腎蕨水提液對小鼠急性酒精肝損傷的影響

韋江蓮，陳雪麗，蘭 嵐，韋 穩(wěn)，蒙 娜，黃盛凱，黃彥峰

（右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

蕨類植物資源豐富，民間用藥歷史悠久。腎蕨系骨碎補(bǔ)科腎蕨屬植物 Nephrolepi scordifolia（L.）Presl，別名馬騮卵、鳳凰蛋、石黃皮、圓羊齒等，是一種具有壯族特色的藥用植物［1］。腎蕨用藥部位為全株或塊莖，具有祛濕消腫、清熱解毒功效，臨床用于治療黃疸、淋濁、小便澀痛、痢疾、疝氣、乳癰、瘰疬、燙傷、刀傷等病癥［2］。民間常用腎蕨全株煎水治療濕熱黃疸，療效良好。近年來，國內(nèi)對腎蕨化學(xué)成分、提取工藝、藥理作用以及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究已取得一定進(jìn)展［3-11］。為進(jìn)一步探究腎蕨對肝臟的保護(hù)作用，本實驗采用酒精灌胃的方式造成小鼠急性酒精肝損傷模型，觀察腎蕨水提液對小鼠急性酒精肝損傷的影響并探討其可能的作用機(jī)制，為研究腎蕨的護(hù)肝作用提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 動物 健康昆明種小鼠50只，雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由右江民族醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK桂2017-0003。

1.2 儀器 TGL-16G型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；PRO200型勻漿機(jī)（PROScientific Inc Oxford CT，USA）；7600service日立自動生化分析儀（日本日立集團(tuán)）；722 N可見分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 藥品及試劑 腎蕨采自百色市東坪水庫，經(jīng)鑒定為骨碎補(bǔ)科腎蕨屬植物 Nephrolepi scordifolia（L.）Presl；聯(lián)苯雙酯滴丸（北京協(xié)和藥廠，批號：15100102）；考馬斯亮藍(lán)試劑、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、總超氧化物歧化酶（SOD）試劑，均購自南京建成生物研究所；56°牛欄山二鍋頭（北京順鑫農(nóng)業(yè)股份有限公司牛欄山酒廠）。

2 方法

2.1 腎蕨水提液的制備［3］將新鮮腎蕨全株烘干粉碎，稱取粗粉10 g，置錐形瓶中，加入蒸餾水100 ml，冷浸24 h，取濾液濃縮至10 ml，即含生藥量1 g/ml，冷藏，用時恢復(fù)至室溫。

2.2 動物分組及給藥 取健康昆明種小鼠50只，雌雄各25只，隨機(jī)將小鼠分為5組：空白組、模型組、聯(lián)苯雙酯滴丸組（0.10 g/kg）、腎蕨水提液低劑量組（3.25 g/kg）及腎蕨水提液高劑量組（6.50 g/kg）。每組10只。聯(lián)苯雙酯滴丸組和腎蕨水提液高、低劑量組分別按每天10ml/kg給藥，空白組和模型組每日給予等量生理鹽水，連續(xù)給藥14d，最后一次給藥1h后除空白組給予等量的生理鹽水外，其余各組小鼠均按15 ml/kg給予56°牛欄山二鍋頭灌胃造模［12］，禁食不禁水 16h。

2.3 指標(biāo)測定

2.3.1 血清ALT、AST的測定 造模16 h后稱量小鼠體重，眼球取血，靜置2 h后，3 500 r/min離心10 min，取上層血清備用［11］。通過自動生化分析儀檢測小鼠血清 ALT、AST。

2.3.2 小鼠肝臟指數(shù)測定 將采血后的小鼠立即處死，同時迅速取出肝臟，并置入冰凍的0.9%氯化鈉溶液中清洗，濾紙吸干表面水分，觀察小鼠臟器外觀，稱肝濕重，并計算肝臟指數(shù)，其中肝臟指數(shù)＝1000×［肝臟濕重/體重］×100%。

