桃仁多肽螯合亞鐵的抑菌活性及結(jié)構(gòu)表征

楊玉蓉，李安平,2,*，鐘政昌，喻舟峰

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.特醫(yī)食品加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004；3.西藏農(nóng)牧學(xué)院食品科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000）

與無(wú)機(jī)鹽補(bǔ)鐵劑相比，多肽螯合亞鐵更易被腸道吸收、生物學(xué)效價(jià)更高，是研究的熱點(diǎn)[1-2]。目前對(duì)多肽螯合亞鐵的研究多集中于螯合工藝、結(jié)構(gòu)表征和生物利用度等方面。Hoz等[3]的研究表明多肽螯合亞鐵對(duì)腸道無(wú)副作用；Jaiswal等[4]的研究顯示金屬元素與多肽螯合后能夠有效提高二價(jià)金屬的生物利用度；斯興開(kāi)[5]和Lin Huimin[6]等的研究證實(shí)帶魚(yú)多肽螯合亞鐵能夠有效改善大鼠的缺鐵性貧血癥狀；廉雯蕾等[7]的研究表明米蛋白肽螯合亞鐵具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性；紀(jì)曉雯等[8]研究酪蛋白肽螯合鐵的螯合機(jī)制，證明多肽與亞鐵離子的主要螯合位點(diǎn)是羰基。多肽螯合亞鐵除具有營(yíng)養(yǎng)特性外，同時(shí)還具有其他生物活性，如抑菌活性和抗氧化活性等[9-10]。霍健聰?shù)萚11]的研究表明帶魚(yú)下腳料酶解肽螯合亞鐵對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等均有較強(qiáng)的抑制作用。林慧敏等[12]發(fā)現(xiàn)馬鮫魚(yú)、帶魚(yú)、鳀魚(yú)、梅童魚(yú)蛋白酶解肽螯合亞鐵也有不同程度的抑菌作用。因此，本研究對(duì)桃仁脫脂后提取出的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，然后進(jìn)行超濾分離獲得各種分子質(zhì)量的多肽，將多肽與亞鐵離子螯合后，探究各多肽螯合物的抑菌活性，并采用傅里葉變換紅外光譜對(duì)多肽金屬螯合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，以期為多肽螯合亞鐵在開(kāi)發(fā)功能性食品過(guò)程中減少防腐劑的添加提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野桃仁產(chǎn)自西藏林芝；大腸桿菌ATCC25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923由中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。

大豆多肽（分子質(zhì)量小于5 000 Da） 恒發(fā)生物科技有限公司；玉米多肽、小麥多肽（分子質(zhì)量小于5 000 Da） 蘇州億貝嘉食品添加劑有限公司；氯化鈉、四水合氯化亞鐵、無(wú)水氯化鈣、七水合硫酸鎂、鹽酸羥胺、鄰菲羅啉、乙酸鈉（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；牛肉膏、蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉 北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)GOLD-SIM公司；高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；超凈工作臺(tái)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；生化培養(yǎng)箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 桃仁多肽的提取分離和不同分子質(zhì)量桃仁多肽螯合亞鐵的制備

桃仁經(jīng)脫皮和粉碎，用石油醚脫脂，得桃仁粕；桃仁粕經(jīng)堿溶酸沉、冷凍干燥后得桃仁蛋白粉；桃仁蛋白粉用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解，酶解液于8 000 r/min離心15 min；上清多肽液用超濾裝置進(jìn)一步分離，獲得3 個(gè)不同分子質(zhì)量的桃仁多肽組分PKP1（大于10 000 Da）、PKP2（5 000～10 000 Da）、PKP3（小于5 000 Da），以及未超濾組分PKH；分別將PKH、PKP1、PKP2和PKP3組分與亞鐵離子螯合，得到桃仁多肽螯合亞鐵PKH-Fe、PKP1-Fe、PKP2-Fe和PKP3-Fe；各組分冷凍干燥后于-20 ℃貯藏備用。

