妊娠期高血壓疾病中晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體、基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達關(guān)系的研究

陳益民，李玲，曾艷萍，姚晨平

子癇前期是妊娠期特有的疾病，發(fā)生率占妊娠女性的2%~8%，嚴重威脅母嬰健康，居我國孕產(chǎn)婦死亡原因的第二位[1]。妊娠期高血壓疾病包括妊娠期高血壓、子癇前期及子癇等，多發(fā)生在妊娠20周至產(chǎn)后2周內(nèi)[2]。由于血壓驟然升高，可使腦、腎、肝多臟器受損，孕婦可能出現(xiàn)胎盤早剝、大出血等，每年死于妊娠高血壓疾病的患者大約有50萬左右；對于胎兒的并發(fā)癥更為嚴重，可導致胎兒的宮內(nèi)發(fā)育遲緩、宮內(nèi)窘迫、早產(chǎn)，甚至死亡[3]。妊娠高血壓疾病對家庭及社會都會造成嚴重負擔。減少妊娠高血壓疾病，降低孕產(chǎn)婦死亡率已成為世界衛(wèi)生組織千年發(fā)展的目標。

子癇前期與母胎間免疫不耐受、炎癥及血管內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)[4-6]。研究表明，過度的炎性反應在子癇前期發(fā)病中發(fā)揮重要作用[7]。過度炎癥反應導致內(nèi)皮細胞損傷，使血管通透性增加，蛋白丟失，從而出現(xiàn)子癇前期。晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）及其受體（RAGEs）在胎盤滋養(yǎng)細胞和血管內(nèi)皮細胞有大量表達。AGEs與RAGEs受體結(jié)合后，引起細胞內(nèi)氧化應激，促進各種炎癥因子大量表達。細胞因子及炎癥因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β1等可下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的表達；同時一些炎癥因子能誘導產(chǎn)生基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物（TIMP），從而抑制MMP發(fā)揮作用[8]。本研究通過檢測不同孕期孕婦外周血和胎盤糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）、糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGEs）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）的表達水平，探討三者在妊娠期高血壓疾病發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月~2016年12月于解放軍第421醫(yī)院進行產(chǎn)前唐氏篩查的孕婦300例，定期追蹤孕婦的妊娠情況，獲得子癇前期7例，妊娠期高血壓10例；同時選取妊娠結(jié)局正常、足月分娩、無任何并發(fā)癥的16例孕婦為對照組。排除標準：慢性高血壓；系統(tǒng)性紅斑狼瘡；糖尿病及妊娠期糖尿?。粐乐匦姆渭膊〖案文I功能不全等。且各組病例均為單胎妊娠孕婦。所有入選病例均符合納入標準，簽署知情同意書。經(jīng)統(tǒng)計分析，各組孕婦妊娠中期采血時，各相關(guān)考察指標均無顯著性差異（P＞0.05）（表1）。

1.2 樣本的采集 進行唐氏篩查的孕婦上午7時~11時空腹抽靜脈血，然后室溫條件下離心（3000 r/min，8 min），取上清液置-80℃冰箱保存。

1.3 血清中AGEs、RAGEs及MMP-9濃度 采用雙抗體夾心ELISA法測定孕婦血清中AGEs、RAGEs、MMP-9濃度。AGEs、RAGEs檢測選用購自美國RB公司的ELISA試劑盒；MMP-9檢測選用上海藍基生物公司的ELISA試劑盒。操作步驟為：①解凍標本：從-80℃冰箱中取出樣本，放置室溫解凍。②按照ELISA試劑盒操作：從4℃冰箱中取出試劑盒，放置室溫20 min。具體實驗操作嚴格按各說明書進行。③酶標儀（美國，Thermo公司，MK3）測定吸光值。每個樣本重復測定2次，取均值。

1.4 胎盤組織中AGEs、RAGEs及MMP-9檢測經(jīng)產(chǎn)婦知情同意，分娩后立即在胎盤中央取2 cm×2 cm×2 cm大小的胎盤組織。用生理鹽水漂洗后置入福爾馬林溶液中固定，常規(guī)低溫石蠟包埋，連續(xù)切片。取切片，按照免疫組織化學試劑盒說明書進行操作。AGEs、RAGEs、MMP-9免疫組織化學試劑盒購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。經(jīng)DAB顯色，蘇木素復染等操作后，在顯微鏡下觀察并記錄陽性樣本數(shù)目。陽性細胞為細胞膜或細胞漿中出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒。

1.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，方差齊時，采用t檢驗，方差不齊時，采用Mann-Whitney U秩和檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用卡方檢驗，相關(guān)性分析采用pearson分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 血清中AGEs、RAGEs及MMP-9水平變化 與對照組比較，妊娠期高血壓組血清AGEs和RAGEs水平較高，MMP-9水平較低，且孕晚期時，兩組孕婦的AGEs和MMP-9水平差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組比較，子癇前期組在孕中期及孕晚期，血清AGEs和RAGEs水平升高，MMP-9表達下降，三個指標差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。子癇前期組與妊娠期高血壓組比較，血清AGEs和RAGEs水平較高，MMP-9水平較低，且孕中期和孕晚期時，RAGEs和MMP-9水平差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表2）。

2.2 相關(guān)性分析 將孕婦血清中三個指標的數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析得到，MMP-9與AGEs、RAGEs水平間均呈負相關(guān)；AGEs與RAGEs水平間呈正相關(guān)。AGEs表達水平與RAGEs水平的相關(guān)性為r=0.38 （P＜0.05），AGEs表達水平與MMP-9水平的相關(guān)性r=0.49 （P＜0.05），RAGEs水平與MMP-9水平的相關(guān)性r=0.44 （P＜0.05）。