2.3.3 肝組織中MDA、GSH、SOD的測定 取小鼠同一部位肝臟左葉，按照1∶9的比例，放入冰凍的生理鹽水中，剪碎后勻漿，制備成10%肝組織勻漿。將10%肝組織勻漿置于離心機(jī)，3 500 r/min離心10 min，吸取上清液留置備用。按照試劑盒說明書進(jìn)行嚴(yán)格操作，通過考馬斯亮藍(lán)法測定小鼠肝組織蛋白質(zhì)濃度，測定肝組織MDA、GSH、SOD吸光度值，通過試劑盒所提供的公式計算肝組織中MDA、GSH、SOD的含量。

2.3.4 肝臟病理組織學(xué)檢查 另取小鼠右葉相同部位肝組織置于10%福爾馬林溶液中保存，組織切片，HE染色，在光鏡下觀察肝臟病理組織學(xué)變化以及圖片采集。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 腎蕨水提液對小鼠急性酒精肝損傷肝指數(shù)的影響 見表1。

表1結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組肝指數(shù)明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯滴丸組及腎蕨水提液低、高劑量組肝指數(shù)均顯著降低（P＜0.01）。

表1 腎蕨水提液對小鼠急性酒精肝損傷肝指數(shù)的影響（x±s）

3.2 腎蕨水提液對小鼠急性酒精肝損傷血清ALT、AST的影響 見表2。

表2結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組血清ALT、AST 含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯滴丸組及腎蕨水提液低、高劑量組的ALT、AST含量均顯著降低（P＜0.01）。

3.3 腎蕨水提液對小鼠急性酒精肝損傷肝組織MDA、GSH、SOD的影響 見表3。

表3結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠肝組織中MDA含量顯著升高（P＜0.01），GSH水平和SOD活性降低（P＜0.05）；與模型組比較，聯(lián)苯雙酯滴丸組及腎蕨水提液低、高劑量組MDA含量顯著降低（P＜0.01），SOD 活性及 GSH 水平顯著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）。

表2 腎蕨水提液對小鼠急性酒精肝損傷血清ALT、AST的影響 （±s）

表2 腎蕨水提液對小鼠急性酒精肝損傷血清ALT、AST的影響 （±s）

注：與空白組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01

組 別 n 劑量（g/kg） ALT（U/L） AST（U/L）空白組 10 — 46.00±6.91 115.70±18.54模型組 10 — 118.70±11.14① 206.70±27.16①聯(lián)苯雙酯滴丸組 10 0.10 55.10±13.04② 25.30±15.70②腎蕨水提液低劑量組 10 3.25 63.00±9.13② 167.78±18.81②腎蕨水提液高劑量組 10 6.50 57.90±11.16② 150.60±18.68②

表3 腎蕨水提液對小鼠急性酒精肝損傷肝組織MDA、GSH、SOD的影響 （±s）

注：與空白組比較，①P＜0.05，②P＜0.01；與模型組比較，③P＜0.05，④P＜0.01

組 別 n 劑量（g/kg） MDA（nmol/ml） GSH（U/ml） SOD（U/ml）空白組 10 — 7.28±1.98 25.01±2.77 228.53±21.99模型組 10 — 24.09±3.55② 19.69±2.35① 206.52±27.69①聯(lián)苯雙酯滴丸組 10 0.10 12.54±3.73④ 23.33±2.22④ 228.62±29.03③腎蕨水提液低劑量組 10 3.25 15.27±4.07④ 22.65±2.36③ 235.79±20.96④腎蕨水提液高劑量組 10 6.50 14.79±6.37④ 22.65±3.11③ 230.98±19.86③

