利用“網(wǎng)包法”制備高效液相色譜大環(huán)抗生素類手性固定相

何義娟, 李克麗, 李 倩, 張 鵬, 艾 萍, 袁黎明

(云南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 昆明 650500)

手性是自然界中真實(shí)而普遍存在的現(xiàn)象,是自然界的基本屬性[1],手性問題涉及農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、材料、食品等諸多領(lǐng)域[2,3]。手性藥物雖有相同的理化性質(zhì),但生物活性和藥理作用等方面卻存在差異,甚至表現(xiàn)出截然相反的效果[4]。例如,左旋巴比妥酸鹽抑制神經(jīng)活動(dòng),而右旋巴比妥酸鹽卻興奮神經(jīng);右旋甲狀腺素鈉可降低血脂,而左旋甲狀腺素鈉對(duì)心臟有毒副作用[5]。由于手性分子生物活性不同,所以手性分離分析就顯得十分重要[6]。

界面聚合法是高分子制備中的一種常用方法,分別將兩種高活性的單體分散在互不相溶的兩相中[7],兩種單體在兩相的界面處發(fā)生縮聚反應(yīng)而生成高分子。常用的活性單體如多元胺、多元醇和多元酚等常溶于水相,多元酰氯和多元異氰酸酯等常溶于有機(jī)(油)相。在膜科學(xué)及技術(shù)領(lǐng)域,界面聚合法也是反滲透和納濾等聚合物分離膜的實(shí)驗(yàn)室以及工業(yè)級(jí)制備的最主要方法,尤其是以哌嗪或者間苯二胺為單體、多元酰氯或者多元異氰酸酯為交聯(lián)劑制備的復(fù)合膜由于膜性能十分優(yōu)良而在生產(chǎn)實(shí)際中廣泛使用[8-11]。

大環(huán)抗生素類化合物[12]的相對(duì)分子質(zhì)量大約在660～2 200 Da之間,分子中包括親水基團(tuán)、疏水基團(tuán)和眾多的可解離基團(tuán),其分子具有一定空間的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和多個(gè)手性活性中心,能與手性客體分子發(fā)生多種作用,如π-π作用、包合作用、氫鍵之間作用、偶極-偶極相互作用、疏水作用、空間位阻作用等[13,14]。自1994年Armstrong等[15]首次用大環(huán)抗生素作為手性選擇劑應(yīng)用于HPLC以來,相繼報(bào)道了替考拉寧、利福霉素B、硫鏈絲菌素、去甲萬古霉素、瑞斯托菌素A等作為液相色譜手性固定相[16-18]。

目前已有文獻(xiàn)[19,20]報(bào)道將萬古霉素和替考拉寧通過共價(jià)鍵鍵合在硅膠基質(zhì)上制備色譜手性固定相。本文以萬古霉素和替考拉寧為手性選擇劑,哌嗪為單體,4,4′-二苯基甲烷二異氰酸酯(MDI)、1,6-己二異氰酸酯(HDI)和2,4-甲苯二異氰酸酯(TDI)為交聯(lián)劑,通過界面聚合反應(yīng)形成網(wǎng)狀層包裹硅膠載體,制得6種高效液相色譜手性固定相,用于分離外消旋化合物,并與MDI直接交聯(lián)萬古霉素和替考拉寧在硅膠表面所得固定相進(jìn)行了分離性能的比較。研究還同時(shí)考察了色譜條件對(duì)手性色譜柱分離性能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

高效液相色譜儀配有P1201紫外檢測(cè)器、P1201恒流泵、ZW1201色譜柱溫箱和EC-2006型色譜工作站(大連依利特分析儀器有限公司);純水器(英國(guó)ELGA Lab Water公司); As3120超聲波清洗儀(天津Autoscience公司); 250 mm×2.0 mm型不銹鋼液相色譜空柱(美國(guó)Alltech公司);掃描電鏡(荷蘭FEI Quanta 200公司);液相色譜勻漿法裝柱機(jī)(美國(guó)Alltech公司)。