1.3.2 多肽螯合物的制備

桃仁多肽與亞鐵、鋅、鈣和鎂離子螯合物的制備：將分子質(zhì)量小于5 000 Da的桃仁多肽配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的溶液，然后按桃仁多肽溶液與螯合金屬鹽溶液質(zhì)量比為2∶1分別加入四水合氯化亞鐵、七水合硫酸鋅、無(wú)水氯化鈣和七水合硫酸鎂，再在加入四水合氯化亞鐵的多肽溶液中加入抗壞血酸使其最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，混合均勻后于45 ℃水浴中反應(yīng)60 min，接著加入無(wú)水乙醇沉淀，4 000 r/min離心10 min得沉淀物并干燥，干燥物分別為桃仁多肽螯合亞鐵、桃仁多肽螯合鋅、桃仁多肽螯合鈣和桃仁多肽螯合鎂粉末，于-20 ℃條件下保存。

不同植物多肽螯合亞鐵的制備：參考Huang Saibo等[13]的方法并加以修改。將分子質(zhì)量均小于5 000 Da的桃仁多肽、大豆多肽、玉米多肽和小麥多肽配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的溶液，其余操作同上。

1.3.3 多肽螯合亞鐵離子的螯合率測(cè)定

采用鄰菲羅啉比色法[14]測(cè)定多肽螯合亞鐵的亞鐵離子質(zhì)量，以不加亞鐵離子的標(biāo)準(zhǔn)液為空白對(duì)照，在波長(zhǎng)510 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（y＝0.211x-0.004 5，R2＝0.999 1），據(jù)此計(jì)算多肽螯合亞鐵中亞鐵離子質(zhì)量。螯合率的計(jì)算如下式所示。

式中：m0為反應(yīng)溶液中亞鐵離子質(zhì)量/mg；m為多肽螯合亞鐵的亞鐵離子質(zhì)量/mg。

1.3.4 菌種活化

參考Wang Fengsheng[15]的方法并稍加修改。將大腸桿菌（ATCC25922）菌種接種至牛肉膏蛋白胨（nutrient broth，NB）斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，在37 ℃下培養(yǎng)24 h后取一環(huán)菌種接至50 mL NB液體培養(yǎng)基中，再在37 ℃下培養(yǎng)24 h，制得菌落濃度為106～107CFU/mL的菌懸液，4 ℃保存待用。

金黃色葡萄球菌（ATCC25923）接種至含有2%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）瓊脂的7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基斜面進(jìn)行活化，在37 ℃下培養(yǎng)24 h后取一環(huán)菌種接至50 mL 7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基中，再在37 ℃下培養(yǎng)24 h，制得菌落濃度為106～107CFU/mL的菌懸液，4 ℃保存待用。

1.3.5 各多肽金屬螯合物抑菌活性的測(cè)定

參照da Cruz Almeida等[16]的平板打孔法測(cè)定各多肽金屬螯合物的抑菌活性。以大腸桿菌為供試菌種。分別將各種待測(cè)物配制成40 mg/mL的溶液，以ξ-聚賴氨酸為陽(yáng)性對(duì)照，無(wú)菌水為空白對(duì)照。取100 μL待測(cè)樣液加入8 mm的培養(yǎng)基加樣孔中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察并測(cè)定抑菌圈直徑。

1.3.6 多肽螯合亞鐵的最小抑菌濃度測(cè)定

參考Gomes[17]和楊靜[18]等的二倍稀釋法測(cè)定各樣品對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）并稍加修改。將待測(cè)多肽螯合亞鐵、四水合氯化亞鐵和ξ-聚賴氨酸配制成40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5 mg/mL的溶液，以ξ-聚賴氨酸為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌水為空白對(duì)照。采用平板打孔法，取100 μL待測(cè)樣液加入檢測(cè)平板孔徑為8 mm的圓孔內(nèi)，37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈直徑，以出現(xiàn)抑菌圈的最低質(zhì)量濃度為MIC。

