• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    桑黃基因組DNA提取方法優(yōu)化及分子鑒定

    2019-04-01 02:47:18陳力群譚晴晴陳雪燕劉利平劉國霞胡悅范陽陽劉艷艷步迅張全芳
    山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年1期
    關(guān)鍵詞:桑黃

    陳力群 譚晴晴 陳雪燕 劉利平 劉國霞 胡悅 范陽陽 劉艷艷 步迅 張全芳

    摘要:本研究以桑黃為材料,篩選出一種快速直接提取子實體DNA的方法。利用CTAB法、試劑盒及硅珠DNA純化技術(shù)分別對桑黃子實體基因組DNA進行提取,結(jié)果表明,硅珠DNA純化技術(shù)的提取效果最好,試劑盒方法次之。經(jīng)過PCR擴增和測序得到桑黃的rDNA ITS序列,通過BLAST比對及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建,發(fā)現(xiàn)所檢測的樣品為哈爾蒂木層孔菌Phellinus hartigii。

    關(guān)鍵詞:桑黃;DNA提取;ITS;分子檢測

    中圖分類號:S567.3??文獻標識號:A??文章編號:1001-4942(2019)01-0018-05

    Extraction Method Optimization and Molecular

    Identification of Phellinus igniarius Genomic DNA

    Chen Liqun?1,Tan Qingqing?2,Chen Xueyan?2, Liu Liping?3, Liu Guoxia?2,

    Hu Yue?2, Fan Yangyang?2, Liu Yanyan?2, Bu Xun?2,Zhang Quanfang?2

    (1. High School Attached to Shandong Normal University, Jinan 250014, China;

    2. Bio-Tech Research Center, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China;

    3. Shandong Academy of Agricultural Sciences Community Health Service Station of Quanfu Office

    in Licheng District of Jinan City, Jinan 250100, China)

    Abstract?Using Phellinus igniariusas as research materials, a method for rapidly extracting DNA from Phellinus igniarius was screened. The genomic DNA of Phellinus igniarius was respectively extracted by CTAB method, DNA extract kit and silica bead DNA purification technology. The results showed that the extraction method of silica bead DNA purification technology was the best, and the kit method was the second. The ITS gene sequence of Phellinus igniarius was obtained by PCR amplification and sequencing. By the BlAST sequence alignment and the construction of phylogenetic tree, we found the detected sample was Phellinus hartigii.

    Keywords?Phellinus igniarius; DNA extraction; ITS; Molecular detection

    桑黃(Phellinus igniarius)是一類珍貴的藥用真菌的統(tǒng)稱,又稱桑臣、桑耳、胡孫眼、桑黃菇,素有“森林黃金”的美稱[1],最早記載于《藥性論》中。傳統(tǒng)中醫(yī)中用于治療痢疾、盜汗、血崩、血淋、臍腹?jié)础⒚摳匦寡?、帶下、閉經(jīng)等[2];現(xiàn)在醫(yī)學(xué)研究中,具有抗癌、抗菌、抗纖維化、保肝等療效[3],是最近幾年開發(fā)的一種多年生珍貴藥用真菌。全世界銹革孔菌科有約470個名稱,針層孔菌屬有430個名稱,我國目前報道的銹革孔菌科有106種,針層孔菌屬有40種,其中針層孔菌屬中桑黃家族主要有:火木層孔菌(Phellinus igniarius)、針裂蹄木層孔菌(Phellinus linteus)、鮑姆針層孔菌(Phellinus baumii)等[4]。由于野生桑黃多生于松、楊、柳、樺、桃、櫟樹等闊葉樹的枯立木或者樹干上[5],其子實體呈褐色馬蹄形,大小不一,外觀形態(tài)相似,很難依賴于形態(tài)特征進行鑒別,往往出現(xiàn)“同名異物”或“同物異名”的現(xiàn)象[6]。

    隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,PCR技術(shù)[7]、RFLP[8]和RAPD[9]被逐漸應(yīng)用于桑黃基源成分的鑒定。由于ITS序列具有種內(nèi)菌株間相對保守,而種間差異比較明顯的特點,非常適合真菌的物種鑒定和物種起源、多樣性評價及親緣關(guān)系的鑒定。因此基于rDNA ITS序列進行桑黃基源鑒定也成為首選方法,同時高質(zhì)量DNA的提取也成為影響分子研究的關(guān)鍵。目前,桑黃主要是先進行子實體的分離、菌絲的培養(yǎng),最后對培養(yǎng)菌絲進行基因組DNA提取。這樣菌絲培養(yǎng)周期長,培養(yǎng)過程中存在污染問題。因此本實驗室采用CTAB法、試劑盒及硅珠DNA純化技術(shù)對桑黃子實體DNA進行直接提取,并通過PCR擴增和測序、BLAST比對及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建,得出一種操作簡便、DNA提取質(zhì)量高、耗時短且費用低廉的優(yōu)化方法,以便應(yīng)用于桑黃物種鑒定、遺傳分析等,為開展后續(xù)分子生物學(xué)試驗奠定基礎(chǔ)。

    1?材料與方法

    1.1?試驗材料

    本試驗桑黃樣品購自當?shù)厮幍辍?/p>

    1.2?儀器設(shè)備

    主要有:7500 Real-Time PCR儀(賽默飛世爾科技公司)、紫外分光光度計SMA1000(北京美林恒通有限公司)、臺式離心機5424R(德國Eppendorf)、ABI 3730xl DNA 測序儀(美國ABI公司)、Bio-Rad ChemicDoc??TM??XRS +凝膠成像系統(tǒng)、B960 PCR儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司)等。

    1.3?試劑

    主要有:裂解液FP1、醋酸鉀、洗滌液PW1,Proteinase K、硅珠、DNA Binding Buffer、75%乙醇、TE緩沖液、超純水、EasyPure Genomic DNA Kit ?(TRAN公司)、Plant Genomic DNA Kit (TIANGEN公司)、EasyTaq Buffer、EasyTaq DNA Polymerase (北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

    1.4?基因組DNA提取

    (1)方法A:根據(jù)文獻[10]中CTAB方法提取桑黃子實體基因組DNA。

    (2)方法B:參照TIANGEN真菌DNA提取試劑盒,具體提取方法參考說明書操作。

    (3)方法C:將桑黃子實體表面用75%乙醇擦拭及超純水沖洗2遍,稱取樣品50~100 mg用滅菌的研缽研磨,轉(zhuǎn)入2 mL離心管后,加入500 μL裂解液FP1以及100 μL 醋酸鉀振蕩混勻,56℃裂解10 min, 12 000 r/min離心2 min;取上清于新的離心管中,加入2倍體積的DNA結(jié)合液和20 μL硅珠,充分混勻,12 000 r/min離心1 min,棄上清液;加入500 μL漂洗液進行洗滌,?12 000??r/min離心1 min,重復(fù)此步驟2次;加入?700 μL?無水乙醇,吹打懸浮,8 000 r/min離心1 min,棄上清液;8 000 r/min離心30 s,用10 μL槍頭吸走殘余液體,室溫干燥10 min;加入50 μL TE緩沖液溶解DNA。

    1.5?基因組DNA濃度和純度檢測

    5 μL DNA提取液用2%瓊脂糖凝膠,在150 V電壓下電泳10 min后取出,溴乙錠染色,在凝膠成像儀上觀察并拍照記錄。另外,取2 μL DNA提取液,用紫外分光光度計測定其濃度以及A?260?和A?280?。

    1.6?PCR擴增

    PCR反應(yīng)總體系為25 μL,其中EasyTaq聚合酶0.2 μL,10×EasyTaq Buffer 2.5 μL,dNTPs(2.5 μmol/L)2.0 μL,上、下游引物各1.0 μL(10 μmol/L),DNA模板2.0 μL(20~50 ng/μL),ddH2O 補足至25 μL。PCR擴增上游引物ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′,下游引物ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′[11]。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30 s, 56℃退火30 s, 72℃延伸45 s,35個循環(huán);最后72℃延伸10 min,16℃保存。利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增效果。然后將PCR產(chǎn)物切膠純化,利用ABI3730XL測序儀進行測序。

    1.7?數(shù)據(jù)分析

    測序峰圖利用SeqMan軟件校對拼接,去除低質(zhì)量序列及引物區(qū),獲得rDNA ITS序列。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST工具進行序列比對,對桑黃進行同源性分析。

    1.8?系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

    從GenBank中下載18條桑黃菌株的rDNA ITS序列,利用MEGA 7.0軟件采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