替考拉寧(純度≥90%)購(gòu)于孝感深遠(yuǎn)化工有限公司;萬古霉素(純度≥90%)購(gòu)于蘇州法母進(jìn)出口有限公司;MDI(純度97%)購(gòu)于日本TCI公司;HDI(純度99%)購(gòu)于美國(guó)Alfa Aesar公司;TDI(純度98%)購(gòu)于山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;哌嗪(純度99%)購(gòu)于上海Adamas-beta公司;球型硅膠YQG80(青島美高化工有限公司);正己烷、異丙醇、無水乙醇、甲醇、乙腈購(gòu)于天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司,所有試劑均為分析純。所用的外消旋化合物:氧氟沙星、1,2-二苯基乙二醇、扁桃酸、D,L-苯丙氨酸、反-1,2-二苯基環(huán)氧乙烷、3-芐氧基-1,2-丙二醇、特羅格爾堿、D,L-組氨酸、1-(9-蒽基)-2,2,2-三氟乙醇、華法林、馬來酸氯苯那敏、阿替洛爾、美托洛爾、氨氯地平、氟比洛芬、吡喹酮、萘普生購(gòu)于美國(guó)Fluka公司,純度均≥99%; D,L-天冬氨酸、D,L-丙氨酸、1,2-二苯基乙醇酮、二氫黃酮、D,L-精氨酸、D,L-絲氨酸、D,L-賴氨酸、D,L-對(duì)羥基苯甘氨酸、D,L-脯氨酸、D,L-亮氨酸、D,L-苯甘氨酸、D,L-半胱氨酸購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich試劑公司,純度均≥99%;聯(lián)糠醛、布洛芬、鹽酸克倫特羅、沙丁胺醇、1,1′-聯(lián)-2-萘酚、3,5-二硝基苯甲酰基(DNB)-亮氨酸、鹽酸普萘洛爾、1-對(duì)氯苯基乙醇、D,L-纈氨酸、佐匹克隆、硫酸特布他林、奧美拉唑、酮洛芬、四米唑均購(gòu)于比利時(shí)Acros公司,純度均≥99%。

1.2 手性固定相的制備

界面聚合反應(yīng)受很多因素的影響,例如手性選擇劑和單體以及交聯(lián)的量、兩相溶劑的種類、化學(xué)反應(yīng)時(shí)間和溫度等。通過大量的界面聚合反應(yīng)、成膜現(xiàn)象觀察、膜的穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度試驗(yàn),篩選出以下手性固定相制備的“網(wǎng)包法”或交聯(lián)法,具體實(shí)驗(yàn)步驟如下。

1.2.1替考拉寧手性固定相的制備

稱取2.0 g替考拉寧和1.0 g哌嗪于50 mL容量瓶中配制成水溶液,并滴加2 mL三乙胺。稱取3.0 g硅膠于燒杯中,加入上述配制的水溶液,浸泡一段時(shí)間后將多余的液體除去,室溫下晾干;稱取1.0 g MDI于50 mL容量瓶中,配制成正己烷有機(jī)溶液,待硅膠剛好晾干,加入一定量配制好的MDI正己烷溶液,浸泡1 h。倒出多余液體,于110 ℃烘箱中熱處理15 min,即制得CSP-A。圖1是“網(wǎng)包法”制備CSP-A的原理示意圖。

在界面聚合法制備高分子復(fù)合膜中哌嗪是最經(jīng)典的反應(yīng)單體之一。由于手性劑萬古霉素和替考拉寧分子結(jié)構(gòu)中伯胺數(shù)量較少,為了在硅膠表面聚合一層性能穩(wěn)定的高分子膜使萬古霉素或者替考拉寧能牢固地固載在硅膠的表面,因此在圖1的反應(yīng)中加入了哌嗪?jiǎn)误w參加界面聚合反應(yīng)。