1.3.7 傅里葉變換紅外光譜分析

參考Hou Tao等[19]的方法并稍加修改。取1～2 mg不同多肽及其金屬螯合物粉末分別與200 mg KBr置于瑪瑙研缽中混合研磨，研細(xì)后置于壓片模具上150 MPa加壓5 min。然后用IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)樣品掃描，掃描范圍4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子質(zhì)量桃仁多肽與亞鐵離子螯合物的抑菌活性及螯合率

圖 1 不同分子質(zhì)量多肽與亞鐵離子螯合物的抑菌圈直徑Fig. 1 Inhibition zone diameters of ferrous-chelating peach kernel peptides with different molecular masses

采用鄰菲羅啉比色法測(cè)得PKH-Fe、PKP1-Fe、PKP2-Fe和PKP3-Fe的亞鐵離子含量分別為（118.10±1.81）、（81.45±1.72）、（121.05±1.61）、（145.51±0.81）mg/g。從圖1中可知，分子質(zhì)量較小的PKP2-Fe和PKP3-Fe組分的抑菌圈直徑均顯著大于分子質(zhì)量較大的PKP1-Fe組分。PKP1-Fe組分和未經(jīng)分離的PKH-Fe組分抑菌圈直徑?jīng)]有顯著性差異（P＞0.05）。林慧敏等[20]研究帶魚(yú)多肽螯合亞鐵的抑菌活性時(shí)也發(fā)現(xiàn)小分子質(zhì)量（1 000～3 000 Da）的帶魚(yú)多肽螯合亞鐵的抑菌活性高于分子質(zhì)量較大（5 000～10 000、3 000～5 000 Da）和未經(jīng)超濾的多肽螯合亞鐵。桃仁多肽分子質(zhì)量與其抑菌圈直徑的相關(guān)性分析表明，兩者呈顯著負(fù)相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.862。因此可知，小分子質(zhì)量多肽與亞鐵離子的螯合物具有更強(qiáng)的抑菌活性。

圖 2 不同分子質(zhì)量桃仁多肽組分與亞鐵離子的螯合率Fig. 2 Ferrous chelating rates of peach kernel peptides with different molecular masses

由圖2可知，桃仁多肽與亞鐵離子的螯合率從大到小依次為PKP3-Fe、PKP2-Fe、PKP1-Fe，與桃仁多肽分子質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)。

2.2 桃仁多肽與不同金屬離子螯合物的抑菌活性

圖 3 桃仁多肽與不同金屬離子螯合物的抑菌圈直徑Fig. 3 Inhibition zone diameters of peach kernel peptide chelating different metal ions

從圖3可知，4 種金屬離子與多肽形成的螯合物的抑菌圈直徑之間存在顯著性差異（P＜0.05），其中桃仁多肽螯合鋅具有最大的抑菌圈直徑，達(dá)到20.63 mm，甚至高于陽(yáng)性對(duì)照ξ-聚賴氨酸，其次是桃仁多肽螯合亞鐵，其

抑菌圈直徑顯著高于未出現(xiàn)抑菌圈的桃仁多肽螯合鈣和桃仁多肽螯合鎂（P＜0.05）。桃仁多肽、空白對(duì)照、鈣離子、鎂離子均未形成抑菌圈，亞鐵離子和鋅離子具有較大的抑菌圈直徑，且當(dāng)桃仁多肽與其螯合后仍具有一定的抑菌活性。鈣離子和鎂離子與桃仁多肽螯合前后的抑菌圈直徑均沒(méi)有變化，但亞鐵離子和鋅離子與桃仁多肽螯合后的抑菌圈直徑極顯著降低（P＜0.01）。因此，推測(cè)桃仁多肽螯合亞鐵和桃仁多肽螯合鋅的抑菌活性分別與亞鐵離子、鋅離子的抑菌活性有關(guān)。此結(jié)論與林慧敏等[12]發(fā)現(xiàn)4 種低值魚(yú)蛋白酶解肽沒(méi)有抑菌活性，而經(jīng)亞鐵修飾后則出現(xiàn)不同程度的抑菌作用的結(jié)果類似。

2.3 不同植物多肽與亞鐵離子螯合物的抑菌活性

圖 4 不同植物多肽與亞鐵離子螯合物的抑菌圈直徑Fig. 4 Inhibition zone diameters of ferrous-chelating peptides from different plants

