紫苜蓿黃酮含量和抗菌活性研究

楊蕾 梁倩 李喬仙 蔣達(dá)青 王芳 伍建榕

摘要：采用乙醇超聲提取，加水懸浮，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，測(cè)定了石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和水相4部分的黃酮含量，并以大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌5種細(xì)菌為供試菌株，采用抑菌圈法測(cè)定了其抑菌活性。石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相和水相的黃酮含量分別為3.47%，14.49%，9.13%和0.43%，其中，乙酸乙酯相具有顯著的抑菌效果，其它相抑菌效果不顯著，乙酸乙酯對(duì)供試菌株枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌最低抑菌濃度（MIC）分別為1.5、1.5、3.0、2.0和2.5mg/mL。

關(guān)鍵詞：紫苜蓿;黃酮含量;抑菌活性

紫苜蓿（Medicago saliva Linn.）為豆科（Legumi-nosae）蝶形花亞科（Faboideae）苜蓿屬（Medicago L.）多年生草本，被譽(yù)為“牧草之王”[1]。紫花苜蓿主要分布于我國(guó)西北、華北、東北、西南地區(qū)，其種植面積大、產(chǎn)量高。研究發(fā)現(xiàn)紫苜蓿有較高的利用價(jià)值，具有降低膽固醇和防治冠心病作用[2，3]，在抗旱，改良土壤，防止水土流失，保護(hù)生態(tài)環(huán)境等方面也起到積極的作用[4]。紫苜蓿主要含有黃酮、皂苷、香豆素、甾醇、單萜和有機(jī)酸等化學(xué)成分[5]。

黃酮類化合物（flavonoids）作為一大類天然、綠色、低毒、可再生的植物化合物，廣泛地存在于自然界的植物中[7]，具有抵御紫外線、抗菌免疫、抗氧化、抗艾滋病毒、抗腫瘤及微量雌激素作用等方面生理和藥理活性[8]。由于抗生素的濫用，病原菌日益產(chǎn)生的耐藥性給全球公共衛(wèi)生帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[9]，研發(fā)新的抗菌藥物成為醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)面臨的迫切任務(wù)。天然產(chǎn)物的抑菌效果受到了廣泛關(guān)注，特別是黃酮類化合物[10]。黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，人工合成十分困難，因此如何充分利用我國(guó)豐富的植物資源，并利用從中提取的黃酮類化合物抑菌已成為各國(guó)研究的熱點(diǎn)[11]。該研究測(cè)定紫苜蓿不同極性溶劑的提取物黃酮含量，并對(duì)紫苜蓿不同極性提取物的抑菌活性作了研究，以期為開發(fā)天然藥物提供借鑒依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫苜蓿于2013年5月30日采自昆明官渡區(qū)小哨云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院牧草資源圃，經(jīng)云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院李喬仙老師鑒定為豆科（Legumi-nosa）草本植物苜蓿屬紫苜蓿（M.saliva L）。

供試菌株由西南林業(yè)大學(xué)林學(xué)院保護(hù)生物學(xué)系植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，見表1。

蘆?。ㄙ?gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，分子式CHO₁₆，含量為92.5%），乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿試劑均為分析純。

1.2 黃酮含量的提取及測(cè)定

1.2.1 樣品的制備。取紫苜蓿地上部分，陰干后粉碎樣品778g，用80%乙醇提取，50℃水浴回流提取，得浸膏150g;再將浸膏加適量水懸浮，用石油醚萃取得浸膏26g，用氯仿萃取得浸膏4g，乙酸乙酯萃取得浸膏4g，水相為116g。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。按照操作步驟（圖1），在510nm波長(zhǎng)下使用分光光度計(jì)測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度（A），繪制蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出吸光度值A(chǔ)與蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（C，mg/mL）之間的線性回歸方程[12]。

1.2.3 黃酮含量測(cè)定。按照操作步驟（圖2），稱取石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯相、水相4部分供試樣品，并用80%乙醇溶解在容量瓶中，再分別取出各部分供測(cè)樣品，加入容量瓶中，分別精確加入5%NaNO₂溶液，搖勻：靜置6min，加入10%AI（NO₃）₃溶液，搖勻;靜置6min;再加入4%NaOH溶液，用80%乙醇定容，得待測(cè)溶液。

1.3 抑菌試驗(yàn)

利用抑菌圈法測(cè)定紫苜蓿地上部分各提取物的抑菌效果[13]：將約20mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒人培養(yǎng)皿制成平板，冷卻凝固后分別加入5種菌懸液（菌懸液濃度調(diào)整為106CFU/mL）各200μL，均勻涂布于培養(yǎng)基表面[14]，取直徑6mm無(wú)菌濾紙片，充分浸泡于紫花首蓿提取物中，水相（0.1406g/mL），乙酸乙酯相（0.0112g/mL）、氯仿相（0.064g/mL）、石油醚相（0.0612g/mL），取出后放在上述含菌平板上，每皿1片對(duì)照（生理鹽水作對(duì)照），每種菌平行作3皿。37℃倒置培養(yǎng)18～24h后，分別測(cè)量各樣品抑菌圈直徑（mm）。