同時(shí)運(yùn)用上述方法以HDI作為交聯(lián)單體制得CSP-C;以TDI作為交聯(lián)單體制得CSP-E;另外,采用直接交聯(lián)法制得CSP-G,其制備過程與CSP-A相似,但水溶液中沒有加入哌嗪。

圖 1 “網(wǎng)包法”制備替考拉寧-4,4′-二苯基甲烷二異氰酸酯的示意圖Fig. 1 Schematic representation of the preparation of teicoplanin-4,4′-diphenyl-methane-diisocyanate chiral stationary (MDI) by wrapping with a netT: backbone of teicoplanin; RT: room temperature; R: alkyl.

1.2.2萬古霉素手性固定相的制備

“網(wǎng)包法”萬古霉素手性固定相的制備過程和1.2.1節(jié)過程相似,均采用萬古霉素作為手性識(shí)別劑,其中MDI作為交聯(lián)單體制得CSP-B; HDI作為交聯(lián)單體制得CSP-D; TDI作為交聯(lián)單體制得CSP-F。與此同時(shí),采用直接交聯(lián)法制得CSP-H,其制備過程與CSP-B相似,但水溶液中沒有加入哌嗪。

1.3 手性柱的填裝

液相色譜柱的填裝采用高壓勻漿法,稱取2.0 g制備好的手性固定相倒入23 mL正己烷溶液,懸浮均勻,快速倒進(jìn)勻漿罐中。用正己烷∶異丙醇=(9∶1, v/v)為頂替液,在40～50 MPa壓力下裝柱5 min,然后將壓力調(diào)至25 MPa,保持30 min,緩慢減至常壓,然后安裝好篩板和柱頭即可。

1.4 色譜條件

流動(dòng)相分別為正己烷∶異丙醇=9∶1(v/v)、乙腈∶水=6∶4(v/v)、甲醇∶水=6∶4(v/v)、甲醇∶水=2∶8(v/v)、無水乙醇、高純水和甲醇;流速為0.1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm或230 nm;柱溫為25 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 手性固定相的掃描電鏡表征

為了觀察6種手性固定相在硅膠表面的固載情況,取一定量的純硅膠和6種手性固定相進(jìn)行掃描電鏡表征,如圖2所示,a～g分別是純硅膠、CSP-A、CSP-B、CSP-C、CSP-D、CSP-E和CSP-F的掃描電鏡圖。通過圖2a與圖2b～2g對(duì)比可知,聚合后的硅膠表面上附著高分子聚合物,表明成功制備了6種手性固定相。圖2a和2d中的數(shù)值分別表示純硅膠和固定相C的直徑,隨機(jī)選取了形貌較好的硅膠進(jìn)行標(biāo)注。

2.2 手性固定相的紅外表征

為了觀察6種手性固定相有沒有發(fā)生界面聚合反應(yīng),分別取一定量的純硅膠和6種手性固定相進(jìn)行傅里葉紅外光譜法測(cè)定,其結(jié)果如圖3所示。圖3中1～7分別為純硅膠、CSP-A、CSP-B、CSP-C、CSP-D、CSP-E和CSP-F的紅外譜圖?？梢钥闯鱿啾葓D中純硅膠的紅外譜圖,曲線2～7在1 631～1 645 cm-1處的峰是脲基中的C=O的伸縮振動(dòng)吸收峰或是締合酰胺羰基的伸縮振動(dòng)峰；2 833 cm-1處的峰是亞甲基、次甲基的CH鍵伸縮振動(dòng)譜帶,手性選擇劑與交聯(lián)劑發(fā)生了反應(yīng),有聚合物生成。在2 200 cm-1處無吸收峰,說明異氰酸根N=C=O已經(jīng)完全反應(yīng)完。通過紅外表征,說明手性選擇劑與交聯(lián)劑發(fā)生了界面聚合反應(yīng),并且在反應(yīng)過程中異氰酸酯都反應(yīng)完全。

圖 2 純硅膠和6種手性固定相的掃描電鏡圖Fig. 2 Scanning electronic microscopy (SEM) images of the pure silica gel and six chiral stationary phasesa. pure silica gel; b. CSP-A; c. CSP-B; d. CSP-C; e. CSP-D; f. CSP-E; g. CSP-F.