    2?結(jié)果與分析

    2.1?桑黃基因組DNA檢測

    分別取5 μL PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,檢測結(jié)果顯示,方法A提取的DNA有條帶,但有降解現(xiàn)象,而方法B和方法C提取的基因組DNA無條帶(圖1)。利用紫外分光光度計檢測基因組DNA濃度和純度(表1),可以看出,方法A的濃度明顯高于方法B、C,但提取的DNA含有色素;方法A和B的A?260?/A?280?均存在比值小于?1.8?或大于2.0的現(xiàn)象,說明樣品在基因組DNA提取過程中存在部分蛋白、酚類及RNA的污染。方法C的A?260?/A?280?比值在?1.8~?2.0之間,濃度在50 ?ng/μL左右,可以滿足后續(xù)分子生物學(xué)試驗的要求。

    2.2?PCR擴增及DNA測序

    以三種方法提取的基因組DNA為模板,采用ITS引物進行PCR擴增,利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),方法B和方法C提取的DNA均能擴增出一條明顯的特異性條帶,分子量740 bp左右(圖2)。DNA測序結(jié)果見圖3。另外,利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST工具對桑黃rDNA ITS序列進行比對,與Phellinus hartigii的同源性為100%,ITS序列見圖4。

    2.3?系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

    基于從GenBank中下載的18條桑黃菌株rDNA ITS序列,采用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖5)。結(jié)果顯示,檢測樣品與登錄號為KY750527.1和JX093788.1的哈爾蒂木層孔菌(Phellinus hartigii)菌株親緣關(guān)系最近,其序列相似度均為100%,因此初步鑒定檢測樣品為哈爾蒂木層孔菌。

    3?討論與結(jié)論

    目前,桑黃基因組DNA提取主要是通過培養(yǎng)菌絲,然后利用傳統(tǒng)的CTAB法或SDS方法進行提取。而菌絲的培養(yǎng)時間較長,一般需要3~7天,在培養(yǎng)過程中還會遇到其他菌類污染的問題。為了較快且準確地進行分子鑒定,獲取高質(zhì)量的DNA,本試驗通過CTAB法、試劑盒及硅珠DNA純化技術(shù)三種方法對桑黃子實體直接進行基因組DNA提取,并利用紫外分光光度計、瓊脂糖凝膠電泳分析以及PCR產(chǎn)物擴增技術(shù)對三種方法提取的DNA濃度、純度及后續(xù)分子生物學(xué)試驗應(yīng)用性等方面進行評估。方法A采用CTAB法,提取時間較長,且存在酚、氯仿等揮發(fā)性有毒物質(zhì),在提取過程中雖然獲得的DNA產(chǎn)量較大,凝膠電泳可以看到明顯條帶,但是DNA溶液存在色素,影響后續(xù)PCR擴增。方法B采用試劑盒進行提取,獲得的DNA產(chǎn)量小雜質(zhì)少,但是價格相對偏高。而方法C采用硅珠DNA純化技術(shù),其純度和濃度均能滿足后續(xù)分子檢測的需要,且PCR擴增條帶單一。對方法B和C提取的基因組DNA PCR擴增產(chǎn)物進行測序及BLAST比對,并進一步構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,結(jié)果顯示檢測樣品與哈爾蒂木層孔菌(Phellinus hartigii)同源性最高,可確定為哈爾蒂木層孔菌。說明提取的桑黃基因組DNA可以滿足后續(xù)的分子生物學(xué)試驗要求,為桑黃物種的分子鑒定提供技術(shù)支持。在實際操作中,可以根據(jù)試驗條件選擇方法B(試劑盒法)或方法C(硅珠DNA純化技術(shù))。

    參?考?文?獻:

    [1]孫培龍, 徐雙陽, 楊開, 等. 珍稀藥用真菌桑黃的國內(nèi)外研究進展[J].微生物學(xué)通報, 2006, 33(2):119-123.

    [2]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海:上??茖W(xué)技術(shù)出版社,1995.

    [3]趙子高. 桑黃深層發(fā)酵生產(chǎn)生物活性物質(zhì)的研究[D]. 南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

    [4]劉春輝, 陳體強, 林躍鑫. 藥用真菌桑黃的研究進展[J]. 菌物研究, 2004, 2(2):53-59.

    [5]高凱, 杜明, 呂英華, 等. 10株桑黃菌基于rDNA ITS序列的分子鑒定[J]. 蠶業(yè)科學(xué), 2010, 36(4):584-589.

