Nav1.5與β亞基互作：結(jié)構(gòu)、功能和相關(guān)疾病

艾若松，呂小強(qiáng)，卜凡亨，趙贊延，姜 鳴,3，劉 霞，白占濤,3*

(1.延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.延安大學(xué)多肽資源藥物研究中心；3.陜西省區(qū)域生物資源保育與利用工程技術(shù)研究中心，陜西延安716000)

在可興奮細(xì)胞中，VGSCs負(fù)責(zé)動(dòng)作電位的形成和傳導(dǎo)。VGSCs由一個(gè)α亞基(240-260kD)構(gòu)成孔道，兩側(cè)是輔助性的一個(gè)非共價(jià)偶聯(lián)的β亞基(β1或β3)或一個(gè)共價(jià)偶聯(lián)的β亞基(β2或β4)(33-36kD)[1]。哺乳動(dòng)物α亞基有十個(gè)亞型，分別是Nav1.1-Nav1.9及NavX，基因編碼為SCN1A-SCN11A及NavX，包含四個(gè)同源結(jié)構(gòu)域(DⅠ-Ⅳ)，每個(gè)結(jié)構(gòu)域有六個(gè)跨膜片段(S1-S6)，S4片段為電壓感受器(VSDs，見(jiàn)封二圖1)[2]。據(jù)其對(duì)河豚毒素(Tetradotoxin,TTX)的敏感性不同，分為河豚毒素敏感型(Tetrodotoxin-sensitive,TTX-S)鈉通道和河豚毒素不敏感型(Tetrodotoxin-resistant,TTX-R)鈉通道兩大類。β亞基有五個(gè)亞型，分別是β1-β4及β1B，基因編碼為SCN1B-SCN4B及SCN1B。β1亞基在人類染色體定位于19q13，β2和β4亞基定位于11q23，β3亞基定位于11q23。β亞基屬Ⅰ型拓?fù)淇缒さ鞍譡3]，每個(gè)亞基包含一個(gè)胞外N端結(jié)構(gòu)域，是與許多神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(CAMs)同源的免疫球蛋白(Ig)，一個(gè)跨膜片段和一個(gè)胞內(nèi)C端[4]。β亞基在神經(jīng)系統(tǒng)、心臟和骨骼肌等可興奮細(xì)胞中表達(dá)[5]，也在星形膠質(zhì)細(xì)胞、放射狀膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等不可興奮細(xì)胞中表達(dá)[6]。β亞基調(diào)控α亞基的電學(xué)特性，包括如鈉電流峰值密度、電壓依賴性激活和失活、在細(xì)胞和特異性組織中持續(xù)性鈉電流和鈉電流從失活中恢復(fù)等。β亞基也與細(xì)胞遷移、神經(jīng)突增長(zhǎng)以及軸突向?qū)У圈羴喕笔У脑S多功能相關(guān)。盡管VGSCs單獨(dú)表達(dá)α亞基時(shí)也會(huì)形成Na+內(nèi)向電流(INa)[7]，但β亞基共表達(dá)時(shí)更接近生理?xiàng)l件下VGSCs的動(dòng)力學(xué)和門(mén)控特性[8]。

Nav1.5是主要的心臟鈉通道，高表達(dá)在心肌閏盤(pán)、腦和胃腸平滑肌[9]，屬于TTX-R鈉通道。β亞基有助于Nav1.5在閏盤(pán)上定位，調(diào)控Nav1.5與胞外基質(zhì)，肌動(dòng)蛋白及細(xì)胞骨架相關(guān)分子相互作用[10]。目前已發(fā)現(xiàn)大量SCN5A突變與各種罕見(jiàn)的心律失常綜合癥密切相關(guān)[11]。當(dāng)Nav1.5孔道DⅠ的Phe變?yōu)镃ys可使孔道對(duì)TTX的敏感性降低200倍[7]。Nav1.5的電生理學(xué)調(diào)控特征研究表明，動(dòng)作電位改變和心律失常易損性增加與Nav1.5表達(dá)水平和表面鈉電流密度相關(guān)。比如，β1亞基調(diào)控Nav1.5表面的電流密度和門(mén)控特性，表現(xiàn)為峰值電流的增加，使α亞基從靜息狀態(tài)中恢復(fù)得更快。遺傳病理學(xué)顯示，β亞基表達(dá)改變與各種疾病密切相關(guān)。哺乳動(dòng)物心臟中β亞基表達(dá)定位于心肌細(xì)胞不同部位(心室細(xì)胞的夾層、心房細(xì)胞的夾層、T管及閏盤(pán))，在細(xì)胞表面調(diào)控著離子的傳導(dǎo)，錨定化合物向胞內(nèi)蛋白，并直接調(diào)控α亞基的門(mén)控特性[12]，因此其功能喪失會(huì)導(dǎo)致電生理特性異常，更易心律失常[13]。由此推測(cè)Nav1.5與β亞基之間一定存在某種或某些相互作用關(guān)系，因此，本文就目前已有的關(guān)于Nav1.5與β亞基互作的結(jié)構(gòu)、功能和相關(guān)疾病展開(kāi)敘述。