圖 3 6種手性固定相與純硅膠的紅外對(duì)比圖Fig. 3 IR spectra comparison of the six chiral stationary phases and pure silica gel 1. pure silica gel; 2. CSP-A; 3. CSP-B; 4. CSP-C; 5. CSP-D; 6. CSP-E; 7. CSP-F.

2.3 手性柱的手性拆分能力

為了考察10種手性柱對(duì)外消旋化合物的手性分離能力,在一定的色譜條件下,對(duì)一系列手性化合物進(jìn)行了拆分研究。表1是外消旋化合物的拆分?jǐn)?shù)據(jù),圖4是部分手性化合物的拆分譜圖,試驗(yàn)結(jié)果表明,制備的8種手性柱對(duì)手性化合物都具有一定的拆分能力,并與商品柱(Chirobiotic T和Chirobiotic V)具有互補(bǔ)性。

在表1中,實(shí)驗(yàn)室自制的8根手性柱從CSP-A至CSP-H,均分別以正己烷∶異丙醇=9∶1(v/v)、乙腈∶水=6∶4(v/v)、甲醇∶水=6∶4(v/v)、無水乙醇、高純水為流動(dòng)相,而對(duì)于兩根商品柱則采用公司推薦的流動(dòng)相甲醇∶水=2∶8(v/v)和甲醇。從表1中可以看出,“網(wǎng)包法”制備的萬古霉素手性柱CSP-B、CSP-D、CSP-F分別能拆分18、10、7對(duì)外消旋體,交聯(lián)法制備的萬古霉素手性柱CSP-H能拆分9對(duì)外消旋體,萬古霉素商品柱Chirobiotic V僅拆分了4對(duì)外消旋體,因此“網(wǎng)包法”制備的手性柱明顯優(yōu)于交聯(lián)柱,而交聯(lián)柱又明顯優(yōu)于商品柱。另外,“網(wǎng)包法”制備的替考拉寧手性柱CSP-A、CSP-C、CSP-E分別能拆分10、14、9對(duì)外消旋體,交聯(lián)法制備的替考拉寧手性柱CSP-G能拆分9對(duì)外消旋體,替考拉寧商品柱Chirobiotic T能拆分開24對(duì)外消旋體,明顯地替考拉寧商品柱優(yōu)于自制網(wǎng)包柱和交聯(lián)柱,而網(wǎng)包柱又好于交聯(lián)柱。但從表1中又可見,有11對(duì)商品柱Chirobiotic T不能拆分的外消旋體,利用自制的替考拉寧柱卻又能被拆分開,因此這些柱彼此之間具有很好的互補(bǔ)性。

圖4是每種手性柱分別選取的一個(gè)代表性的色譜分離譜圖,從圖中可見商品柱的柱效明顯高于網(wǎng)包柱和交聯(lián)柱。產(chǎn)生的原因一方面是因?yàn)椴捎玫慕缑婢酆戏ㄔ诠枘z表面包裹了一層高分子,使球形硅球表面形狀有所改變,一定程度影響了分離柱效。另一方面可能是因?yàn)樵诠枘z表面引入了更多的極性基團(tuán),導(dǎo)致手性識(shí)別過程中的可逆性作用變差。除此之外,柱效還與待拆分的具體手性樣品的性能相關(guān),在報(bào)道的很多利用鍵合臂制備的手性固定相如Pirkle、環(huán)糊精、配體交換手性柱中,也有較多的低柱效柱。尤其是現(xiàn)在研究和應(yīng)用范圍最廣的多糖型手性固定相,其柱效也不高。但不管怎樣,“網(wǎng)包法”制備色譜柱還可有更多的條件和參數(shù)有待優(yōu)化、其選擇性和柱效還有較大的提升空間,進(jìn)一步的研究正在進(jìn)行中。