    [6]張文雋, 吳亞召, 雷萍, 等. 秦巴山區(qū)野生桑黃rDNA ITS序列及親緣關(guān)系分析[J]. 中國食用菌, 2015, 34(1):50-52.

    [7]Sell I. Taxonomy of the species in the Phellinus igniarius group[J]. Mycotaxon, 2008, 47(2):135-146.

    [8]Fischer M. Phellinus igniarius and its closest relatives in Europe [J]. Mycological Research, 1995, 99(6):735-744.

    [9]秦俊哲, 王雅鳳, 劉華. 桑黃DNA提取及RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 食品工業(yè)科技, 2010(3):210-211.

    [10]馬曉凡, 李林. 金針菇DNA提取方法比較[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 45(2):158-160.

    [11]Hong C F, Tsai S F, Yeh H C, et al. First report of Myrothecium roridum causing Myrothecium leaf spot on Dieffenbachia picta ‘Camilla in Taiwan[J]. Plant Disease, 2013, 97(9):1253.

    猜你喜歡
    桑黃
    桑黃是否能消結(jié)節(jié)?
    《桑黃》一書簡介
    食用菌(2022年4期)2022-08-05 08:19:58
    桑黃——古老中藥放新彩
    桑黃對桑枝基料中1-脫氧野尻霉素的富集能力研究
    桑黃黃酮的研究進展
    藥用真菌之“森林黃金”
    ——桑黃
    HPLC法同時評價不同桑黃提取物中3種主要化合物的含量
    山民找桑黃日收入過千元
    食用菌(2018年4期)2019-01-08 01:44:04
    桑黃纖孔菌發(fā)酵液化學(xué)成分的研究
    中成藥(2018年1期)2018-02-02 07:20:03
    “桑黃”類真菌中多酚物質(zhì)及其生物活性研究進展
    一本一本综合久久| 免费av毛片视频| 国产探花极品一区二区| 欧美丝袜亚洲另类 | 中文字幕免费在线视频6| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲av.av天堂| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 天堂影院成人在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 久久久久久久久大av| 中文资源天堂在线| 性欧美人与动物交配| 精品一区二区三区视频在线| 91麻豆精品激情在线观看国产| 动漫黄色视频在线观看| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 一级黄色大片毛片| 国产精品亚洲美女久久久| 麻豆av噜噜一区二区三区| 国产高清有码在线观看视频| 十八禁网站免费在线| 97碰自拍视频| 日韩欧美 国产精品| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲av熟女| or卡值多少钱| 黄片wwwwww| 日本成人三级电影网站| 亚洲最大成人中文| 色尼玛亚洲综合影院| 中国美女看黄片| 国产69精品久久久久777片| 精品免费久久久久久久清纯| 一进一出好大好爽视频| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 中文字幕av在线有码专区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 男人的好看免费观看在线视频| 成年女人永久免费观看视频| 日韩中字成人| 国产极品精品免费视频能看的| 国产精品人妻久久久久久| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 久9热在线精品视频| 国产伦人伦偷精品视频| 久久久久久国产a免费观看| 男女下面进入的视频免费午夜| 欧美三级亚洲精品| 黄色一级大片看看| 亚洲国产精品合色在线| 男人和女人高潮做爰伦理| 亚洲av日韩精品久久久久久密| avwww免费| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 国产精品久久电影中文字幕| 51国产日韩欧美| 黄色视频,在线免费观看| 我的女老师完整版在线观看| 男人舔奶头视频| 在线a可以看的网站| 国产伦一二天堂av在线观看| 色尼玛亚洲综合影院| 干丝袜人妻中文字幕| 毛片一级片免费看久久久久 | 乱人视频在线观看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 欧美日韩国产亚洲二区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 久久久久性生活片| 春色校园在线视频观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 精品乱码久久久久久99久播| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 久久精品91蜜桃| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 可以在线观看毛片的网站| 欧美极品一区二区三区四区| 日本一二三区视频观看| 国产黄色小视频在线观看| 日韩强制内射视频| 午夜福利在线在线| 一区二区三区激情视频| h日本视频在线播放| 免费av不卡在线播放| 国产久久久一区二区三区| 国产成人av教育| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 哪里可以看免费的av片| 精品久久久久久久久亚洲 | 99在线视频只有这里精品首页| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 长腿黑丝高跟| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产乱人伦免费视频| 中文字幕久久专区| 极品教师在线视频| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 