由圖4可知，桃仁多肽、大豆多肽、玉米多肽和小麥多肽均無(wú)抑菌圈形成，但當(dāng)其與亞鐵離子螯合后，螯合物的抑菌圈直徑均顯著提高（P＜0.05，P＜0.01），具有一定的抑菌活性。4 種多肽亞鐵螯合物中小麥和桃仁多肽螯合亞鐵的抑菌圈直徑較大，分別達(dá)到11.34 mm和10.97 mm，顯著大于大豆多肽螯合亞鐵和玉米多肽螯合亞鐵（P＜0.05）。

2.4 不同植物多肽與亞鐵離子螯合物的MIC

圖 5 不同植物多肽與亞鐵離子螯合物的MICFig. 5 MIC of ferrous-chelating peptides from different plants

由圖5可知，4 種植物多肽亞鐵螯合物對(duì)大腸桿菌的MIC存在顯著性差異（P＜0.05）。其中，桃仁多肽螯合亞鐵和小麥多肽螯合亞鐵的MIC最小，均為5.0 mg/mL，具有最強(qiáng)的抑菌活性；大豆多肽螯合亞鐵的MIC最大，為20.0 mg/mL，抑菌活性最弱。4 種多肽螯合亞鐵對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC也有顯著性差異（P＜0.05），桃仁多肽螯合亞鐵的MIC僅為2.5 mg/mL，顯著小于大豆、玉米和小麥多肽螯合亞鐵。桃仁多肽螯合亞鐵在4 種植物多肽亞鐵螯合物中具有對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌最強(qiáng)的抑制作用。霍健聰?shù)萚11]認(rèn)為帶魚(yú)多肽螯合亞鐵對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用，與本研究結(jié)果相似。鐘明杰[21]發(fā)現(xiàn)多肽螯合亞鐵對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌（如金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌）的抑菌效果優(yōu)于對(duì)革蘭氏陰性菌（如大腸桿菌和沙門氏菌）的抑菌效果。

2.5 桃仁多肽及其不同金屬離子螯合物的傅里葉變換紅外光譜

圖 6 桃仁多肽及其不同金屬離子螯合物傅里葉變換紅外光譜Fig. 6 FTIR spectra of peach kernel peptide and peach kernel peptide chelating different metal ions

由圖6可知，桃仁多肽與不同金屬離子螯合后，在3 300、1 550、1 400、1 100、600 cm-1附近的吸收峰與螯合前相比發(fā)生了明顯位移。在3 300 cm-1附近的寬峰屬于酰胺A帶，是由N—H的伸縮振動(dòng)導(dǎo)致的特征峰[22]。桃仁多肽螯合亞鐵離子、鋅離子、鈣離子和鎂離子后，在酰胺A帶的特征峰出現(xiàn)不同程度的紅移，可推測(cè)桃仁多肽分子中的N—H在與金屬離子螯合后形成了N—Fe、N—Zn、N—Ca和N—Mg結(jié)構(gòu)。Chen Jun等[23]通過(guò)分析羅非魚(yú)皮多肽螯合鈣的傅里葉變換紅外光譜圖得出羅非魚(yú)皮多肽分子的N—H參與形成肽鈣螯合物的結(jié)論。酰胺I帶（1 700～1 600 cm-1）主要是由C＝O伸縮振動(dòng)引起的[24-25]，N—H的彎曲振動(dòng)和C—N的伸縮振動(dòng)引起酰胺II帶（1 600～1 500 cm-1）[26]。在酰胺I帶和酰胺II帶中，桃仁多肽與桃仁螯合金屬離子特征峰有不同程度的位移，推測(cè)金屬離子與多肽分子的C＝O和N—H鍵形成了配位鍵。

