紫杉醇水蛭素支架涂層復合物對HCASMC炎性活化過程中TLR4-MyD88信號通路的影響

李紅梅，王顯

針對介入術后仍有10%~20%再狹窄率及支架血栓形成風險，防治支架內再狹窄成為介入領域的研究熱點[1-3]。隨著研究的逐步深入，經皮冠狀動脈介入術（PCI）后炎癥狀態(tài)與再狹窄之間的相關性得到肯定，諸多通過抗炎防治再狹窄的治療策略層出不窮，從口服抗炎調整全身炎癥狀態(tài)，到藥物涂層支架的局部抗炎治療，再到可降解支架的技術革新，抗炎成為防治PCI術后再狹窄新的突破口[4-7]。

既往國外利用重組水蛭素與依洛前列環(huán)素組成復合物，研制出新一代內皮“友好型”藥物支架，在動物實驗中抗栓療效肯定，并能有效減少冠狀動脈再狹窄面積[8]。內皮“友好型”復合載藥技術為我們提供了重要的研究思路，創(chuàng)新性尋找兩種單體組成復合物涂載于球囊或支架系統(tǒng)可能對降低介入術后再狹窄和預防血栓形成起到更為積極的作用。在此思路指導下，本團隊自主研發(fā)了紫杉醇水蛭素復合物作為目前藥物支架/球囊涂層藥物的創(chuàng)新示范，其中水蛭素具有生物免疫原性，能更好的作為引導血管組織“修復”的模版，起到抗再狹窄和預防血栓形成的雙重作用，是目前最完美的藥物涂層支架/球囊設計理念。本團隊前期的動物實驗表明，紫杉醇水蛭素復合藥物涂層球囊能有效抑制血管內膜增生，球囊涂層的天然水蛭素比常規(guī)的優(yōu)維顯能夠更好的作為紫杉醇的載體，促進內皮愈合，抑制血栓形成，優(yōu)化單一紫杉醇涂層所帶來的內皮化延遲問題，在抗再狹窄形成方面優(yōu)勢明顯。

基于上述背景，本研究運用MTT法，觀察不同配比條件下的紫杉醇水蛭素支架涂層復合物對HCASMC活力的影響，確定最佳的紫杉醇水蛭素支架涂層復合物大、小兩個濃度，使細胞活力保持在90%以上。綜合應用Q-PCR、Western blot法探究紫杉醇水蛭素支架涂層復合物大、小兩個濃度對HCASMC炎性活化過程中TLR4-MyD88炎癥通路各主要位點的基因和蛋白表達水平的影響，初步闡釋紫杉醇水蛭素支架涂層復合物的抗炎機制。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 主要試劑 HCASMC（貨號：FC-0031）、平滑肌細胞培養(yǎng)基、胰酶、胰酶抑制劑、凍存液均購自美國Lifeline公司；細胞培養(yǎng)級脂多糖1mg/ml（貨號：L6529），Sigma（L2880）；紫杉醇儲存液100ul（KGA8221），南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；科研級天然水蛭素凍干粉瓶裝500AT-U/g，武漢勝天宇生物科技有限公司；兔TLR4多克隆抗體（ab30667），abcam公司；兔MyD88多克隆抗體（ab119048），abcam公司；HRP標記的羊抗兔IgG（BA1050），武漢博士德公司；TRIZOL通用型RNA快速提取試劑盒，inventrogen公司產品；反轉錄試劑盒，美國Bio-Rad公司。

1.1.2 主要儀器 超凈工作臺CJT-E-Ⅱ（北京昌平長城空氣凈化工程公司）、倒置相差顯微鏡（Olympus CKX×41）、低速離心機LD4-2（北京雷勃爾離心機有限公司）、培養(yǎng)箱（MCO-20AIC，SANYO Elecronic.Ltd.JAPEN）、-80℃低溫冰箱（美國REVCO Legaci）、電熱恒溫水箱（HH.W21.420）、熒光PCR儀、SDS-PAGE凝膠電泳儀、電轉儀均為美國Bio-Rad公司產品。

