溫脾通絡(luò)開竅湯對老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬CA3區(qū)JNK蛋白表達(dá)的影響

黃曉丹 ，吳 林 ，劉 璐 ，呂 燕 ，陳 煒 ，王清碧

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011）

老年性癡呆（alzheimer disease，AD）是以學(xué)習(xí)記憶障礙為主要特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病［1］。目前，它已經(jīng)成為繼心臟病、腫瘤、腦卒中后引起成人死亡的第四位病因［2］，因此，及早發(fā)現(xiàn)并干預(yù)治療極其重要。研究表明，細(xì)胞凋亡是AD的發(fā)病機理，在細(xì)胞凋亡過程中，c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal Kinase，JNK）信號途徑是其關(guān)鍵環(huán)節(jié)［3］。痰濁瘀血阻竅是老年性癡呆的關(guān)鍵病機，本課題組在臨床上應(yīng)用溫脾通絡(luò)開竅湯治療老年性癡呆療效良好。為進一步探討溫脾通絡(luò)開竅湯治療AD的作用機制，本實驗通過在大鼠海馬CA3區(qū)注射岡田酸誘導(dǎo)老年性癡呆動物模型，用Morris水迷宮檢測AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，并采用Western blot技術(shù)檢測海馬CA3區(qū)神經(jīng)元JNK蛋白的表達(dá)變化，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 實驗材料

1.1 動物 120只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量250±30 g，購于廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，合格證號：0006453；飼養(yǎng)條件：室溫控制在22℃左右，自由飲食、進水。

1.2 試藥與試劑 溫脾通絡(luò)開竅湯由黃芪30 g、益智仁 10 g、三七 10 g、石菖蒲 10 g、何首烏 10 g、絞股藍(lán)10 g組成，由江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司提供中藥配方顆粒（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院統(tǒng)一購置）。石杉堿甲為浙江震元制藥有限公司產(chǎn)品（規(guī)格：每片50μg；批號：120303）；岡田酸（OA）為美國 Sigma公司產(chǎn)品（批號：04511）；二甲亞楓（DMSO）為 Amresco公司產(chǎn)品（批號：120303）。

2 方法

2.1 造模方法 120只大鼠隨機分為6組：假手術(shù)組、模型組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組、石杉堿甲組，每組20只。大鼠予10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，麻醉后放在腦立體定位儀上固定。參照大鼠腦立體定位圖譜［4］，以右側(cè)海馬CA3區(qū)（前囟后3.0mm，中線右側(cè)旁開2.2mm，深度為顱骨下2.7mm）為注射靶點，注射0.4 mmol/L的岡田酸（用10%的二甲亞砜溶解配制）5μl，留針10 min，使藥物充分彌散吸收。隔天注射1次，共7次。假手術(shù)組手術(shù)步驟同上，于相同部位注射等體積的10%二甲亞砜。術(shù)后傷口適量用紅霉素軟膏外涂，并予每只大鼠腹腔注射8萬U青霉素鈉預(yù)防感染。

2.2 給藥方式 中藥低、中、高劑量組給予溫脾通絡(luò)開竅湯灌胃，劑量分別為 4.15 g/kg、8.30 g/kg、16.90 g/kg，灌胃容積為10 ml/kg體重；石杉堿甲組予石杉堿甲溶液（片劑研末后以雙蒸水調(diào)配）灌胃給藥，劑量為0.003 g/kg，灌胃容積為 10 ml/kg 體重；假手術(shù)組、模型組經(jīng)灌胃針予相同容量的生理鹽水。每日1次，連續(xù)灌胃30天。以上干預(yù)措施均以30天為觀察周期。

2.3 空間探索實驗 末次給藥禁食24 h后，參考Gong等［5］方法，將水池等分為4個象限，并在第4象限中心放置一低于水面3 cm的黑色圓形平臺為逃生平臺，水溫25℃左右，保持水池周圍的參照物不變。由水迷宮上方2 m處的監(jiān)視錄像機追蹤大鼠的逃避潛伏期時間、運動軌跡、空間探索中的跨越平臺次數(shù)，設(shè)定記錄時間為60 s，如超過60 s內(nèi)未找到逃生平臺，則引導(dǎo)大鼠上平臺停留10 s。前5天每天1次，分別在4個象限訓(xùn)練1次，每次訓(xùn)練間隔60 s，定位航行結(jié)束后撤掉平臺，記錄60 s內(nèi)其跨越逃生平臺的次數(shù)，取每只大鼠4個象限的平均成績作為總成績。