利用二倍梯度法測(cè)定最低抑菌（MIC）濃度[15]。對(duì)具有明顯抑菌效果的紫苜蓿提取物樣品進(jìn)行連續(xù)二倍梯度稀釋，后取1mL加到19mL的培養(yǎng)基中，混勻制成平板，均勻涂布上述5種菌（菌懸液濃度調(diào)整為106CFU/mL）各200μL，于37℃培養(yǎng)24h后，觀察菌落生長(zhǎng)情況。以完全無(wú)菌生長(zhǎng)的提取物濃度做為供試樣品溶液的MIC值，同時(shí)以1.0mL無(wú)菌生理鹽水代替樣品溶液與培養(yǎng)基混合作對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫苜蓿的處理以及所得率

紫苜蓿粉碎樣品778g，用80%乙醇溶液回流提取得浸膏150g;乙酸乙酯、石油醚、氯仿、水溶液部分的所得率分別為2.7%、17.3%、2.7%、77.3%。

2.2 黃酮含量的提取及測(cè)定

2.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸光度值A(chǔ)與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（C，mg/mL）之間的線性回歸方程為A=9.89C-0.0173（R²=0.9998）。分析表明，蘆丁質(zhì)量濃度在0.010～0.050mg/mL時(shí)與吸光度值具有良好的線性關(guān)系（圖3）。

2.2.2 黃酮含量測(cè)定。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線及其換算關(guān)系，計(jì)算紫苜蓿提取物各部分的黃酮含量（見圖4），石油醚相的黃酮含量為3.47%，氯仿相的黃酮含量為14.49%，乙酸乙酯相的黃酮含量為9.13%，水相的黃酮含量為0.43%。

2.3 抑菌效果

通過抑菌圈法得知，紫苜蓿浸膏提取物除乙酸乙酯相對(duì)5種供試細(xì)菌有抑制作用外，其它相（石油醚相、氯仿相、水相）對(duì)5種供試細(xì)菌的抑制作用不明顯（圖5）。由表2可知，紫苜蓿的乙酸乙酯部分（3.5mg/mL），對(duì)枯草芽孢桿菌、普通變形桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的抑菌直徑分別為11mm、10mm、5mm、8mm、13mm。對(duì)乙酸乙酯相進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋（乙酸乙酯相0.24g/mL、0.16g/mL、0.08g/mL、0.04g/mL、0.02g/mL和0.01g/mL），后加入牛肉膏蛋白胨固體瓊脂培養(yǎng)基，待凝固后備用。以乙酸乙酯萃取物的MIC值分別為12mg/mL、8mg/mL、12mg/mL和1mg/mL，水溶物的MIC值分別為8mg/mL、4mg/mL、4mg/mL和2mg/mL。乙酸乙酯相的最低抑菌（MIC）對(duì)枯草芽抱桿菌為1.5mg/mL，對(duì)普通變形桿菌為1.5mg/mL，對(duì)大腸桿菌為3.0mg/mL，對(duì)銅綠假單胞菌為2.0mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌為2.5mg/mL。

紫苜蓿乙酸乙酯相對(duì)枯草芽抱桿菌和普通變形桿菌抑制效果較為明顯，對(duì)其他菌的抑制作用由大到小依次為：銅綠假單抱菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌。

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)，人們對(duì)天然植物成分的開發(fā)與利用已成為研究熱點(diǎn)，人們普遍傾向于從植物中提取有效成分進(jìn)行研究。劉曉曼[16]研究了紫莖澤蘭中倍半萜化合物對(duì)病原真菌有較高的抑菌活性，其最低抑菌濃度分別為0.1mg/mL和0.5mg/mL;陳佳佳[17]等采用瓊脂打孔法研究了不同溶劑的桑葉提取物對(duì)5種常見食源性污染菌都具有較好的抗菌活性。紫花苜蓿是迄今發(fā)現(xiàn)對(duì)人體健康營(yíng)養(yǎng)最全面的植物之一，作為潛在的健康食品來(lái)源備受關(guān)注。蘇效雙等[18]通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)苜蓿黃酮可以提高細(xì)胞的抗氧化能力。Pietrzak等[18]現(xiàn)苜蓿提取物能顯著改善血脂參數(shù)，降低膽固醇水平和降低低密度脂蛋白;左曉聽等[20]研究表明，苜蓿黃酮化合物能抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)苜蓿的皂苷與皂苷元具有防癌抗癌功效也得到證實(shí)。苜蓿具有巨大潛在開發(fā)價(jià)值，可能成為具有治療耐藥性病原體的抗菌化合物重要來(lái)源之一[21]。

本研究采用不同極性溶劑對(duì)紫苜蓿所含黃酮含量進(jìn)行提取，并測(cè)定其含量占比，根據(jù)分光光度法測(cè)定，表明紫苜蓿含有較高的黃酮類化合物，石油醚相、氯仿相、乙酸乙酯和水相的黃酮含量分別為3.47%、14.49%、9.13%和0.43%，各個(gè)萃取部分黃酮含量差異比較顯著，氯仿相和乙酸乙酯相的黃酮含量較高，表明紫苜蓿的黃酮主要集中在中等極性部分[12]。后期使用抑菌圈法對(duì)紫苜蓿不同極性提取物的抑菌活性作了初步研究，結(jié)果表明，乙酸乙酯提取物對(duì)5種供試菌株具有明顯的抑菌活性，其它相均沒有明顯的抑菌效果，說(shuō)明其乙酸乙酯相具有潛在的廣譜抗細(xì)菌特點(diǎn)。該研究為進(jìn)一步開展紫苜蓿植物化學(xué)成分研究，并具體分離鑒定其抗菌活性成分奠定了基礎(chǔ)，為該植物資源的合理利用提供了借鑒依據(jù)。（收稿：2018-12-06）

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