1 β亞基與Nav1.5互作組合

許多疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中都需要β亞基的參與，β亞基不同亞型對(duì)于同一α亞基的作用并不相同。那么β亞基不同亞型或不同亞型組合是否都能與心肌Nav1.5產(chǎn)生互作，互作結(jié)果如何等都需深入研究。β1亞基和β3亞基通過(guò)N端和C端與α亞基非共價(jià)作用，調(diào)節(jié)通道的門(mén)控特性，表現(xiàn)為加快鈉電流的失活以及從失活中恢復(fù)、增加鈉電流的振幅[14]。β1亞基定位于心室細(xì)胞的夾層、T管及心房細(xì)胞的閏盤(pán)[15]，其調(diào)節(jié)α亞基的門(mén)控特性主要依賴于胞外區(qū)，通過(guò)改變DⅣ-VSD的傳導(dǎo)來(lái)調(diào)控Nav1.5的失活，通過(guò)DⅢ和DⅣ的VSDs作用，使Nav1.5從失活中恢復(fù)得更快。其次，β1亞基的跨膜區(qū)對(duì)于Nav1.5通道電流的增加和加快其從失活中恢復(fù)也有作用。β1亞基還能夠干擾脂肪酸、藥物或者天然毒素對(duì)α亞基的作用。SCN1B敲除后小鼠心臟SCN3A和SCN5AmRNA表達(dá)增加[16]。β1B亞基定位于心房和心室心肌細(xì)胞，在細(xì)胞連接中尤為重要。β 1B亞基在不同細(xì)胞中調(diào)控α亞基，增加鈉電流并且使電壓依賴性激活和失活向超極化方向移動(dòng)[17]。β1B亞基表達(dá)在心臟時(shí)，與α亞基一起留在細(xì)胞表面并且增加α亞基的表達(dá)。β3亞基定位于心室心肌細(xì)胞的T管和心房細(xì)胞的閏盤(pán)。β3亞基與Nav1.5在CHO細(xì)胞上共表達(dá)時(shí)導(dǎo)致電壓依賴失活曲線負(fù)移并減慢失活[18]。增加胞外分子二硫鍵，β3亞基使得蛋白更加穩(wěn)定。β1亞基和β3亞基的胞外區(qū)域結(jié)合在Nav1.5通道α亞基C末端的相似位點(diǎn)。β3亞基的晶體結(jié)構(gòu)顯示為同聚二聚體形式，Nav1.5包含多個(gè)位點(diǎn)與β3亞基相互作用并可能形成低聚復(fù)合物。雖然β1亞基和β3亞基同源水平較高，但只有β3亞基與Nav1.5共同作用能形成這種低聚物，而β1亞基則不能。

筆者通過(guò)全序列比對(duì)分析得到共價(jià)偶聯(lián)的β2亞基和β4亞基有35%(見(jiàn)封三圖2C)的序列同源性，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致。β4亞基與β1亞基和β3亞基只有20%～22%的同源性。β2亞基和β4亞基可單獨(dú)通過(guò)胞外Ig環(huán)的N端Cys與α亞基S5～S6的Cys共價(jià)作用[11](β2：Cys-26[19]，β4：Cys-58[20])。β2亞基定位于心肌細(xì)胞的閏盤(pán)或T管和心房細(xì)胞的T管。β2亞基誘導(dǎo)Nav1.5向超極化門(mén)控移動(dòng)，即有唾液酸依賴。β1亞基和β2亞基能夠促進(jìn)細(xì)胞粘著，而β3亞基無(wú)此功能。β4亞基定位于心室心肌細(xì)胞的閏盤(pán)。β4亞基與Nav1.5在HEK293細(xì)胞共表達(dá)誘導(dǎo)電壓依賴失活曲線負(fù)移[21]。