表 1 手性樣品在10種手性柱上的拆分結(jié)果Table 1 Resolution results of the chiral samples on the ten chiral columns

表 1 (續(xù))Table 1 (Continued)

k1′: retention factor;α: separation factor;Rs: resolution; -: not separated. The mobile phases are: (a)N-hexane∶isopropanol=9∶1 (v/v); (b) acetonitrile∶water=6∶4 (v/v); (c) methanol∶water=6∶4 (v/v); (d) methanol∶water=2∶8 (v/v); (e) absolute ethanol; (f) high purity water; (g) methanol.

圖 4 10種手性柱對(duì)代表性化合物的拆分譜圖Fig. 4 Resolution spectra of typical compounds using the ten chiral columns

2.4 不同流動(dòng)相對(duì)手性柱分離外消旋化合物的影響

不同流動(dòng)相對(duì)手性柱分離外消旋化合物具有不同程度的影響,圖5顯示了不同的流動(dòng)相在萬古霉素-MDI柱上拆分氧氟沙星、1-(9-蒽基)-2,2,2-三氟乙醇、氨氯地平、D,L-苯丙氨酸的色譜圖。在高純水作為流動(dòng)相時(shí)這些化合物都有不同程度的分離,甚至D,L-苯丙氨酸在高純水流動(dòng)相下分離效果更好,表現(xiàn)出了這些柱子作為全水手性色譜柱的潛力。

2.5 流速和進(jìn)樣量對(duì)手性柱分離外消旋化合物的影響

圖6a和6b分別為流速和進(jìn)樣量對(duì)萬古霉素-MDI手性柱分離外消旋化合物的影響。隨著流動(dòng)相流速的增加,分離效果逐漸變差。隨著進(jìn)樣量的增加,兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體的峰面積和峰高增加,出峰的保留時(shí)間變化不大,但峰變寬,分離度有所下降。

圖 5 不同流動(dòng)相在萬古霉素-4,4′-二苯基甲烷二異氰酸酯(MDI)柱上的色譜圖Fig. 5 Chromatograms obtained using the vancomycin-MDI column with different mobile phases a. ofloxacin; b. 1-(9-fluorenyl)-2,2,2-trifluoroethanol; c. amlodipine; d. D,L-phenylalanine. Injection volume: 2 μL; flow rate: 0.1 mL/min; column temperature: 25 ℃; UV detection wavelength: 254 nm. Mobile phase for line 1 in (a)-(d): high purity water; mobile phase for line 2 in (a): N-hexane∶isopropanol=9∶1 (v/v); mobile phase for line 2 in (b)-(d): acetonitrile∶water=6∶4 (v/v).

圖 6 萬古霉素-MDI手性柱分離外消旋化合物的色譜圖Fig. 6 Chromatograms of the racemic compound separated by vancomycin-MDI chiral column a. D,L-Alanine at different flow rates; mobile phase: acetonitrile∶water=6∶4 (v/v); b. naproxen with different injection volumes; mobile phase: acetonitrile∶water=6∶4 (v/v).

3 結(jié)論

通過“網(wǎng)包法”成功制得了6種萬古霉素和替考拉寧的手性柱,它們對(duì)外消旋化合物表現(xiàn)出較好的分離能力,將其與交聯(lián)柱和商品手性柱相比較,彼此之間具有很好的互補(bǔ)性。

除此之外，“網(wǎng)包法”作為一種新穎的手性固定相的制備方法,還具有操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)快速等特點(diǎn),為新型手性高效液相色譜柱的制備探索了新的途徑。