nèi)條件下對黃野螟接種處理后，致死效果明顯，菌株的致死率均與對照存在顯著差異，接種后2 d內(nèi)死亡率較低，接種后3 d死亡率升高，為74.1%；隨后死亡率逐漸平緩， 接種后7 d幼蟲死亡率為83.3%（圖2）。

圖2 黃野螟幼蟲日死亡率Fig. 2 Daily mortality of larval of Heortiavites soides

2.2 培養(yǎng)基對寄生曲霉生長的影響

供試的 6種培養(yǎng)基中菌株Q527在PDA培養(yǎng)基上生長最好，菌絲十分厚實，顏色表現(xiàn)前期為白色，后期為黃綠色。菌落直徑達78.18 mm，與其他培養(yǎng)基存在極顯著差異；其次是在SDAY和PSA培養(yǎng)基上生長速度較好，菌絲濃密程度一般，菌落直徑分別為42.85 mm和41.58 mm；在SDAY培養(yǎng)基上菌絲較為稀疏，在PSA培養(yǎng)基上可以看到明顯輪紋；在PCA培養(yǎng)基上生長速度相對一般，但菌絲較為濃密，菌落直徑為39.33 mm；在燕麥培養(yǎng)基上生長速度相對較差且輪紋不明顯，菌落直徑為36.82 mm；在WA培養(yǎng)基不生長。

2.3 pH值對寄生曲霉生長的影響

從圖3可以看出，寄生曲霉Q527生長pH范圍比較廣，在pH5.0～12.0范圍內(nèi)均可生長，有極強的耐堿性，不同pH對該菌的生長影響差異顯著。其在pH為8.0生長最快，菌落直徑為78.12 mm。培養(yǎng)20 d后觀察其產(chǎn)孢量發(fā)現(xiàn)，該菌株在pH5.0～12.0之間都可以產(chǎn)孢，在過度的偏酸性條件下，產(chǎn)孢量會受到明顯抑制。pH5.0時產(chǎn)孢量最低，每皿分生孢子為4.07×108個；在pH8.0時產(chǎn)孢量最高，每皿分生孢子為2.61×109個；隨著pH的繼續(xù)升高，產(chǎn)孢量也會逐漸變少。表明寄生曲霉Q527適宜生長偏堿性環(huán)境中，pH8.0最為適宜。

圖3 不同pH值對寄生曲霉的生長和產(chǎn)孢量的影響Fig. 3 Effects of different pH on mycelial growth and sporulation

2.4 高溫對寄生曲霉生長的影響

高溫對寄生曲霉Q527生長的影響測定結(jié)果（圖4）表明，其在35～60℃溫度下菌株可恢復(fù)生長，孢子均可萌發(fā)。但菌絲生長受溫度變化的影響差異極顯著，在35℃菌絲長勢最好、邊緣整齊，菌落直徑為81.18 mm，菌絲在65℃水浴10 min后再次接入培養(yǎng)基中停止生長，表明隨溫度升高，菌絲生長速度減緩直至死亡。曲霉Q527孢子萌發(fā)受溫度變化明顯，菌株的孢子萌發(fā)率均隨溫度的升高而減小。分生孢子在65℃時停止萌發(fā)，在35 ℃時孢子萌發(fā)率最高，為98.13%。

圖4 高溫對菌絲的生長和孢子萌發(fā)的影響Fig. 4 Effects of high temperature on mycelial growth and spore germination

2.5 碳源對寄生曲霉生長的影響

從圖5可以看出，菌株Q527在測試的5種碳源培養(yǎng)基上均可生長，但對各碳源利用程度不同。從菌落生長速度看，發(fā)現(xiàn)其對乳糖具有很好的利用率，在含乳糖的培養(yǎng)基上，菌絲生長速率最快，菌落直徑為37.97 mm。碳源對菌絲生長速度和產(chǎn)孢量的影響沒有明顯相關(guān)性，不同碳源對病原菌產(chǎn)孢影響也不同，最適合產(chǎn)孢的為含可溶性淀粉的培養(yǎng)基，培養(yǎng)20 d平均產(chǎn)孢量為2.03×109個/皿；含葡萄糖、乳糖和麥芽糖的碳源培養(yǎng)基均可以產(chǎn)孢。不同碳源對菌株Q527影響差別較大，在不含碳源的培養(yǎng)基上生長速度和產(chǎn)孢量最低，說明碳源可以促進菌株Q527生長和產(chǎn)孢。

圖5 不同碳源對寄生曲霉的生長和產(chǎn)孢量的影響Fig. 5 Effects of different carbon sources on mycelial growth and sporulation