1 400 cm-1附近為氨基酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)—COO-伸縮振動(dòng)引起的吸收峰[27]。桃仁多肽在此處的吸收峰位于1 396.46 cm-1處，其與不同金屬離子螯合后此處的特征峰均發(fā)生明顯的藍(lán)移，移至1 415.75～1 423.47 cm-1范圍內(nèi)，可推測(cè)有—COO—Fe、—COO—Zn、—COO—Ca和—COO—Mg結(jié)構(gòu)形成。Liu Wenying等[28]用傅里葉變換紅外光譜對(duì)鮭魚(yú)骨膠原肽螯合鈣分析時(shí)也認(rèn)為多肽分子與鈣離子形成了—COO—Ca結(jié)構(gòu)。1 100 cm-1附近的吸收峰由C—O的伸縮振動(dòng)導(dǎo)致[29]。桃仁多肽與亞鐵離子和鈣離子螯合后此處的吸收峰發(fā)生藍(lán)移，桃仁多肽與鋅離子和鎂離子螯合后此處的吸收峰紅移，由此可推測(cè)金屬離子與C—O形成C—O—Fe、C—O—Zn、C—O—Ca和C—O—Mg結(jié)構(gòu)。400～800 cm-1范圍內(nèi)的吸收峰由C—H和N—H伸縮振動(dòng)導(dǎo)致[30]。桃仁多肽與鈣離子和鎂離子螯合后在此處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，可推測(cè)形成了N—Ca和N—Mg結(jié)構(gòu)。

2.6 不同植物多肽及其亞鐵螯合物的傅里葉變換紅外光譜

從圖7和表1可知，不同植物多肽與金屬離子螯合后，其傅里葉變換紅外光譜發(fā)生改變，在3 300、1 550、1 100、600 cm-1附近的吸收峰與螯合前相比發(fā)生明顯位移。在酰胺A帶，桃仁、大豆、玉米和小麥多肽與亞鐵離子螯合后的吸收峰有不同程度的位移，推測(cè)桃仁、大豆、玉米和小麥多肽與亞鐵離子螯合后形成了N—Fe結(jié)構(gòu)；其在酰胺I帶和酰胺II帶的特征峰也有不同程度的位移。桃仁、大豆和玉米多肽的—COO-吸收峰位于1 396.46 cm-1處，小麥多肽的吸收峰在1 398.39 cm-1處，螯合亞鐵離子后吸收峰均發(fā)生明顯的藍(lán)移，移至1 419.61～1 427.32 cm-1范圍內(nèi)，可推測(cè)有—COO—Fe結(jié)構(gòu)形成。桃仁多肽在1 122.57 cm-1處的C—O吸收峰在螯合亞鐵離子后發(fā)生藍(lán)移，其他3 種多肽螯合亞鐵離子后發(fā)生明顯紅移，推測(cè)形成C—O—Fe結(jié)構(gòu)，該變化與Zhou Ji等[31]的結(jié)果類似。

圖 7 不同植物多肽及其亞鐵螯合物傅里葉變換紅外光譜Fig. 7 FTIR spectra of different plant peptides and their ferrous chelates

表 1 不同多肽及其不同金屬螯合物傅里葉變換紅外光譜特征峰Table 1 FTIR characteristic peaks of different samples

3 結(jié) 論

分子質(zhì)量小的桃仁多肽與亞鐵離子螯合率更高，其螯合物具有更大的抑菌圈直徑，分子質(zhì)量小于5 000 Da的桃仁多肽與亞鐵離子和鈣離子能螯合成具有較強(qiáng)抑菌活性的螯合物，而桃仁多肽螯合鈣和桃仁多肽螯合鎂均無(wú)抑菌活性；桃仁多肽、大豆多肽、玉米多肽和小麥多肽與亞鐵離子所形成的螯合物間的抑菌活性有顯著性差異（P＜0.05），其中桃仁多肽螯合亞鐵和小麥多肽螯合亞鐵的抑菌活性最強(qiáng)，其對(duì)大腸桿菌的MIC均為5.0 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC分別為2.5、5.0 mg/mL；傅里葉變換紅外光譜分析表明亞鐵離子與4 種多肽分子的—COO-、N—H、C＝O形成配位鍵，多肽與亞鐵離子能有效地螯合形成多肽亞鐵螯合物。