18禁在线播放成人免费| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 一级毛片久久久久久久久女| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 欧美一区二区精品小视频在线| 少妇高潮的动态图| 中国美白少妇内射xxxbb| 免费人成在线观看视频色| 亚洲av不卡在线观看| 春色校园在线视频观看| 嫩草影院新地址| 舔av片在线| 亚洲av成人av| 亚洲综合色惰| www日本黄色视频网| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 悠悠久久av| 国产老妇女一区| 国产乱人伦免费视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲中文日韩欧美视频| 成人欧美大片| 午夜福利视频1000在线观看| 日本爱情动作片www.在线观看 | 欧美bdsm另类| 亚洲电影在线观看av| 日韩欧美 国产精品| 中文字幕av成人在线电影| 免费观看在线日韩| av天堂中文字幕网| 一个人看视频在线观看www免费| 中文资源天堂在线| 色综合婷婷激情| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲最大成人手机在线| 简卡轻食公司| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲精品影视一区二区三区av| 亚洲最大成人av| 天堂√8在线中文| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 99久久精品热视频| 久久精品国产自在天天线| 日韩欧美精品v在线| 亚洲精品在线观看二区| 少妇人妻一区二区三区视频| 动漫黄色视频在线观看| 色综合色国产| 国产亚洲精品综合一区在线观看| .国产精品久久| 色综合婷婷激情| 啦啦啦韩国在线观看视频| 99热这里只有是精品50| 欧美高清性xxxxhd video| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 成人av一区二区三区在线看| av.在线天堂| 91在线观看av| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 欧美最黄视频在线播放免费| 欧美3d第一页| 国产69精品久久久久777片| 色av中文字幕| 久久99热6这里只有精品| 能在线免费观看的黄片| 成年女人毛片免费观看观看9| xxxwww97欧美| 久99久视频精品免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 国产淫片久久久久久久久| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产真实乱freesex| 一进一出抽搐动态| 少妇人妻精品综合一区二区 | 观看免费一级毛片| 亚洲av成人精品一区久久| 日韩欧美国产在线观看| 国产在视频线在精品| 在线观看舔阴道视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 久久国产精品人妻蜜桃| 九色国产91popny在线| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 日本一二三区视频观看| 成人性生交大片免费视频hd| 欧美极品一区二区三区四区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产大屁股一区二区在线视频| 日本一本二区三区精品| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 超碰av人人做人人爽久久| 性色avwww在线观看| 久9热在线精品视频| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 色综合婷婷激情| 久久精品人妻少妇| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 女同久久另类99精品国产91| 久久久久久伊人网av| 综合色av麻豆| 一本久久中文字幕| 直男gayav资源| 亚洲三级黄色毛片| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 日本 av在线| 99久久精品热视频| 久久久午夜欧美精品| 成人国产一区最新在线观看| 97碰自拍视频| 搡老岳熟女国产| 久久久成人免费电影| 国产精品一区二区三区四区久久| 九色成人免费人妻av| 俄罗斯特黄特色一大片| а√天堂www在线а√下载| 中亚洲国语对白在线视频| 男人和女人高潮做爰伦理| xxxwww97欧美| 成人亚洲精品av一区二区| 乱码一卡2卡4卡精品| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 欧美+日韩+精品| 亚洲av二区三区四区| 动漫黄色视频在线观看| 日韩欧美国产一区二区入口| 亚洲精品日韩av片在线观看| 亚洲综合色惰| 男女边吃奶边做爰视频| 国产黄色小视频在线观看| 午夜老司机福利剧场| 一进一出抽搐动态| 老司机福利观看| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲成av人片在线播放无| 免费av不卡在线播放| 一级a爱片免费观看的视频| avwww免费| 欧美一区二区亚洲| 欧美色欧美亚洲另类二区| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 久久国产乱子免费精品| 国产一区二区在线av高清观看| 一本一本综合久久| 亚洲avbb在线观看| 一个人看视频在线观看www免费| 亚洲 国产 在线| 天堂√8在线中文| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲av电影不卡..在线观看| av在线亚洲专区| 嫩草影视91久久| 天堂√8在线中文| 最后的刺客免费高清国语| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 小说图片视频综合网站| 最新中文字幕久久久久| 一级毛片久久久久久久久女| 乱系列少妇在线播放| 日韩 亚洲 欧美在线| 欧美国产日韩亚洲一区| 久久久久久久久中文| 国产高清不卡午夜福利| av天堂在线播放| 久久久久久久久大av| 俄罗斯特黄特色一大片| 男人的好看免费观看在线视频| 欧美3d第一页| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产精品一区二区性色av| 午夜福利欧美成人| 国产精品日韩av在线免费观看| 中亚洲国语对白在线视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 午夜久久久久精精品| 搡老熟女国产l中国老女人| av.