空氣細(xì)顆粒物PM2.5水溶成分對(duì)人黑素細(xì)胞系PIG1增殖、遷移和黑素合成的影響

索丹鳳 曾三武 孟令賀 張峻嶺天津市第一中心醫(yī)院皮膚科 3009；天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院皮膚科 3000

空氣細(xì)顆粒物（particulate matter，PM）污染可危害人體健康。作為霧霾重要組成部分的PM2.5可誘發(fā)或加重人體多個(gè)系統(tǒng)疾病［1］。國(guó)內(nèi)外大量流行病學(xué)調(diào)查顯示，顆粒物濃度的上升與疾病的發(fā)病率、死亡率關(guān)系密切，尤其是呼吸系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)疾病［2-4］。皮膚作為人體最大的器官，直接暴露于空氣污染物中，時(shí)刻受到污染物的威脅［5］。黑素細(xì)胞作為表皮的重要組成成分，在生長(zhǎng)、分化、增殖、遷移、凋亡、黑素合成等過(guò)程中某一個(gè)或幾個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常，將導(dǎo)致黑素形成和沉著異常，發(fā)生色素障礙性疾病。迄今未見(jiàn)有關(guān)PM對(duì)黑素細(xì)胞影響的報(bào)道。本研究旨在探討PM2.5對(duì)人黑素細(xì)胞系PIG1增殖、遷移、酪氨酸酶活性及黑素含量等生物學(xué)特性的影響，進(jìn)而為PM2.5在皮膚病學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

一、材料與方法

（一）材料：黑素細(xì)胞系PIG1、細(xì)胞培養(yǎng)液（上海Sciencell公司），0.25%胰酶、4%多聚甲醛溶液（上海索萊寶生物科技公司），DMEM培養(yǎng)液（美國(guó)Hyclone公司），NaOH（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司），TritonX-100［生工生物工程（上海）有限公司］，Transwell小室（美國(guó)Corning公司），結(jié)晶紫染液（上海碧云天生物公司）。噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒、左旋多巴（L-DOPA）、牛血清白蛋白（BSA）及二甲基亞砜（DMSO）均來(lái)自美國(guó)Sigma公司。

（二）方法：

1.PM2.5的采集及制備［6］：選取天津市汽車流量大、污染較重的地區(qū)為采樣點(diǎn)。采用JCH-120F-02型智能顆粒物采樣器（青島聚創(chuàng)環(huán)?？萍加邢薰荆┦占膳眷F霾天氣PM2.5于專用質(zhì)量分析纖維濾紙上，將載有顆粒物的濾紙剪成1 cm×1 cm小塊浸于三蒸水中，4℃環(huán)境下超聲振蕩30 min，共4次，洗脫顆粒物，振蕩液經(jīng)6層紗布過(guò)濾，將濾液置于真空冷凍干燥機(jī)中真空冷凍干燥成干粉，-20℃保存?zhèn)溆?。臨用前稱取一定量PM2.5干粉，在超凈臺(tái)中加入DMEM培養(yǎng)液超聲振蕩15 min混勻并滅菌，配制成終質(zhì)量濃度為 0、10、20、50、100、200 mg/L 的混懸液備用。由于PM2.5為混合物，其水溶成分可以溶于培養(yǎng)基內(nèi)，而脂溶成分不溶解，因此本研究探討其水溶成分對(duì)黑素細(xì)胞的影響。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：人黑素細(xì)胞系PIG1培養(yǎng)于含10%胎牛血清的254培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3.MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：消化、計(jì)數(shù)PIG1細(xì)胞，配制成5×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，向96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入0.1 ml細(xì)胞懸液，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。將PIG1細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組分別用0.1 ml 10、20、50、100、200 mg/L PM2.5 工作液處理，對(duì)照組不加PM2.5，其他處理同實(shí)驗(yàn)組，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄上清液，PBS洗滌2次后，每孔加入100 μl MTT溶液（1 g/L），在培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h；棄上清液，每孔加入150 μl DMSO溶解，輕輕混勻10 min，置酶標(biāo)儀570 nm處讀取各孔吸光度（A值），計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率（%）=實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均值。

