miR-199a/mTOR在自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化和左心室肥厚中的作用機(jī)制研究

郝丹，周大亮，于熙瀅，張春茹，魏林

左心室肥厚（LVH）是高血壓常見(jiàn)靶器官損害之一，是高血壓患者心血管事件發(fā)生和死亡的主要危險(xiǎn)因素，約30%高血壓患者合并有LVH[1]。研究表明，LVH的病理基礎(chǔ)主要是心肌纖維化以及心肌肥大，因此抑制心肌肥大以及心肌纖維化對(duì)于治療高血壓心臟病具有積極的意義。微小RNA（miRNA）是一組長(zhǎng)度19-25bp的內(nèi)源性非編碼小RNA，其可通過(guò)與下游靶基因的3’UTR區(qū)相結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)靶基因產(chǎn)生調(diào)控作用，從而參與一系列病理生理過(guò)程。近年來(lái)有研究顯示， miRNA的表達(dá)失調(diào)或功能異常在心室肥厚的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，靶向miRNA可能作為診斷和治療LVH的新型靶點(diǎn)[2]。動(dòng)物研究表明，miR-199a在心肌肥厚大鼠中表達(dá)水平明顯升高，可能參與其發(fā)生、發(fā)展過(guò)程[3]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），是TargetScan預(yù)測(cè)的miR-199a靶基因之一，在心肌肥厚的發(fā)生中起重要作用[4]。然而，在高血壓心臟疾病中，miR-199a和mTOR的表達(dá)及調(diào)控作用未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探究miR-199a/mTOR在自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化和LVH中的作用及其機(jī)制，為高血壓心臟疾病的治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞 選取健康清潔級(jí)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）30只與清潔級(jí)正常 WKY大鼠15只進(jìn)行研究，均為12周齡，體重為200 g左右，動(dòng)物許可證號(hào)為：SYXK(魯) 2016 0025。所有動(dòng)物均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定進(jìn)行喂養(yǎng)。

H9c2心肌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素的DMEM培養(yǎng)基中于37℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑 ML-125動(dòng)物血壓測(cè)定儀購(gòu)自于南京醫(yī)用實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；vibie E9型彩色多普勒超聲儀購(gòu)自于美國(guó)GE公司；7500型qRTPCR儀器購(gòu)自于美國(guó)ABI公司；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)模儀、凝膠成像儀均購(gòu)自于美國(guó)Bio-Rad公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自于天根生化科技有限公司；RT-PCR反應(yīng)試劑盒購(gòu)自于日本Takara公司；TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystem公司；蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自美國(guó)Solarbio公司；MiR-199a、mTOR PCR引物均由廣州Invitrogen公司合成；mTOR、β-actin抗體購(gòu)自于美國(guó)R&D公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記IgG、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自于美國(guó)Jackson Immuno Resrarch公司；ECL顯影劑購(gòu)自于美國(guó)GEN-VIEW公司；miR-199a抑制劑購(gòu)自百奧邁科生物公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組 30只SHR大鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為SHR組（n=15）和抑制劑組（n=15）， 15只正常雄性WKY大鼠作為正常組（n=15）。正常組、SHR組：尾靜脈注射等量生理鹽水；抑制劑組：在SHR組基礎(chǔ)上經(jīng)尾靜脈注射10 nM miRNA199a抑制劑20 μl，每周注射2次，連續(xù)注射4周。

1.3.2 超聲心動(dòng)圖檢測(cè) 腹腔注射10% 3 ml/kg水合氯醛麻醉大鼠，將大鼠胸部毛發(fā)除凈后進(jìn)行左側(cè)位固定，采用彩色多普勒超聲診斷儀對(duì)左心室舒張/收縮末期內(nèi)徑（LVEDD/LVESD）、左心室后壁厚度（LVPWT）、室間隔厚度（IVST）進(jìn)行測(cè)量，同時(shí)計(jì)算心肌縮短分?jǐn)?shù)（FS）以及左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。

1.3.3 血壓檢測(cè) 在大鼠安靜清醒的狀態(tài)下，使用尾動(dòng)脈容積法檢測(cè)大鼠血壓，以收縮壓作為觀察指標(biāo)（單位：mmHg）：將大鼠尾置于氣囊內(nèi)，逐漸升高氣囊內(nèi)壓力壓迫尾動(dòng)脈，使血流不能通過(guò)。利用光電傳感器探測(cè)末稍血流狀態(tài)，當(dāng)末稍血流停止時(shí)氣囊內(nèi)壓力即為尾動(dòng)脈收縮壓。