在线天堂| 国产不卡一卡二| 淫秽高清视频在线观看| a在线观看视频网站| 欧美丝袜亚洲另类 | 美女免费视频网站| 国国产精品蜜臀av免费| 最近最新免费中文字幕在线| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 国产精品,欧美在线| 最近视频中文字幕2019在线8| 美女cb高潮喷水在线观看| av黄色大香蕉| 白带黄色成豆腐渣| 久久精品国产自在天天线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 精品久久久久久成人av| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | av在线天堂中文字幕| 很黄的视频免费| 国产av麻豆久久久久久久| 亚洲中文字幕日韩| 色综合站精品国产| 精品人妻熟女av久视频| 国产伦精品一区二区三区四那| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美在线一区亚洲| 国产精品电影一区二区三区| 久久精品国产自在天天线| x7x7x7水蜜桃| 国产熟女欧美一区二区| 91在线精品国自产拍蜜月| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲色图av天堂| 嫩草影院精品99| 国产大屁股一区二区在线视频| 一区二区三区高清视频在线| 成年版毛片免费区| 国产一区二区在线观看日韩| 99在线视频只有这里精品首页| 伦理电影大哥的女人| 欧美一区二区国产精品久久精品| 精品人妻一区二区三区麻豆 | 亚洲性久久影院| 他把我摸到了高潮在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 看十八女毛片水多多多| 亚洲av美国av| 亚洲欧美激情综合另类| 国产视频一区二区在线看| 日韩强制内射视频| 日本一本二区三区精品| 欧美日韩精品成人综合77777| 1024手机看黄色片| 亚洲无线观看免费| 一进一出好大好爽视频| 韩国av在线不卡| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产一区二区激情短视频| 美女高潮的动态| 精品福利观看| 波多野结衣高清作品| 成人鲁丝片一二三区免费| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 精品久久久久久久久av| 女人被狂操c到高潮| 动漫黄色视频在线观看| 免费大片18禁| av黄色大香蕉| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲黑人精品在线| 成人综合一区亚洲| av国产免费在线观看| 国产成人aa在线观看| 看十八女毛片水多多多| 亚洲国产欧美人成| 直男gayav资源| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久久久久国产a免费观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产av麻豆久久久久久久| 国产三级在线视频| 桃红色精品国产亚洲av| 国产午夜精品论理片| 欧美日韩精品成人综合77777| 午夜免费激情av| 在线观看舔阴道视频| 深夜精品福利| 91精品国产九色| 亚洲专区中文字幕在线| 色精品久久人妻99蜜桃| 韩国av一区二区三区四区| 我的女老师完整版在线观看| 99热6这里只有精品| av福利片在线观看| 色哟哟·www| 国产中年淑女户外野战色| 欧美人与善性xxx| 免费电影在线观看免费观看| 麻豆成人午夜福利视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 久久这里只有精品中国| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 伊人久久精品亚洲午夜| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 国产大屁股一区二区在线视频| 国产乱人视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 午夜日韩欧美国产| 亚洲av美国av| 国内精品久久久久久久电影| 内射极品少妇av片p| 波多野结衣高清作品| 九九爱精品视频在线观看| 国产爱豆传媒在线观看| a在线观看视频网站| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产一区二区激情短视频| 色尼玛亚洲综合影院| 午夜免费成人在线视频| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 男女啪啪激烈高潮av片| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 亚洲三级黄色毛片| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 久99久视频精品免费| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲性夜色夜夜综合| 成人美女网站在线观看视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 99热6这里只有精品| 黄色配什么色好看| 欧美一区二区国产精品久久精品| 直男gayav资源| 神马国产精品三级电影在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 内射极品少妇av片p| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲av中文av极速乱 | 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲精品国产成人久久av| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲国产精品sss在线观看| 在现免费观看毛片| 婷婷精品国产亚洲av| 欧美性感艳星| 精品久久久噜噜| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产视频内射| av福利片在线观看| 嫩草影院新地址| 