2.4 Western blot實驗 行為學(xué)測試結(jié)束后，采用心臟灌注后取腦的方法，用10%的水合氯醛（3 ml/kg）對大鼠進行腹腔注射麻醉，消毒，并立即開胸暴露大鼠心臟，進行心尖快速灌注0.9%氯化鈉溶液，使肝臟變?yōu)榘咨蛴倚亩幜鞒龅囊后w基本清澈后即可停止灌注，并采取冰臺上斷頭取新鮮的腦組織置入液氮中存放。取海馬CA3區(qū)組織，剪下約3 mm厚，用液氮研磨，研磨好備用。制備SDS-PAGE膠，上樣，連接電源，設(shè)定恒壓為60 V，30 min之后恒壓為80 V，電泳1.5 h。免疫印跡檢測：用封閉液室溫封閉膜2 h；孵育一抗，沖洗；孵育二抗，用PBST洗膜3次。將X光片置于顯影液中，顯好條帶后取出清洗，并在定影液中將其定影。取出待干后掃描。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 各組大鼠在空間探索實驗中的跨越平臺次數(shù)比較 見表1。

表1 各組大鼠跨越平臺次數(shù)比較 （±s）

表1 各組大鼠跨越平臺次數(shù)比較 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.05，③P＜0.01；與石杉堿甲組比較，④P＜0.01

組 別 n 劑量（g/kg） 跨越平臺次數(shù)（次）假手術(shù)組 20 — 8.21±2.11模型組 20 — 3.82±1.05①石杉堿甲組 20 0.003 6.95±1.56③中藥低劑量組 20 4.15 4.53±1.13②④中藥中劑量組 20 8.30 5.12±1.72②④中藥高劑量組 20 16.90 7.02±1.09③

表1顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在空間探索實驗中跨越平臺的次數(shù)明顯減少（P＜0.01）；與模型組比較，各用藥組均能增加大鼠跨越平臺的次數(shù)（P＜0.05 或 P＜0.01）；與石杉堿甲組比較，中藥低、中劑量組大鼠跨越平臺的次數(shù)明顯減少（P＜0.01），而中藥高劑量組大鼠跨越平臺的次數(shù)與石杉堿甲組無顯著性差異（P＞0.05）。

3.2 各組大鼠海馬CA3區(qū)JNK蛋白陽性表達(dá)量比較見圖 2、表 2。

圖2 各組大鼠JNK蛋白條帶圖

表2 各組大鼠海馬CA3區(qū)JNK蛋白陽性表達(dá)量比較（s）

表2 各組大鼠海馬CA3區(qū)JNK蛋白陽性表達(dá)量比較（s）

注：與假手術(shù)組比較，①P＜0.01；與模型組比較，②P＜0.01；與石杉堿甲組比較，③P＜0.05

組 別 JNK蛋白陽性表達(dá)量假手術(shù)組 0.433±0.127模型組 2.307±1.359①石杉堿甲組 0.808±0.312②中藥低劑量組 1.559±0.942②③中藥中劑量組 1.403±0.591②③中藥高劑量組 1.108±0.367②n 劑量（g/kg）20 —20 —20 0.003 20 4.15 20 8.30 20 16.90

表2顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CA3區(qū) JNK 蛋白陽性表達(dá)量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各用藥組大鼠海馬CA3區(qū)JNK蛋白陽性表達(dá)量均有顯著下降（P＜0.01）；各用藥組中石杉堿甲組JNK蛋白陽性表達(dá)量降低效果最為明顯，優(yōu)于中藥中、低劑量組（P＜0.05），而與中藥高劑量組差異無顯著性意義（P＞0.05）。

