急性肝衰竭小鼠necroptosis的發(fā)生及Nec-1的干預(yù)作用研究

趙攀，楊昊臻，高雪，段鋒，陳婧，劉歆穎，徐軍

急性肝衰竭(acute liver failure, ALF)主要以凝血異常和肝性腦病為臨床特征[1]，發(fā)病快、進展迅速、預(yù)后差、病死率極高[2]。肝移植是目前內(nèi)科保守治療失敗時惟一有效的救治方式，但ALF的發(fā)病急驟、肝源短缺導致我國ALF的肝移植率極低。故此，研究ALF的發(fā)病機制就顯得相當重要，旨在促進全新且有效的內(nèi)科治療方法的產(chǎn)生[3]，從而改善ALF的預(yù)后并降低ALF相關(guān)的肝移植率和病死率。

ALF的發(fā)病機制復(fù)雜，最明顯的病理學特征是大量肝細胞的死亡[4-5]。程序性壞死(necroptosis)是近幾年被發(fā)現(xiàn)和描述的一種不依賴于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)激活的細胞程序性死亡方式，由受體相互作用蛋白(receptor-interacting protein, RIP)介導且可被程序性壞死特異性抑制劑-1(necrostatin-1, Nec-1)所抑制。雖然程序性壞死與凋亡有共同的上游分子機制，但是兩者結(jié)果不同。程序性壞死的最終結(jié)果是線粒體功能障礙，細胞器及細胞腫脹破裂，質(zhì)膜透化，細胞內(nèi)含物漏出，周圍組織產(chǎn)生炎性反應(yīng)[6-7]。與凋亡相區(qū)別的是，程序性壞死不影響核固縮，不產(chǎn)生核小體DNA片段。 現(xiàn)探討程序性壞死在ALF發(fā)病中的作用機制并觀察Nec-1對ALF預(yù)后的影響，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動物來源：SPF級雄性C57/BL6小鼠60只(購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，6～7周齡，體質(zhì)量20～25 g，室溫飼養(yǎng)，飼料為普通動物飼料。(2)試劑試藥：受體相互作用蛋白-1(RIPl)、受體相互作用蛋白-3(RIP3)、β-actin購自Santa公司，均為兔抗來源，稀釋比例分別為1∶400、1∶500、1∶1 000；Nec-1、甘氨酸、過硫酸胺(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、Tris-HCl、SDS、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰、Tween-20、麗春紅染色液、二甲基亞砜(DMSO)、D-半乳糖胺(D-GalN)、脂多糖(LPS)均購自Sigma公司，D-半乳糖胺(D-GalN)和脂多糖(LPS)均使用無菌等滲鹽水溶解，分別配置成D-GaIN 100 mg/ml，LPS 1 mg/ml原液并分裝保存。(3)儀器設(shè)備：PCR儀(Thermo Electron Corporation生產(chǎn))、離心機(Thermo Electron Corporation生產(chǎn))、旋渦混合器(海門市麒麟醫(yī)用儀器廠生產(chǎn))、生化分析檢測儀(美國Beckman Coulter公司生產(chǎn))、電泳儀(Major Science生產(chǎn))等。

1.2 實驗方法 2017年6月—2018年3月在解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心進行動物實驗。小鼠以隨機數(shù)字表法分為3組，每組20只：模型組，D-GalN 350 mg/kg和LPS 30 μg/kg腹腔注射造模；對照組，腹腔注射與模型組等體積無菌生理鹽水；干預(yù)組，造模方法同模型組，造模前10 min給予Necrostatin-1 20 mg/kg溶于二甲基亞砜(DMSO)；各組分別于注射后(干預(yù)組于造模后)1 h、2h、3h斷頸處死小鼠，每個時間點5只，留血并取小鼠肝左葉浸入4%多聚甲醛，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度5 μm，蘇木素—伊紅(HE)染色，由一位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師對肝組織病理學變化進行評估。

1.3 檢測指標與方法

1.3.1 血清ALT及炎性因子檢測：小鼠血清ALT采用Beckman全自動生物化學分析儀進行測定，血清TNF-α、IL-6、IL-10采用ELISA試劑盒進行檢測。

1.3.2 RIP檢測：(1)取小鼠肝組織20 mg，每10 mg組織加入組織蛋白裂解液100 μl,用玻璃研磨器于冰上勻漿。將勻漿液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5 ml EP管中，置于冰上15 min，以充分裂解。4℃，12 000 r/min離心10 min。將離心后的上清分裝轉(zhuǎn)移到0.5 ml的離心管中，-20℃凍存。(2)將BCA試劑A和BCA試劑B以50∶1配制適量BCA工作液，充分混勻。完全溶解蛋白標準品，取10 μl稀釋至100 μl，終濃度為0.5 mg/ml。將標準品按0、1、 2、 4、 8、 12、 16、 20 μl加到96孔板的標準品孔中，加入用于稀釋標準品的溶液并補足到20 μl。加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中，加入用于稀釋標準品的溶液并補足到20 μl。各孔加入BCA工作液200 μl，37℃放置30 min。根據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度。(3)配膠電泳，待溴酚藍電泳至膠底部時終止電泳。(4)PVDF膜先在甲醇中浸濕，然后與濾紙一起放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中，至完全浸透，轉(zhuǎn)膜60 min。轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜取出放入TBS-T中清洗5 min。用TBST配制5%脫脂奶粉，將膜浸入后，室溫放置1 h。(5)用封閉液將一抗按照一定比例稀釋，RIP1(Santa Cruz Biotechnology提供)按1∶400；RIP3(Santa Cruz Biotechnology提供)按1∶500；β-actin(Cell Signaling Technology提供)按1∶1 000，將膜與一抗一起孵育，4℃過夜。孵育結(jié)束，TBS-T清洗3次，每次5 min。(6)用封閉液稀釋HRP標記的二抗(羊抗兔IgG，Santa Cruz Biotechnology提供)，稀釋比例1∶10 000，將稀釋后的二抗與膜共同孵育1 h。孵育結(jié)束，TBS-T洗3次，每次5 min。(7)ECL曝光，將顯色后的膜掃描，用IPP6軟件對圖像進行灰度分析。