4.微孔膜法檢測(cè)細(xì)胞遷移：按照上述方法調(diào)整PIG1細(xì)胞至5 × 104個(gè)/ml。取200 μl細(xì)胞懸液加入Transwell上室，下室加入500 μl 10 mg/L PM2.5工作液（預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示該濃度PM2.5對(duì)黑素細(xì)胞增殖無(wú)抑制或促進(jìn)作用），在培養(yǎng)箱中孵育48 h后，取出Transwell上室，棄去孔中培養(yǎng)液，擦掉上層未穿過(guò)膜的細(xì)胞。用PBS洗2遍，4%多聚甲醛溶液4℃固定15 min；0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用PBS洗3遍，自然干燥。每孔加0.1 ml 33%（質(zhì)量濃度）醋酸脫色，充分振蕩后用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處A值以間接反映細(xì)胞數(shù)量。設(shè)3個(gè)復(fù)孔，取平均值。遷移率（%）=遷移細(xì)胞A值/遷移前細(xì)胞A值×100%。

5.多巴氧化法檢測(cè)酪氨酸酶活性：調(diào)整PIG1細(xì)胞至2×105個(gè)/ml，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入2 ml細(xì)胞懸液后置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。PIG1細(xì)胞亦分為對(duì)照組和5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，向?qū)嶒?yàn)組每孔加入2 ml PM2.5工作液，使其終濃度分別為10、20、50、100、200 mg/L，對(duì)照組加入不含PM2.5的工作液2 ml，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。棄上清液，PBS洗滌2次，每孔加入1%Triton X-100溶液，迅速放入-80℃冰箱內(nèi)30 min，室溫融化，重復(fù)3次使細(xì)胞完全破裂。37℃預(yù)溫后加入10 g/L左旋多巴溶液，37℃孵育30 min，置酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定A值（表示酪氨酸酶活性）。每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，取平均值。

6.NaOH裂解法檢測(cè)黑素含量：按上述多巴氧化法檢測(cè)酪氨酸酶活性方法對(duì)PIG1細(xì)胞進(jìn)行分組處理，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，棄上清液，PBS洗滌2次后使用0.25%胰酶消化、PBS洗滌并離心得到沉淀。加入含10%DMSO的NaOH溶液0.5 ml，充分振蕩，于80℃水浴中封口靜置30 min。用酶標(biāo)儀在470 nm處測(cè)定A值（表示黑素含量）。每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，取平均值。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。計(jì)量資料用±s表示，兩個(gè)樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK法，相關(guān)性分析采用線性相關(guān)分析方法。

二、結(jié)果

1.不同濃度PM2.5對(duì)人黑素細(xì)胞PIG1增殖的影響：各組間PIG1細(xì)胞增殖率（表1）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=121.90，P＜0.01），10 mg/L PM2.5組與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=2.13，P＞0.05），20、50、100、200 mg/L PM2.5組與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為6.30、11.17、19.36、28.84，均P＜0.05），且隨著PM2.5濃度（20 ～200 mg/L）升高，細(xì)胞增殖率逐漸降低（r=-0.98，P＜0.01）。

2.PM2.5對(duì)人黑素細(xì)胞PIG1遷移的影響：見(jiàn)圖1。10 mg/L PM2.5組細(xì)胞遷移率為（66.23±1.11）%，對(duì)照組為（76.86±1.81）%，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.55，P＜0.01）。

3.不同濃度PM2.5對(duì)人黑素細(xì)胞PIG1酪氨酸酶活性的影響：見(jiàn)表1。各組PIG1細(xì)胞酪氨酸酶活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=283.64，P＜0.01），10 mg/L PM2.5組與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=0.22，P＞0.05）；20、50、100、200 mg/L組與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為10.74、22.42、31.92、40.66，均P＜0.01），各組間差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），且隨著PM2.5濃度（20～200 mg/L）升高，酪氨酸酶活性逐漸降低（r=-0.93，P＜0.01）。