1.2 方法

1.2.1 細胞準備及處理 實驗使用第4-6代細胞，將生長至融合期的HCASMC以胰蛋白酶消化，細胞懸液接種于6孔細胞培養(yǎng)板，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞融合成單層開始實驗。

1.2.2 MTT法篩選出紫杉醇水蛭素支架涂層復合物干預HCASMC的無毒性濃度范圍，使細胞活力保持在90%以上 實驗共分為8組，每組6個復孔，空白對照組不加入紫杉醇水蛭素復合物干預，其余各組加入不同配比的紫杉醇水蛭素復合物干預48 h，具體分組如下：①空白對照組；②1 μmol/L的紫杉醇+0.0125 mg/ml水蛭素組；③1 μmol/L的紫杉醇+0.025 mg/ml水蛭素組；④1 μmol/L的紫杉醇+0.05 mg/ml水蛭素組；⑤1 μmol/L的紫杉醇+0.1 mg/ml水蛭素組；⑥1 μmol/L的紫杉醇+0.2 mg/ml水蛭素組；⑦1 μmol/L的紫杉醇+0.4 mg/ml水蛭素組；⑧1 μmol/L的紫杉醇+0.8 mg/ml水蛭素組。

1.2.3 Q-PCR法測定紫杉醇水蛭素支架涂層復合物對HCASMC炎性活化過程中炎癥通路關鍵分子TLR4和MyD88的mRNA表達 將實驗分為4組：①空白對照組；②LPS造模組；③LPS造模+紫杉醇水蛭素大濃度組；④LPS造模+紫杉醇水蛭素小濃度組。用TRIZOL通用型RNA快速提取試劑盒提取樣品RNA，用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，按照以下反應體系進行：模板（RNA）1 μg；5x Reaction Mix 4 μl；Reverse Transcriptase 1 μl；DEPC處理水至20 μl，混勻，25℃ 5 min，42℃ 30 min，85℃5 min。Q-PCR檢測按照以下反應體系進行：模板（cDNA）/ddH2O，7.5 μl；4 μM引物F/R，5 μl；SYBR 12.5 μl，混勻，置于熒光定量PCR儀中。數據處理：目的基因的相對表達量用ΔΔCT法計算，ΔCT（目的基因）=CT（目的基因）－CT（內參基因），ΔΔCT=ΔCT（處理組）－ΔCT（空白組）。目的基因的相對表達水平=2-ΔΔCT ，數據用Excel進行統(tǒng)計分析，熒光實時定量PCR結果均用均值±標準誤表示，其中各基因的表達量所示結果均經過內參β-actin表達量進行校正。

1.2.4 Western blotting法測定紫杉醇水蛭素支架涂層復合物對HCASMC炎性活化過程中炎癥通路關鍵分子TLR4和MyD88的蛋白表達 將實驗分為4組：①空白對照組；②LPS造模組；③LPS造模+紫杉醇水蛭素大濃度組；④LPS造模+紫杉醇水蛭素小濃度組。提取細胞總蛋白，1.25x SDS 50 μl混勻后100℃煮20 min變性。將10 μl蛋白樣品加于12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳3 h，然后電轉90 min至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入TLR4、MyD88一抗（1:1000稀釋）、β-actin一抗（1:1000稀釋），4℃過夜，洗滌后加入辣根過氧化酶標記的羊抗兔IgG（1:2000稀釋），室溫孵育1h，洗滌后發(fā)光壓片，用凝膠圖像掃描儀進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理 用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數據處理，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組間均數的比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MTT法摸索紫杉醇水蛭素支架涂層復合物干預HCASMC的無毒性濃度范圍 MTT結果顯示：1 μmol/L的紫杉醇配比0.8 mg/ml水蛭素對HCASMC生長有明顯的抑制作用，細胞活力與空白對照組相比差異明顯（P＜0.05）。1 μmol/L的紫杉醇配比0.4 mg/ml水蛭素干預后細胞活力降低為78.7%，對細胞生長產生了一定影響，其余各濃度組細胞活力均能保持在90%以上，因此紫杉醇水蛭素支架涂層復合物的無毒性大、小兩個濃度分別為：大濃度組1 μmol/L的紫杉醇+0.2 mg/ml水蛭素；小濃度組1 μmol/L的紫杉醇+0.0125 mg/ml水蛭素（表1）。