2 結(jié) 果

2.1 血清ALT及炎性因子比較 與對照組比較，造模后1 h模型組小鼠ALT、TNF-α、IL-6、IL-10均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。干預(yù)組ALT、TNF-α、IL-6、IL-10均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2 肝組織RIP1和RIP3表達比較 與對照組比較，造模后1 h模型組小鼠肝組織RIP1和RIP3的表達明顯升高(t=5.867，P<0.001；t=4.388，P=0.002)；與模型組比較，干預(yù)組RIP3的1 h、2 h、3 h表達水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，RIP1在1 h和2 h水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，但其3 h的水平低于模型組且差異有統(tǒng)計學意義(t=2.416,P=0.041)。見圖1、2。

表1 不同組別小鼠血清ALT及炎性因子比較

注：與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

圖1 各組小鼠肝組織RIP1表達情況(標示值為均值)

注：與對照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01

圖2 各組小鼠肝組織RIP3表達情況(標示值為均值)

2.3 小鼠肝組織病理變化 造模后1 h、2 h、3 h，模型組小鼠的病理變化隨時間遞進而加重，3 h肝細胞腫脹明顯伴有大量炎細胞浸潤，而干預(yù)組3 h的病變程度明顯好于模型組。圖3見封3。

3 討 論

課題組成員前期進行了D-GalN和LPS造模的動物實驗研究，在模型的優(yōu)化方面積累了較好的經(jīng)驗[8]。D-GalN是一種肝毒性藥物，通過半乳糖途徑代謝并消耗該途徑的中間代謝產(chǎn)物尿苷二磷酸，進而抑制尿嘧啶核苷的代謝，導致核蛋白質(zhì)合成受阻，引起肝細胞損傷。LPS是革蘭陰性菌胞壁成分，可引起細胞吞噬功能障礙，導致血漿內(nèi)毒素水平升高，進一步誘發(fā)肝衰竭[9]。

ALF的病死率極高，除外其發(fā)病急驟的特征外，缺乏有效的內(nèi)科治療是造成ALF病死率居高不下的最主要原因[10-12]。隨著necroptosis被新近發(fā)現(xiàn)并在多種器官疾病的發(fā)病機制中得到深入研究，necroptosis與肝臟疾病的聯(lián)系開始受到關(guān)注[13]。Gautheron等[14]的報道顯示，RIP3依賴的necroptosis調(diào)控非酒精性脂肪性肝炎誘導的肝纖維化，并預(yù)測這一通路很可能啟示新的和特定的非酒精性脂肪性肝炎藥物治療策略的產(chǎn)生。Roychowdhury等[15]的研究表明，小鼠RIP3的缺失可防止乙醇誘導的肝損傷。Li等[16]的研究顯示，選擇性抑制RIP3可緩解對乙酰氨基酚引起的肝損傷。

雖然necroptosis與上述肝臟疾病的關(guān)系已有所闡述，但其在ALF中的機制探討非常少見。Takemoto等[17]的實驗結(jié)果顯示，Nec-1可以拮抗necroptosis過程中ROS誘導的肝臟毒性，對乙酰氨基酚引起的ALF有防護作用。本結(jié)果顯示，RIP1和RIP3蛋白在急性肝衰竭小鼠的肝臟中表達顯著升高，表明急性肝損傷時necroptosis明顯發(fā)生，但具體機制需要進一步研究[18-19]。此外，作為necroptosis的特異性抑制因子，Dec-1對降低肝損傷時的ALT和相關(guān)炎性因子水平具有較好效果，值得進行深入研究。

本實驗在造模后1 h，模型組ALT、TNF-α、IL-6、IL-10、RIP1、RIP3較對照組顯著升高，標志造模成功，necroptosis發(fā)生；干預(yù)組與模型組比較，相關(guān)指標降低明顯，表明Nec-1對ALF時發(fā)生的necroptosis有顯著改善作用，而且肝臟病理組織評估結(jié)果亦有改善。該研究發(fā)現(xiàn)與Takemoto等[17]的實驗結(jié)論一致，表明急性肝損傷時有necroptosis的發(fā)生，特異性抑制劑Nec-1可以改善ALF的病變進展。

本研究未對動物的生存率進行觀察，是本研究的局限性所在。但是，本研究論證了程序性壞死在急性肝衰竭中的發(fā)生情況并觀察了程序性壞死特異性抑制劑-1對肝細胞程序性壞死的抑制作用，達到了先期的既定目標，為進一步明確急性肝衰竭的發(fā)病機制及開發(fā)新的治療策略提供了數(shù)據(jù)支持和參考。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

趙攀：研究設(shè)計，數(shù)據(jù)分析，文獻調(diào)研，論文撰寫，論文終審；楊昊臻：研究設(shè)計，實驗實施，論文修改；高雪：數(shù)據(jù)分析，論文修改；段鋒：實驗實施，論文終審；陳婧：數(shù)據(jù)分析，論文終審；劉歆穎：實驗實施，論文修改；徐軍：實驗實施，論文修改