4.不同濃度PM2.5對(duì)人黑素細(xì)胞PIG1黑素含量的影響：見(jiàn)表1。各組PIG1細(xì)胞黑素含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=123.00，P＜0.01）。10、20 mg/L PM2.5組與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為2.16、2.98，均P＞0.05）；50、100、200 mg/L PM2.5組與對(duì)照組相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為13.37、22.64、25.50，均P＜0.01）；50 mg/L PM2.5組與100、200 mg/L PM2.5組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q值分別為9.27、12.13，均P＜0.01）；100與200 mg/L PM2.5組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（q=2.85，P＞0.05）。相關(guān)性分析顯示，隨著PM2.5濃度（50～200 mg/L）升高，黑素含量下降（r=-0.97，P＜0.01）。

圖1 微孔膜法檢測(cè)PM2.5對(duì)人黑素細(xì)胞PIG1遷移的影響（×200） 1A：對(duì)照組；1B：10 mg/L PM2.5組

表1 不同濃度PM2.5對(duì)人黑素細(xì)胞PIG1增殖率、酪氨酸酶活性和黑素含量的影響（±s）

表1 不同濃度PM2.5對(duì)人黑素細(xì)胞PIG1增殖率、酪氨酸酶活性和黑素含量的影響（±s）

注：n=4。a與對(duì)照組相比，P＜0.01

PM2.5濃度0（對(duì)照組）10 mg/L 20 mg/L 50 mg/L 100 mg/L 200 mg/L細(xì)胞增殖率（%）100.00±1.41 97.77±0.88 93.41±2.13a 88.31±1.36a 79.75±1.89a 69.83±2.50a酪氨酸酶活性（A490值）0.307±0.006 0.306±0.005 0.268±0.009a 0.225±0.011a 0.191±0.005a 0.159±0.006a黑素含量（A470值）0.217±0.005 0.212±0.005 0.210±0.006 0.183±0.006a 0.159±0.004a 0.151±0.005a

三、討論

以往研究表明，PM2.5可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡［7］，且PM2.5能夠誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)［8］。黑素細(xì)胞是表皮中另一重要組成成分，而有關(guān)PM2.5對(duì)其的影響暫未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究顯示，20、50、100、200 mg/L PM2.5對(duì)PIG1細(xì)胞增殖及酪氨酸酶活性均具有明顯抑制作用，且濃度越高，抑制作用越明顯；50、100、200 mg/L PM2.5可降低黑素細(xì)胞的黑素含量；10 mg/L PM2.5可抑制黑素細(xì)胞遷移。以上結(jié)果表明，PM2.5對(duì)黑素細(xì)胞增殖、遷移、酪氨酸酶活性、黑素合成均有抑制作用，可造成毒性損傷。由于PM2.5成分復(fù)雜，其表面可吸附大量有毒有害物質(zhì)如重金屬、酸性氧化物、有機(jī)污染物、細(xì)菌和病毒等，究竟是哪一種或幾種組分引起黑素細(xì)胞毒性損傷及損傷機(jī)制，均待進(jìn)一步研究。此外，PM2.5的生物學(xué)毒性作用可能是非特異性的，在后續(xù)的研究中我們擬以角質(zhì)形成細(xì)胞做為平行對(duì)照，并建立二者共培養(yǎng)體系，以闡釋PM2.5是否存在黑素細(xì)胞的專一毒性效應(yīng)及其效應(yīng)機(jī)制。

綜上，本研究為PM2.5在皮膚病學(xué)領(lǐng)域尤其是色素性疾病的相關(guān)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。但由于本研究?jī)H在體外環(huán)境下評(píng)價(jià)了PM2.5對(duì)培養(yǎng)的人黑素細(xì)胞系PIG1的影響，存在一定的局限性，將來(lái)還需在體內(nèi)環(huán)境下進(jìn)行更加深入的研究。