4 討論

老年性癡呆以學(xué)習(xí)記憶障礙為最重要的臨床癥狀，改善學(xué)習(xí)記憶能力成為當(dāng)今神經(jīng)科研究的熱點之一。行為學(xué)檢測是判斷老年性癡呆的基本方法，Morris水迷宮作為研究神經(jīng)系統(tǒng)病癥最常用的工具之一，在行為學(xué)檢測中具有十分重要的意義，尤其在嚙齒類動物神經(jīng)認(rèn)知疾病模型的研究中廣泛使用，已成為研究嚙齒類動物行為學(xué)的經(jīng)典實驗方法［6］，故本課題采用此方法檢測大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)遞質(zhì)及其信號傳遞通路在學(xué)習(xí)、記憶中起著關(guān)鍵的作用，特別是NF-κB信號通路在突觸可塑性中發(fā)揮極其重要的作用［7］。NF-κB信號通路主要通過自由基、氧化應(yīng)激及神經(jīng)炎癥途徑參與了AD的病理生理過程。JNK作為一類調(diào)節(jié)蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周邊神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。JNK等基因在其他旁路途徑對NF-κB的活化同樣起著至關(guān)重要的作用［8］。研究表明，引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡包括老年性癡呆在內(nèi)的退行性變的主要原因是NF-κB活化受到抑制［9］，神經(jīng)細(xì)胞遭遇外界凋亡刺激時激活了JNK，JNK介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過程［10］。因此，本研究通過誘導(dǎo)老年性癡呆大鼠模型，在早期及時進行用藥干預(yù)，觀察各組大鼠海馬CA3區(qū)JNK蛋白的表達(dá)變化情況，以探討溫脾通絡(luò)開竅湯對改善老年性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的作用機制。

老年性癡呆屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”“癡呆”范疇。清代陳士鐸在《辨證錄·呆病門》中論及癡呆的治療方法中談到“治呆無奇法，治痰即治呆”［11］。本課題組亦認(rèn)為痰濁瘀血阻竅乃是老年性癡呆的關(guān)鍵病機，倡導(dǎo)“溫脾通絡(luò)開竅”之法，在AD早期用溫脾通絡(luò)開竅湯進行干預(yù)治療，防止疾病發(fā)展。方中黃芪為主藥，功專補氣升陽，其中黃芪甲苷能抑制海馬神經(jīng)元的凋亡［12］；益智仁取其溫腎陽以助脾陽之意，具有抗癌、抗氧化等作用，能夠改善記憶障礙［13］；三七通絡(luò)活血，其中三七總皂苷能減輕AD的病理損害［14］；石菖蒲豁痰開竅醒神，能提高腦內(nèi)SOD酶活性，降低MDA的水平［15］；何首烏補益肝腎，具有改善學(xué)習(xí)記憶的作用［16］；絞股藍(lán)溫脾化痰，具有保護神經(jīng)功能、抗氧化的作用［17］。諸藥相合，溫脾以治本，通絡(luò)祛痰以除標(biāo)，達(dá)到開竅醒神之效［18］。

前期研究已證實，溫脾通絡(luò)開竅湯可明顯改善AD大鼠學(xué)習(xí)及記憶功能［19］。本課題通過AD大鼠模型，觀察大鼠跨越平臺的平均次數(shù)及藥物對海馬CA3區(qū)神經(jīng)元JNK蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果表明，中藥組及石杉堿甲組大鼠跨越平臺的次數(shù)明顯增加，優(yōu)于模型組；隨著藥物濃度的增高，中藥組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力改善越明顯（P＜0.05 或 P＜0.01），中藥高劑量組跨越平臺的次數(shù)與石杉堿甲組跨越平臺的次數(shù)相當(dāng)。根據(jù)JNK蛋白表達(dá)量可知，與模型組相比，用藥組表達(dá)均有一定程度的下降，其中石杉堿甲組降低效果最為明顯，中藥高劑量組和石杉堿甲組效果相當(dāng)。隨著藥物濃度的增高，中藥組降低JNK蛋白表達(dá)量效果越好（P＜0.01）。由上可知，溫脾通絡(luò)開竅湯能夠改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，可能與其下調(diào)海馬CA3區(qū)JNK的蛋白表達(dá)量，進而減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程相關(guān)，具體機制還有待進一步探討。