表1 紫杉醇水蛭素支架涂層復合物不同配比對HCASMC活力的影響

2.2 Q-PCR法檢測紫杉醇水蛭素支架涂層復合物對HCASMC炎性活化過程中炎癥通路關鍵分子TLR4和MyD88基因表達的影響 Q-PCR結果顯示：與空白對照組相比，LPS造模后可同時激活TLR4、MyD88基因表達（P＜0.05），HCASMC炎癥模型構建成功。各干預組經紫杉醇水蛭素處理后，與LPS造模組相比，TLR4的基因表達量顯著降低（P＜0.05），但不影響MyD88的基因表達（P＞0.05）（圖1，圖2）。

圖1 紫杉醇水蛭素對TLR4 mRNA的影響

圖2 紫杉醇水蛭素對MyD88 mRNA的影響

2.3 Western blot法檢測紫杉醇水蛭素支架涂層復合物對HCASMC炎性活化過程中炎癥通路關鍵分子TLR4和MyD88蛋白表達的影響 Western blotting結果顯示：與空白對照組相比，LPS模型組TLR4及MyD88蛋白表達明顯升高（P＜0.05），成功構建了穩(wěn)定的HCASMC炎癥模型。經紫杉醇水蛭素處理后，各干預組TLR4和MyD88蛋白表達較LPS模型組顯著降低（P＜0.05），其中紫杉醇水蛭素大濃度組的抗炎作用相對更強（圖3~4）。

圖3 紫杉醇水蛭素復合物對LPS誘導HCASMC活化過程中通路關鍵蛋白表達的影響

圖4 紫杉醇水蛭素復合物對HCASMC活化過程中炎癥通路關鍵蛋白表達的影響

綜合上述結果，紫杉醇水蛭素復合物可顯著抑制TLR4-MyD88信號通路關鍵分子TLR4的基因和蛋白表達，但對MyD88的調控較為特殊，僅下調MyD88蛋白表達而不影響其基因表達，這為我們下一步的機制研究提供了思路，后續(xù)研究將以MyD88為突破口，對其抗炎機制進行更深層次的挖掘。

3 討論

針對PCI后再狹窄難題，目前以細胞微管抑制劑紫杉醇作為涂層藥物的支架或球囊以其穩(wěn)定的安全性和有效性廣泛應用于臨床。從TAXUS-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ到著名的亞洲/歐洲紫杉醇涂層支架評價（ASPECT/ELUTES研究）等多中心、前瞻性臨床試驗均證實[9,10]，紫杉醇涂層支架不僅能顯著降低PCI后再狹窄發(fā)生率，還能大幅降低主要心血管不良事件的影響，這與紫杉醇干擾G2-M后期的有絲分裂阻斷細胞周期進程有關[11]。然而近年大量研究發(fā)現[12-15]，單一的紫杉醇涂層支架/球囊治療后仍有約10%~20%的再狹窄率，延遲的支架血栓形成更是限制了它在臨床上的推廣應用，需要進一步創(chuàng)新現有藥物支架或球囊的研發(fā)理念，在抗再狹窄的防治中取得更大突破。