綜上，β亞基與Nav1.5可產(chǎn)生互作，但互作位點(diǎn)、互作機(jī)制尚不明確，且關(guān)于β亞基與Nav1.5互作組合的研究較少。于是，我們利用NCBI的Blast對(duì)人源β1～β4亞基進(jìn)行了氨基酸全序列比對(duì)分析(見(jiàn)封三圖2A)。分析發(fā)現(xiàn)，β1～β4亞基氨基酸序列組成主要為V位點(diǎn)、Ig-P0蛋白相似位點(diǎn)，IGv和DUF1191，其他區(qū)域尚不明確。V位點(diǎn)主要存在于抗體、神經(jīng)蛋白P0和CTL4中；P0是一種單跨膜糖蛋白，具有高度堿性的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域和胞外結(jié)構(gòu)域，P0的胞外結(jié)構(gòu)域和Ig的可變結(jié)構(gòu)域相似，攜帶一個(gè)受體序列進(jìn)行N端連接糖基化；IGv是Ig的V型；DUF1191假定為植物蛋白的未知片段。隨后，我們分別比對(duì)了非共價(jià)偶聯(lián)的β1亞基和β3亞基(見(jiàn)封三圖2B)以及共價(jià)偶聯(lián)的β2亞基和β4亞基(見(jiàn)封三圖2C)，對(duì)其跨膜結(jié)構(gòu)及信號(hào)肽進(jìn)行了預(yù)測(cè)。發(fā)現(xiàn)β1亞基和β3亞基的胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)及信號(hào)肽序列基本對(duì)應(yīng)。而β2亞基和β4亞基的比對(duì)結(jié)果顯示出較大差異。那么結(jié)構(gòu)組成相似的β亞基在疾病情況下的表現(xiàn)是怎么樣的，有待于進(jìn)一步討論。

2 β亞基與Nav1.5互作組合的相關(guān)疾病

SCN5A突變影響心臟鈉通道的克隆和表達(dá)，從而引起其結(jié)構(gòu)和功能的改變，由此引發(fā)心臟各種離子通道病，包括長(zhǎng)QT綜合癥(Long QT syndrome,LQTS)、布魯格達(dá)癥候群(Brugada syndrome,BrS)、進(jìn)行性心臟傳導(dǎo)疾病(Progressive cardiac conduction defect,PCCD)、擴(kuò)張型心肌病(Dilated cardiomyopathy,DCM)、病竇綜合癥(Sick sinus syndrome,SSS)、房顫(Atrial fibrillation,AFib)、嬰兒猝死綜合癥(Sudden infant deathsyndrome,SIDS)和重疊綜合癥等[13]。值得注意的是，臨床患者上偶爾發(fā)現(xiàn)β亞基編碼的基因調(diào)控蛋白與SCN5A突變所導(dǎo)致的心律失常疾病具有一定的相似性，這反應(yīng)了β亞基在心臟鈉通道所致疾病中的重要性。