2.6 氮源對寄生曲霉生長的影響

從圖6可以看出，不同氮源培養(yǎng)基對菌株Q527菌絲生長影響差別較大，蛋白胨是菌絲生長最快及產(chǎn)孢量最多的氮源，培養(yǎng)7 d菌落直徑達到51.09 mm；培養(yǎng)20 d產(chǎn)孢量達2.96×109個/皿；在含氮培養(yǎng)基中，硝酸鈣培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量最低，培養(yǎng)20 d產(chǎn)孢量為0.74×109個/皿，表明硝酸鈣作為氮源不適合菌株Q527產(chǎn)孢；硝酸鉀和硫酸銨作為氮源和空白對照比較，發(fā)現(xiàn)其抑制菌絲生長。在不含氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最低，說明含有氮源可以促進菌株Q527產(chǎn)孢。

圖6 不同氮源對寄生曲霉生長和產(chǎn)孢量的影響Fig. 6 Effects of different nitrogen sources on mycelial growth and sporulation

2.7 光照條件對寄生曲霉生長的影響

光照對寄生曲霉Q527生長的影響結(jié)果（圖7）表明，菌絲生長受光照條件的影響差異顯著。全黑暗條件下，菌絲生長速度最快，菌落直徑為78.18 mm；光暗12 h交替下生長速率居中，菌落直徑為76.04 mm；連續(xù)光照條件下生長速率最低，菌落直徑為40.21 mm。產(chǎn)孢量受光照條件的影響差異顯著，黑暗條件可促進寄生曲霉Q527產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量為2.63×109個/皿。在不同光照條件下，持續(xù)光照對菌株產(chǎn)孢有抑制作用，但是產(chǎn)孢時間較早。

圖7 不同光照條件對寄生曲霉生長和產(chǎn)孢量的影響Fig. 7 Effects of different light conditions on mycelial growth and sporulation

3 討論

蟲生真菌資源極為豐富，而我國已發(fā)現(xiàn)的昆蟲病原真菌涉及40多個屬400種［16］。白僵菌［17］、綠僵菌［18］和曲霉菌是自然界重要的蟲生真菌資源，在生物防治中很早就被發(fā)現(xiàn)和利用。前人通過大量研究認(rèn)為曲霉屬的多種曲霉可作為生防菌可以用來防治目的昆蟲，如采用煙曲霉和葡萄曲霉的融合菌株對松墨天牛越冬幼蟲有較高的致死率［19］、米曲霉可抑制小菜蛾取食量減少并導(dǎo)致定殖率下降［20］、黃曲霉和溜曲霉對瓜實蠅成蟲有較高毒性及防治效果［21］等。本研究首次報道寄生曲霉Q527對黃野螟幼蟲具有良好的感染作用并在短期內(nèi)導(dǎo)致黃野螟幼蟲大量死亡。在病發(fā)蟲體上發(fā)現(xiàn)黃霉層，可能是寄生曲霉直接侵染和次生代謝產(chǎn)物致病相互作用的結(jié)果［22］。曲霉生長發(fā)育除了對環(huán)境有更高要求外，營養(yǎng)元素的細(xì)微變化也會直接且迅速影響菌絲生長［23］。曲霉屬不同種和不同菌株的最適外界環(huán)境和營養(yǎng)條件有所不同［24］，本試驗結(jié)果也說明了培養(yǎng)基、pH、碳源、氮源和光照的差異對曲霉Q527的生長和產(chǎn)孢量存在較顯著影響。寄生曲霉在防治農(nóng)林害蟲具有十分明顯的優(yōu)勢，但是生物防治的前提是針對不同菌株的特定培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)，這需要對不同菌株的外界培養(yǎng)環(huán)境和內(nèi)在營養(yǎng)條件進行研究，以期達到最大產(chǎn)孢量，這也是真菌大規(guī)模生產(chǎn)的要求［25］。隨著新型技術(shù)的日漸成熟，有助于此菌種大規(guī)模在林間推廣［26］。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，黃野螟幼蟲的寄生曲霉是一種潛在的生防真菌，也是控制害蟲的一種有效手段，其引起部分致病效應(yīng)加快了昆蟲的致死進程。寄生曲霉Q527生長最適培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，在pH5.0～12.0范圍內(nèi)均可生長。乳糖能促進寄生曲霉Q527菌絲生長，可溶性淀粉可有效促進寄生曲霉Q527產(chǎn)孢，蛋白胨作為氮源在生長速度和產(chǎn)孢量都有一定優(yōu)勢，營養(yǎng)繁殖喜黑暗，黑暗環(huán)境能促進其產(chǎn)孢。雖然研究結(jié)果表明此曲霉具備防除害蟲的潛力，但對有前途的菌株等開展定性的安全性評價也很有必要，實際的開發(fā)利用還有待于進一步開展安全性研究。