1.3.4 左心室功能、左心室重量及左心室質(zhì)量指數(shù)測(cè)定 大鼠腹腔麻醉后，右頸總動(dòng)脈插管，導(dǎo)管從右頸總動(dòng)脈插入后逆向進(jìn)入左心室中，導(dǎo)管末端連接血壓換能器，記錄左心室壓力最大升高或降低速率（+dp/dt，-dp/dt）、左心室舒張末期內(nèi)壓（LVEDP）。心功能指標(biāo)測(cè)定結(jié)束后，斷頭處死大鼠，取出心臟先剪去周圍大血管，吸干血液，再剪去心房和右心室游離壁，測(cè)定左心室重量（LVM），并計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)（LVMI），LVMI=LVM/體質(zhì)量。稱重結(jié)束后，將心臟組織保存于-80℃冰箱中進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3.5 心肌組織染色 HE染色：取出保存心肌組織，常規(guī)制備心肌組織石蠟切片，將石蠟切片置于二甲苯中固定30 min，隨后在100%、95%、85%、75%的乙醇溶液中各脫水5 min，水洗后滴加蘇木素染色10 min，置于1%鹽酸5 s后水洗。滴加伊紅染液染色3 min，隨后在75%、85%、95%、100%乙醇中各脫水2 min，滴加二甲苯透明處理，最后用中性樹(shù)脂進(jìn)行封片。顯微鏡下觀察心肌組織變化，每張切片挑選5個(gè)清晰視野，統(tǒng)計(jì)視野中心肌纖維化情況，無(wú)心肌纖維化為0分，纖維化區(qū)域比例＜25%為1分，纖維化區(qū)域比例25%~50%記為2分，51%~75%記為3分，＞75%記為4分。

Masson染色：石蠟切片加入二甲苯進(jìn)行脫蠟，在100%、95%、85%、75%乙醇中各脫水5 min后，流水清洗后進(jìn)行鉻化處理，滴加蘇木精染色5 min，水洗后在鹽酸中酸化5 s，再次水洗后滴加麗春紅染液染色5 min，滴加2%冰醋酸進(jìn)行清洗，置于1%磷鉬酸中5 min，加入苯胺藍(lán)染色5 min，滴加2%冰醋酸清洗后加入無(wú)水乙醇進(jìn)行脫水處理，最后進(jìn)行透明、封片。采用Metic Med 6.0軟件計(jì)算心肌膠原纖維所占比例（CVF），CVF=膠原面積/總面積×100%

1.3.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染試劑、miR-199a陰性對(duì)照質(zhì)粒、miR-199a mimis質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至H9c2細(xì)胞，命名空白對(duì)照組、miR-199a陰性轉(zhuǎn)染組、miR-199a過(guò)表達(dá)組，轉(zhuǎn)染后置于37℃、5%CO2中培養(yǎng)48 h，隨后收集細(xì)胞上清，進(jìn)行后續(xù)測(cè)定。

1.3.7 熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定 用miR-199a-mimic或miR-NC和psiCHECK2-mTOR1 3 "-UTR-Wt或psiCHECK2-mTOR 3 "-UTR-Mut分別共轉(zhuǎn)染H9c2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，采用熒光酶素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其活性的變化。

1.3.8 實(shí)時(shí)定量PCR（ qRT-PCR） 采用RNA試劑盒從冷凍心臟組織及心肌細(xì)胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用qRT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為20 μl：SYBR Premix 10 μl，cDNA 1 uL，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl。反應(yīng)程序：95℃ 30 s，95℃15 s，72℃ 15 s，共循環(huán)40次。以U6和GADPH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-199a和mTOR mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.9 蛋白免疫印跡法（WB） 采用RIPA（Beyotime）裂解心臟組織和心肌細(xì)胞，裂解反應(yīng)30 min，離心后收集上清液，提取細(xì)胞總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行12%的SDSPAGE電泳，上樣量體積含20 μg蛋白。電泳結(jié)束后將目的膠至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉轉(zhuǎn)好的PVDF膜1 h，TBST溶液洗膜后，4℃搖床孵育稀釋好的mTOR及內(nèi)參β-actin抗體過(guò)夜，TBST清洗后加入二抗，室溫下放置2 h，TBST清洗后ECL顯色，置于凝膠成像儀中觀察蛋白表達(dá)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）描述，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用方差分析；采用pearson相關(guān)性分析評(píng)估m(xù)iR-199a與mTOR的相關(guān)性；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠左心室功能、室壁厚度的比較 三組大鼠LVEF、FS相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組相比，SHR組LVEDD、LVESD、IVST、LVPWT均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與SHR組相比，抑制劑組LVEDD、LVESD、IVST、LVPWT均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