3.4 腎蕨水提液對小鼠急性酒精肝損傷肝臟病理組織學(xué)的影響 肝組織常規(guī)HE染色鏡下可見：空白組小鼠肝細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)正常，輕微水腫，匯管區(qū)有少量炎癥細(xì)胞浸潤，無明顯病理變化；模型組小鼠肝細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)有顯著的病理變化，肝組織結(jié)構(gòu)彌漫性水腫，胞漿腫脹透亮、疏松，有大量炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞明顯溶解、壞死；聯(lián)苯雙酯滴丸組肝細(xì)胞組織有水腫，受炎癥細(xì)胞浸潤，有部分肝細(xì)胞再生表現(xiàn)；腎蕨水提液低劑量組肝細(xì)胞組織有水腫，少量炎癥細(xì)胞浸潤，有肝細(xì)胞再生表現(xiàn)；腎蕨水提液高劑量組肝細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)水腫減輕，極少炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞再生表現(xiàn)明顯。見圖1。

圖1 各組小鼠肝臟組織顯微結(jié)構(gòu)（HE，×200）

4 討論

過量飲用乙醇會導(dǎo)致肝組織損傷，通常認(rèn)為與抗氧化損傷、脂質(zhì)過氧化損傷及免疫損傷等有關(guān)［13］。過量的乙醇在機(jī)體內(nèi)代謝可產(chǎn)生大量的自由基，致使抗氧化能力降低，導(dǎo)致肝細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷。此外，機(jī)體的免疫功能與其免疫器官重量改變密切相關(guān)，在機(jī)體中，肝臟內(nèi)含有吞噬功能強(qiáng)大的免疫細(xì)胞，具有防御免疫能力［14］。由此，本研究將肝臟指數(shù)變化作為觀察指標(biāo)之一。實驗結(jié)果表明，與模型組比較，腎蕨水提液低、高劑量組肝指數(shù)均顯著降低，表明腎蕨水提液可降低急性酒精肝損傷小鼠的肝指數(shù)，對受損肝臟具有一定的保護(hù)作用。在正常的肝臟中，ALT、AST轉(zhuǎn)氨酶對于肝臟代謝極其重要，是反映肝功能的敏感指標(biāo)。當(dāng)肝組織損傷時，細(xì)胞的胞漿及線粒體分別將ALT、AST釋放入血中，造成ALT、AST在血清中的含量有不同程度的升高［15］。與模型組對比，腎蕨水提液低、高劑量組ALT、AST含量明顯降低，說明腎蕨水提液能抑制急性酒精肝損傷小鼠的轉(zhuǎn)氨酶升高。MDA是肝細(xì)胞中發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，側(cè)面反映出肝細(xì)胞損傷的程度［16］。在正常的機(jī)體中存在著抗氧化酶和抗氧化劑，形成了重要的防御系統(tǒng)以對抗活性氧產(chǎn)生的損害。GSH是一種衡量機(jī)體抗氧化能力大小的低分子清除劑［16］。在機(jī)體受到外界因素影響時，SOD保護(hù)細(xì)胞避免受到破壞及清除超氧陰離子自由基，對維持機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起關(guān)鍵作用。與模型組對比，聯(lián)苯雙酯滴丸組及腎蕨水提液低、高劑量組MDA含量降低，SOD活性和GSH水平升高，說明腎蕨水提液可以減少抗脂質(zhì)過氧化和提高抗氧化酶的活性，有效清除活性氧自由基，進(jìn)而對損傷的肝細(xì)胞起到保護(hù)作用。此外，各組小鼠肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)彌漫性水腫，胞漿腫脹透亮、疏松，有大量炎癥細(xì)胞浸潤，肝細(xì)胞明顯溶解、壞死。而經(jīng)過腎蕨水提液干預(yù)后的小鼠，其肝細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)水腫減輕，少量炎癥細(xì)胞浸潤，有肝細(xì)胞再生表現(xiàn)，表明對急性酒精肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，腎蕨水提液對小鼠急性酒精肝損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗脂質(zhì)過氧化、清除超氧陰離子自由基、抑制肝臟炎癥反應(yīng)有關(guān)。由于腎蕨水提液所含成分較為復(fù)雜，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。