水蛭素作為直接的凝血酶抑制劑，是一種含有65個氨基酸的多肽，對凝血酶的直接抑制和/或滅活作用可不依賴于抗凝血酶Ⅲ、肝素輔因子Ⅱ、蛋白C和組織因子途徑抑制物，能夠同時作用于凝血酶的活性部位和底物識別部位，與肝素相比，其不被血小板滅活，還有抑制凝血酶誘發(fā)的血小板聚集作用，具備良好的抗凝血和抗血栓雙重作用。水蛭素的重組衍生物比伐盧定在抗凝方面顯示出優(yōu)越效果，METRIX、BRIGHT研究均表明水蛭素更高級別衍生物比伐盧定（重組水蛭素）在抗栓治療中療效顯著[16]。有研究在兔動脈損傷模型中發(fā)現，水蛭素短期治療可減少新生內膜面積44%~59%，但口服治療效果不佳，原因可能與水蛭素屬于大分子多肽，不利于消化和代謝有關[17,18]。本團隊在既往紫杉醇涂層材料基礎上，選擇直接的凝血酶抑制劑水蛭素取代水溶性載體優(yōu)維顯，與紫杉醇以最佳配比制備出紫杉醇水蛭素支架涂層復合物，探索此新型支架涂層材料的可行性、安全性及有效性并闡明其效應機制。本團隊前期的動物實驗表明，紫杉醇水蛭素復合藥物涂層球囊能有效抑制血管內膜增生，球囊涂層的天然水蛭素比常規(guī)的優(yōu)維顯能夠更好的作為紫杉醇的載體，促進內皮愈合，抑制血栓形成，優(yōu)化單一紫杉醇涂層所帶來的內皮化延遲問題，在抗再狹窄形成方面優(yōu)勢明顯。

本研究充分利用LPS誘導的HCASMC炎性活化細胞模型，將大、小兩個濃度的無毒性紫杉醇水蛭素支架涂層復合物預處理HCASMC，探索紫杉醇水蛭素支架涂層復合物對HCASMC炎性活化過程中TLR4-MyD88信號通路的影響，以期能從炎癥角度對其抗再狹窄機制進行闡釋。我們在前期研究基礎上，進一步優(yōu)化紫杉醇水蛭素支架涂層復合物的藥物配比，用MTT法篩選不同配比條件下的復合藥物組合對HCASMC活力的影響，選擇使細胞活力保持在90%以上的紫杉醇水蛭素大、小兩個濃度作為藥物干預濃度，以排除紫杉醇水蛭素產生的細胞毒性對實驗結果帶來的影響。最終確定無毒性復合藥物大濃度組為1 μmol/L的紫杉醇+0.2 mg/ml水蛭素；小濃度組為1 μmol/L的紫杉醇+0.0125 mg/ml水蛭素。進而用紫杉醇水蛭素大、小兩個濃度對LPS誘導的HCASMC炎癥細胞模型進行干預，運用Q-PCR、Western blot法檢測紫杉醇水蛭素干預后炎癥通路中TLR4、MyD88蛋白和基因表達變化，結果發(fā)現：紫杉醇水蛭素支架涂層復合物干預HCASMC后可使炎性活化的TLR4-MyD88通路關鍵蛋白表達受到抑制，具體表現為通路上游節(jié)點的TLR4和MyD88蛋白表達量下降，顯著抑制LPS啟動的炎癥反應。我們進一步對各位點的基因表達變化進行分析，結果發(fā)現，TLR4基因表達量在紫杉醇水蛭素支架涂層復合物干預后明顯下調，且變化程度與對應的蛋白表達變化基本一致，而MyD88的基因表達不受紫杉醇水蛭素干預的影響，但蛋白表達卻受紫杉醇水蛭素的抑制作用十分顯著，且呈現出一定的劑量依賴性。這給我們一個重要啟示：紫杉醇水蛭素支架涂層復合物的抗炎機制，可能與其對MyD88蛋白水平的調控有關。因此我們的后續(xù)研究將鎖定MyD88位點，采用基因敲減或蛋白酶解調控等手段，對紫杉醇水蛭素支架涂層復合物的抗炎靶點和作用機制進行深入挖掘。