2.1 長(zhǎng)QT綜合癥

LQTS在臨床上表現(xiàn)為QT間期延長(zhǎng)和T波異常，易產(chǎn)生惡性心律失常，導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作性暈厥、心臟驟停甚至猝死等心臟不良事件。延長(zhǎng)QT間隔主要反映在心室肌細(xì)胞動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間增加以及心室復(fù)極延遲。LQTS能夠增加室性快速心律失常猝死的風(fēng)險(xiǎn)，尤其尖端扭轉(zhuǎn)型室性心動(dòng)過(guò)速。遺傳性的LQTS分為不同的類型，每種類型都與蛋白質(zhì)(直接的或間接的調(diào)控蛋白，比如β亞基)基因突變有關(guān)。長(zhǎng)QT綜合癥3型(LQT-3)與SCN5A突變密切相關(guān)，約占LQTS的13%[22]。這些突變大多數(shù)為錯(cuò)義突變，通過(guò)破壞鈉通道快速失活以及導(dǎo)致持續(xù)性鈉電流來(lái)調(diào)控鈉通道的門(mén)控功能。突變導(dǎo)致持續(xù)性鈉電流主要發(fā)生在Nav1.5的快失活區(qū)域，如DⅣ的S4片段，DⅢ～DⅣ的連接段以及DⅢ和DⅣ的S4和S5片段間的連接環(huán)，或者是快失活穩(wěn)定區(qū)，如C末端。C末端可能與DⅢ～DⅣ的連接段相互作用來(lái)穩(wěn)定孔道的失活[23]。幾種不常見(jiàn)的LQTS是由于Nav1.5的調(diào)控蛋白表達(dá)或功能上的改變所致。由SCN4B編碼的β4亞基錯(cuò)義突變，第179位由Leu突變?yōu)镻he，與長(zhǎng)QT綜合癥10型LQTS-10相關(guān)，當(dāng)其與SCN5A共表達(dá)時(shí)，使其失活曲線向正電位移動(dòng)，但不改變其激活，這導(dǎo)致了膜電位對(duì)應(yīng)的動(dòng)作電位三段窗口電流的增加[24]。當(dāng)β1B亞基錯(cuò)義突變，C端213位由Pro突變?yōu)門(mén)hr后與Nav1.5共表達(dá)，導(dǎo)致持續(xù)性鈉電流和動(dòng)作電位持續(xù)時(shí)間增加、窗口電流位移以及慢失活速率降低。利用SCN1B敲除小鼠檢測(cè)β1亞基在心臟興奮性中的作用，與野生型小鼠相比，SCN1B敲除小鼠記錄的心電圖顯示出更長(zhǎng)的RR間期和延長(zhǎng)的QT間隔。在急性分離的心室肌細(xì)胞，SCN1B喪失表達(dá)后峰值和持續(xù)鈉電流增加約1.6倍，而門(mén)控動(dòng)力學(xué)未受影響[25]。這表明β1亞基的喪失與長(zhǎng)QT綜合癥密切相關(guān)。

2.2 布魯格達(dá)癥候群

BrS在臨床上主要表現(xiàn)為由室性心動(dòng)過(guò)速(多態(tài)性心室心動(dòng)過(guò)速和室顫)所導(dǎo)致的猝死風(fēng)險(xiǎn)增高，伴有右側(cè)心電圖導(dǎo)聯(lián)V1-V3的持續(xù)性ST段升高。心電圖的變化通常是隱藏的，但可以通過(guò)1A和1C型抗心律失常藥物如阿吉嗎啉，吡西卡胺等(鈉通道阻滯劑)測(cè)試，表明抑制鈉電流在BrS病理生理學(xué)上的關(guān)鍵作用。10%～30%的BrS患者是由于SCN5A基因突變，包括錯(cuò)義突變，無(wú)義突變和核苷酸缺失或插入。幾乎所有的突變都是蛋白異源表達(dá)(<50%)導(dǎo)致的鈉通道功能喪失如峰值鈉電流減小，或蛋白表達(dá)降低，非功能性通道區(qū)表達(dá)以及門(mén)控功能喪失[3]。SCN5A基因的錯(cuò)義突變，導(dǎo)致DⅢS5和S6之間1406位的Gly突變?yōu)锳rg而發(fā)生BrS[26]。其正常的肌膜定位表達(dá)也可能是由于β亞基或其他與突變Nav1.5相互作用的蛋白互作減少。在BrS上鈉電流的減少可能是編碼β亞基或者心臟鈉通道調(diào)控蛋白的基因發(fā)生突變所致。SCN1B胞外Ig環(huán)87位高度保守的Glu突變?yōu)镚ln后與BrS相關(guān)。當(dāng)異源表達(dá)時(shí)β1亞基被截短，導(dǎo)致其無(wú)法與Nav1.5蛋白互作[20]。SCN2B錯(cuò)義突變，將211位的Asp突變?yōu)镚ly與Nav1.5共表達(dá)時(shí)，導(dǎo)致細(xì)胞表面鈉電流密度減少[27]。SCN3B錯(cuò)義突變，胞外區(qū)10位的Leu突變?yōu)镻ro后擾亂了Nav1.5蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到肌膜上膜，使得鈉電流減少，通道門(mén)控特性發(fā)生改變[28]。