波多野结衣巨乳人妻| 精品一区二区免费观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 欧美激情在线99| 欧美日本视频| 99热只有精品国产| 精品久久久久久成人av| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 欧美人与善性xxx| АⅤ资源中文在线天堂| 精品久久久久久久久久久久久| 午夜福利18| av女优亚洲男人天堂| 又紧又爽又黄一区二区| а√天堂www在线а√下载| 少妇的逼水好多| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产精品永久免费网站| 亚洲自拍偷在线| 黄色视频,在线免费观看| 欧美性猛交黑人性爽| 性欧美人与动物交配| 国产高潮美女av| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲av二区三区四区| 久久6这里有精品| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 免费无遮挡裸体视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产伦在线观看视频一区| or卡值多少钱| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲精品粉嫩美女一区| 亚洲人成网站高清观看| 免费av毛片视频| 日本三级黄在线观看| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 国产三级中文精品| 51国产日韩欧美| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲人与动物交配视频| 国产熟女欧美一区二区| 嫩草影院入口| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 看黄色毛片网站| 九九热线精品视视频播放| 免费一级毛片在线播放高清视频| 哪里可以看免费的av片| 十八禁国产超污无遮挡网站| 一区福利在线观看| 99久国产av精品| 欧美bdsm另类| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲欧美激情综合另类| 又粗又爽又猛毛片免费看| 亚洲av免费高清在线观看| av天堂中文字幕网| 欧美黑人巨大hd| 白带黄色成豆腐渣| 日本a在线网址| 日韩国内少妇激情av| 欧美性感艳星| 午夜日韩欧美国产| 十八禁网站免费在线| 级片在线观看| 久久久成人免费电影| 日韩欧美在线二视频| 91av网一区二区| 成年免费大片在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 热99re8久久精品国产| 亚洲电影在线观看av| 在现免费观看毛片| 一级黄色大片毛片| 性插视频无遮挡在线免费观看| 日韩精品中文字幕看吧| 最近中文字幕高清免费大全6 | 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产在视频线在精品| 国产精品久久久久久精品电影| 国产在视频线在精品| 久久久久久久久大av| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 日本 av在线| 亚洲不卡免费看| 日本 av在线| 直男gayav资源| 久久久成人免费电影| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品久久久久久精品电影| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 在线观看一区二区三区| 老司机午夜福利在线观看视频| 无遮挡黄片免费观看| 成年免费大片在线观看| 男人舔奶头视频| 午夜激情福利司机影院| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美色视频一区免费| 国内精品美女久久久久久| 午夜免费激情av| 又紧又爽又黄一区二区| 成人无遮挡网站| 成年女人看的毛片在线观看| 久99久视频精品免费| 波多野结衣高清无吗| 国产亚洲欧美98| 日韩欧美精品v在线| 女人被狂操c到高潮| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 亚洲电影在线观看av| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 小说图片视频综合网站| 97热精品久久久久久| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 男女视频在线观看网站免费| 成人国产综合亚洲| 亚洲国产精品成人综合色| 黄色一级大片看看| 国产精品久久视频播放| 国产视频一区二区在线看| 男插女下体视频免费在线播放| 三级国产精品欧美在线观看| 国产真实乱freesex| 久久久午夜欧美精品| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲成人精品中文字幕电影| 国产69精品久久久久777片| 搡老岳熟女国产| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲av.av天堂| 天堂网av新在线| 国产成人福利小说| 欧美一级a爱片免费观看看| 99在线人妻在线中文字幕| 午夜视频国产福利| 久久久精品欧美日韩精品| 伦精品一区二区三区| 一区二区三区四区激情视频 | 可以在线观看的亚洲视频| 神马国产精品三级电影在线观看| xxxwww97欧美| 在线观看一区二区三区| 男女那种视频在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 国产亚洲精品av在线| 丝袜美腿在线中文| 久久精品91蜜桃| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产一区二区三区av在线 | 天堂√8在线中文| 国产精品人妻久久久久久| 一区二区三区四区激情视频 | 国内精品久久久久久久电影| 国产真实伦视频高清在线观看 | 在线观看一区二区三区| 亚洲图色成人| 亚洲av成人av| 中文资源天堂在线| 欧美zozozo另类| 99视频精品全部免费 在线| av女优亚洲男人天堂| 午夜影院日韩av| 精品久久久久久成人av| 亚州av有码| 午夜日韩欧美国产| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 成年女人看的毛片在线观看| 一级黄片播放器|