2.2 三組大鼠血壓、左心室功能、質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定結(jié)果比較 與正常組相比，SHR組收縮壓、LVM、LVMI、LVEDP升高，+dp/dt、-dp/dt均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與SHR組相比，抑制劑組收縮壓、LVM、LVMI、LVEDP降低，+dp/dt、-dp/dt升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

2.3 大鼠左心室心肌膠原變化情況 HE、Masson結(jié)果顯示，正常組小鼠心肌細(xì)胞形態(tài)正常，膠原纖維排列較整齊；SHR組心肌間質(zhì)纖維排列疏松且出現(xiàn)明顯纖維化，纖維增多、增粗；抑制劑組膠原纖維有所減少。與對(duì)照組相比，SHR組病理學(xué)評(píng)分、心肌膠原纖維比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與SHR組相比，抑制劑組病理學(xué)評(píng)分、心肌膠原纖維降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖1、表3）。

2.4 心肌組織中miR-199a、mTOR表達(dá)情況 與正常組相比，SHR組miR-199a mRNA表達(dá)升高，mTOR 的mRNA及蛋白表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）；與SHR組相比，抑制劑組miR-199a mRNA表達(dá)降低，mTOR的 mRNA及蛋白表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05）（圖2、表4）。

2.5 SHR大鼠心肌組織中miR-199a、mTOR相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，miR-199a與mTOR 的mRNA和蛋白表達(dá)均呈顯著性負(fù)相關(guān)（r=-4.873，P=0.000；r=-5.126，P=0.000）（圖3）。

2.6 轉(zhuǎn)染miR-199a后心肌細(xì)胞中miR-199a、mTOR表達(dá)情況 與空白對(duì)照組、陰性轉(zhuǎn)染組相比，miR-199a過(guò)表達(dá)組miR-199a mRNA表達(dá)升高，mTOR的mRNA及蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)時(shí)左心室舒張功能下降與心肌纖維化及左心室肥厚密切相關(guān)。

表1 三組大鼠左心室功能、室壁厚度比較

表2 三組血壓、左心室功能、質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定對(duì)比

圖1 心肌組織病理染色（100×）

表3 三組左心室心肌膠原情況比較

圖2 心肌組織中 mTOR蛋白表達(dá)情況

表4 三組心肌組織中miR-199a、mTOR表達(dá)情況

圖3 miR-199a、mTOR相關(guān)性分析

圖4 轉(zhuǎn)染后 mTOR蛋白表達(dá)情況

微小RNA（miRNA）是一組長(zhǎng)度19-25bp的計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4、表5）。

2.7 熒光素酶載體活性檢測(cè)結(jié)果 生物信息學(xué)庫(kù)TargetScan與miRnada預(yù)測(cè)miR-199a與mTOR 3’UTR基因配對(duì)區(qū)域見(jiàn)下圖5。在轉(zhuǎn)染3’UTRWt的細(xì)胞中，與陰性轉(zhuǎn)染組（2.23±0.85）相比，miR-199a過(guò)表達(dá)組組熒光素酶活性（1.07±0.37）顯著降低（t=3.065，P=0.012）。而在轉(zhuǎn)染3’UTR-Mut的細(xì)胞中，miR-199a過(guò)表達(dá)組與陰性轉(zhuǎn)染組熒光素酶活性對(duì)比[（1.17±0.52）vs.（1.21±0.38）]，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.152，P=0.882）（圖5）。

表5 心肌細(xì)胞中miR-199a mRNA、mTOR 的mRNA及蛋白表達(dá)情況

圖5 miR-199a與mTOR 3’UTR基因配對(duì)區(qū)域

3 討論

高血壓患者由于心臟負(fù)荷增加可導(dǎo)致心肌肥厚，隨病變進(jìn)展會(huì)出現(xiàn)心腔擴(kuò)大并最終引起充血性心力衰竭。同時(shí)，心肌間質(zhì)也會(huì)發(fā)生重建，主要表現(xiàn)為高血壓心肌纖維化和左心室肥厚（LVH）。高血壓左心室肥厚在宏觀上表現(xiàn)為心室壁的增厚及心肌重量的增加，在組織學(xué)上表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大和心肌纖維化。使心肌收縮、舒張僵硬度增加，從而導(dǎo)致心肌收縮、舒張功能的下降，還可導(dǎo)致心律失常，因此，抑制心肌肥大以及心肌纖維化對(duì)于治療高血壓心臟病具有積極的意義[5-7]。