2.3 進(jìn)行性心臟傳導(dǎo)疾病

PCCD在心電圖上表現(xiàn)為傳導(dǎo)參數(shù)P波、PR和QRS間期逐步延長(zhǎng)，右束或左束支傳導(dǎo)阻滯，沒(méi)有ST段抬高或QT間期延長(zhǎng)。完全的房室傳導(dǎo)阻滯可能發(fā)展和導(dǎo)致暈厥或猝死。心電圖的改變表明，通過(guò)心房，房室結(jié)、His束、浦肯野纖維和心室的電傳導(dǎo)減慢，并伴隨與年齡相關(guān)的退行性過(guò)程，其中纖維化僅影響心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)。遺傳性的PCCD傳導(dǎo)減慢可能是由于SCN5A基因突變而功能缺失，包括肌膜上通道蛋白表達(dá)減少、非功能性通道的表達(dá)或者門(mén)控特性改變，致使鈉電流變低，從而延遲激活、更早失活、增強(qiáng)緩慢失活、或從失活中恢復(fù)變慢[13]。SCN5A突變既能導(dǎo)致PCCD的發(fā)生，也能導(dǎo)致PCCD與BrS同時(shí)發(fā)生。說(shuō)明鈉電流減少可導(dǎo)致PCCD或BrS的傳導(dǎo)減慢。在SCN5A基因沒(méi)有突變的PCCD患者中發(fā)現(xiàn)，有兩個(gè)突變導(dǎo)致SCN1B喪失功能，一個(gè)突變截短了β1亞基，使其無(wú)法與Nav1.5蛋白相互作用，結(jié)果是鈉電流密度增加、門(mén)控特性改變。另一個(gè)突變降低了β1亞基增加鈉電流密度和易化共表達(dá)時(shí)鈉通道激活的能力。有趣的是，正常的和突變的β1亞基在浦肯野纖維中表達(dá)的程度高于在心室中的表達(dá)，這說(shuō)明浦肯野纖維肌細(xì)胞中鈉電流的減少可能是PRCD和QRS間期的延長(zhǎng)及PCCD中左右束傳導(dǎo)阻滯的延長(zhǎng)[29]。

3 結(jié)語(yǔ)

目前已知β1亞基與Nav1.5的DⅠ和DⅣ的S5-S6的胞外環(huán)相互作用，且β1亞基的作用區(qū)域?yàn)榘鈪^(qū)，根據(jù)跨膜結(jié)構(gòu)，β1和β3亞基的胞外區(qū)位點(diǎn)相近且同源水平較高(β1亞基:1～153；β3亞基：1～152，圖2B)，據(jù)此推測(cè)，β3亞基與α亞基發(fā)生互作也可能是通過(guò)胞外區(qū)進(jìn)行的。當(dāng)β3亞基的Leu10突變后導(dǎo)致BrS發(fā)生的機(jī)制改變，Leu10在β1亞基上對(duì)應(yīng)的位置是Leu7，故推測(cè)β1亞基的Leu7也是其至關(guān)重要的功能位點(diǎn)。β2亞基的Cys55可與Nav1.2的DⅡS5-S6片段外環(huán)Cys910形成二硫鍵，在Nav1.5的Cys910同源的位置是Leu868[30]。根據(jù)序列比對(duì)(圖2C)，β4亞基與β2亞基的Cys55同源的位置是Cys58，因此推測(cè)，β4亞基可能是通過(guò)Cys58與Nav1.2通道的Cys910發(fā)生互作。

大量體內(nèi)外研究已清晰表明，在不同的生理病理、分子細(xì)胞微環(huán)境、鈉通道β亞基多樣性的內(nèi)源性差異調(diào)控，可直接或間接改變鈉通道的表達(dá)定位及門(mén)控特性。已有研究以毒素為配體切入，闡明鈉通道、β亞基的藥理靶向性及其與疾病的關(guān)聯(lián)。鈉通道β亞基互作組合研究已是藥物研發(fā)和診療的新手段。因此，以β亞基為分子靶點(diǎn)，或使用β亞基特異性功能結(jié)構(gòu)域片段來(lái)探索鈉通道α、β亞基在決定不同細(xì)胞類型內(nèi)在特性的差異性組合方式中的作用，仍將是極具挑戰(zhàn)的重要課題，也必將為闡明靶向鈉通道相關(guān)的疼痛、心室房顫、腫瘤等通道病的分子機(jī)制、臨床診療和新藥研發(fā)提供新策略和重要線索。