2.3 胎盤組織中AGEs、RAGEs及MMP-9表達 各組孕婦胎盤組織中MMP-9陽性表達數(shù)量：對照組＞妊娠高血壓組＞子癇前期組；AGEs和RAGEs陽性表達數(shù)量：子癇前期組＞妊娠高血壓組＞對照組。與正常對照組相比，子癇前期組中MMP-9表達陽性染色細胞染色明顯較弱，AGEs和RAGEs表達陽性染色細胞染色明顯增強，且三指標差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。子癇前期組與妊娠期高血壓組相比，MMP-9表達陽性染色細胞染色較弱，AGEs、RAGEs表達陽性染色細胞染色較強，三指標差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。妊娠期高血壓組與對照組比較，AGEs、RAGEs及MMP-9陽性染色細胞染色差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），（表3，圖1）。

表1 各組孕婦基本情況（±s）

表1 各組孕婦基本情況（±s）

項目 對照組（n=16）妊娠期高血壓組（n=10）子癇前期（n=7）F值 P值孕周 17.2±0.816.9±0.7 16.8±0.70.4510.63年齡（歲） 27.5±3.128.4±2.5 28.1±1.70.1050.911空腹血糖（mmol/L） 4.7±0.44.5±0.4 4.6±0.30.2520.742體質(zhì)指數(shù)（kg/m2） 22.7±4.423.4±4.5 22.9±3.90.2040.811

表2 孕婦血清AGEs、RAGEs、MMP-9的表達水平

表3 AGEs、RAGEs、MMP-9在胎盤滋養(yǎng)細胞中的陽性表達比較（n，%）

圖1 胎盤組織中AGEs、RAGEs、MMP-9表達比較

3 討論

AGEs是脂類、蛋白質(zhì)與還原單糖發(fā)生非糖化反應而形成的混合物。生理條件下，AGEs不能大量形成，在血糖水平較高、腎衰、骨關(guān)節(jié)炎等情況時，能大量生成。李雙喜[9]報道，在糖尿病周圍神經(jīng)病變患者中，AGEs水平明顯增高。研究發(fā)現(xiàn)，在骨關(guān)節(jié)炎病變嚴重程度高的患者中，AGEs水平高于其他人群[10,11]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多囊卵巢綜合癥等患者外周血中AGEs水平也顯著升高[12,13]。RAGEs是AGEs研究最深入、作用最明確的受體，存在于內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞以及單核巨噬細胞等表面上。RAGEs屬于免疫球蛋白超家族成員，具有多種不同的生物效應。一方面，RAGEs參與炎癥損傷過程，通過促炎細胞因子的分泌及激活靶基因的表達；另一方面，RAGEs可促進內(nèi)皮細胞功能失調(diào)，通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶等的表達等[14]。本研究中，在孕中期和孕晚期，與對照組比較，妊娠期高血壓組和子癇前期組血清AGEs和RAGEs水平均較高。且子癇前期組與對照組比較血清AGEs和RAGEs水平差異有統(tǒng)計學意（P＜0.05）；子癇前期組與妊娠期高血壓組相比，血清RAGEs水平顯著增高（P＜0.05）。與劉云[15]及李苑等[16]關(guān)于子癇前期孕婦血清RAGEs明顯增高的報道一致。提示，AGEs-RAGEs的激活可能參與了子癇前期發(fā)生。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）是滋養(yǎng)細胞層在降解、浸潤過程中分泌的一組對血管生成、重建及改造細胞外基質(zhì)成分起主要作用的蛋白水解酶。MMP-9其中最有效的蛋白水解酶[17]。研究表明，滋養(yǎng)細胞浸潤子宮內(nèi)膜能力下降可能是妊娠期高血壓疾病發(fā)病的主要相關(guān)因素之一[18]。本研究中，與對照組比較，妊娠期高血壓組和子癇前期組血清MMP-9水平較低。且子癇前期組與對照組及妊娠期高血壓組及比較，孕婦的MMP-9表達顯著降低（P＜0.05），提示MMP-9可能是正常妊娠的重要調(diào)節(jié)因子。正常妊娠孕婦胎盤中滋養(yǎng)細胞的浸潤能力較強，利于維持胎兒正常生長發(fā)育；子癇前期組滋養(yǎng)細胞的浸潤能力下降，可能導致了血管功能異常，使胎盤血流灌注不足，缺血缺氧而引起妊娠期高血壓疾病的一系列臨床癥狀[19]。

相關(guān)分析顯示孕婦外周血中AGEs與RAGEs水平呈正相關(guān)，提示AGEs與RAGEs可能對子癇前期有協(xié)同作用。MMP-9與AGEs、RAGEs水平呈負相關(guān)，說明AGEs與RAGEs受體結(jié)合后，通過調(diào)控各種炎癥因子的表達，減少了MMP-9的生成。免疫組化結(jié)果顯示，RAGEs在血管內(nèi)皮細胞和胎盤絨毛合體滋養(yǎng)細胞中都大量表達。血管內(nèi)皮細胞上的RAGEs與AGEs結(jié)合后，能抑制MMP-9的生成，促發(fā)氧化應激和血管內(nèi)炎癥損傷反應，改變了血管內(nèi)皮細胞的形態(tài)，血管通透性增加，大量蛋白丟失，使患者血管內(nèi)皮的病理生理變化。

綜上所述，子癇前期孕婦血清和胎盤組織中AGEs和RAGEs水平高表達，MMP-9水平低表達可能是其發(fā)病的重要因素之一。因此，對妊娠高血壓患者尤其是子癇前期患者進行上述指標的監(jiān)測及調(diào)節(jié)意義較大。