SHR大鼠的高血壓自發(fā)率為100%，此外，與人類高血壓病十分類似，是目前研究高血壓病發(fā)病機(jī)制和篩選降壓藥物較為理想的動(dòng)物模型[8]。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，SHR組LVEDD、LVESD、IVST、LVPWT均升高，結(jié)果提示SHR大鼠出現(xiàn)左心室肥厚，表明高血壓心臟負(fù)荷增加與心肌肥厚的發(fā)生密切相關(guān)。進(jìn)一步研究顯示，與正常組相比，SHR組LVM、LVMI、LVEDP升高，+dp/dt、-dp/dt顯著降低，說(shuō)明SHR組大鼠左心室肥厚且舒張功能下降，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似[9,10]。分析舒張功能降低的原因可能與心肌膠原纖維沉積有關(guān)，研究顯示，SHR組大鼠心肌病理評(píng)分以及心肌膠原比例較正常組顯著升高，表明SHR組大鼠心肌出現(xiàn)纖維化，與以往研究結(jié)果相似[11,12]。以上研究結(jié)果均提示，高血壓內(nèi)源性非編碼小RNA，其可通過(guò)與下游靶基因的3’UTR區(qū)相結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)靶基因產(chǎn)生調(diào)控作用，從而參與一系列病理生理過(guò)程[13]。miR-199a主要在心肌組織中表達(dá)，研究顯示，miRNAs通過(guò)調(diào)控心肌肥厚有關(guān)信號(hào)通路，從而在心肌肥厚發(fā)生、發(fā)展中起重要作用[14-17]。我們?cè)赟HR大鼠中的研究結(jié)果顯示，與SHR組相比，miR-199a抑制劑組LVEDD、LVESD、IVST、LVPWT、LVM、LVMI、LVEDP均降低，+dp/dt、-dp/dt顯著升高，說(shuō)明抑制miR-199a的表達(dá)后能夠有效降低左心室肥厚，提示miR-199a可能參與高血壓誘導(dǎo)的左心室肥厚的發(fā)生、發(fā)展。組織染色結(jié)果顯示，抑制劑組大鼠心肌病理評(píng)分及心肌膠原比例均較SHR組降低，表明抑制miR-199a后能夠有效抑制心肌纖維化，提示miR-199a可能與SHR大鼠心肌纖維化有關(guān)。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是在進(jìn)化過(guò)程中相對(duì)保守的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，主要通過(guò)形成mTOR復(fù)合體1和mTOR復(fù)合體2在細(xì)胞生存、生長(zhǎng)代謝、細(xì)胞增殖、細(xì)胞極性、蛋白合成、自噬及應(yīng)激等方面發(fā)揮重要作用[18-20]。有研究顯示，mTOR參與對(duì)Ⅰ型膠原的調(diào)控，因此在心肌纖維化中可能起一定的作用。本研究結(jié)果顯示，與正常組相比，SHR組大鼠心肌組織中mTOR水平明顯降低，而miR-199a抑制劑組mTOR水平明顯升高。進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)性分析顯示，miR-199a與mTOR呈顯著性負(fù)相關(guān)。生物學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，在mTOR mRNA的3’UTR中存在miR-199a作用的靶位點(diǎn)。為探究二者是否為靶向調(diào)控，本研究在體外心肌細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示，與miR-199a陰性轉(zhuǎn)染組熒光素酶載體活性相比，miR-199a過(guò)表達(dá)組熒光素酶載體活性顯著降低，說(shuō)明miR-199a是靶向mTOR的調(diào)節(jié)分子之一，能夠通過(guò)與mTOR的mRNA 3’UTR內(nèi)的位點(diǎn)結(jié)合，下調(diào)mTOR基因表達(dá)。這些結(jié)果表明，miR-199a可能通過(guò)調(diào)控mTOR表達(dá)而參與SHR左心室肥厚、心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展及病情演變。

綜上所述，miR-199a表達(dá)上調(diào)可能通過(guò)調(diào)控mTOR參與SHR左心室肥厚、心肌纖維化的發(fā)生進(jìn)展，推測(cè)miR-199a與mTOR可能是SHR左心室肥厚、心肌纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的重要分子。然而，SHR心肌病變的發(fā)生機(jī)制極其復(fù)雜，miR-199a對(duì)mTOR的調(diào)控作用及其對(duì)疾病發(fā)生進(jìn)展的具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步深入探究。