南美白對蝦致病性弧菌的鑒定及藥敏分析

高楊

摘?要：由丹東東港市某養(yǎng)殖場患病的南美白對蝦（Penaeus vannamei）幼蝦組織體內(nèi)分離出一株優(yōu)勢菌，通過全自動(dòng)細(xì)菌分析儀及16s rDNA序列分析對該菌株進(jìn)行鑒定，命名為DS180707。并進(jìn)行人工感染試驗(yàn)和藥敏實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，本次患病幼蝦致病菌為溶藻弧菌，且具有較強(qiáng)的致病性。該菌對氟苯尼考、氯霉素 、恩諾殺星、諾氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等6種抗生素敏感。

關(guān)鍵詞：南美白對蝦（Penaeus vannamei）;溶藻弧菌;藥敏實(shí)驗(yàn)

南美白對蝦（Penaeus vannamei）又叫做凡納賓對蝦或白腳蝦[1]，原產(chǎn)于中、南美太平洋沿岸水域。1988年中科院海洋研究所首次從美國引進(jìn)南美白對蝦[2]，由于其生長速度快、抗病能力強(qiáng)[3]，成為世界養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的品種之一。丹東地處河口地區(qū)，海、淡水資源豐富，適合南美白對蝦養(yǎng)殖。

隨著淡水高密度養(yǎng)殖模式的興起，南美白對蝦的病害也頻繁發(fā)生。南美白對蝦細(xì)菌性疾病的主要原因是弧菌病[1]。筆者從丹東東港市某養(yǎng)殖場患病的南美白對蝦以及池塘水樣進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定，水質(zhì)理化指標(biāo)測定，16s rDNA序列分析及藥敏試驗(yàn)，為南美白對蝦弧菌病的研究提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

2018年7月，東港市某白對蝦養(yǎng)殖戶反應(yīng)養(yǎng)殖的南美白對蝦行動(dòng)遲緩、生長緩慢。筆者現(xiàn)場取患病南美白對蝦150尾，體長約3～5 cm。健康幼蝦取自東港市某養(yǎng)殖場。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?肉眼檢查及剖檢?將患病幼蝦通過肉眼觀察體表癥狀，解剖頭胸甲進(jìn)行鏡檢，并記錄。

1.2.2?細(xì)菌分離?在無菌條件下[4]，將患病幼蝦分為10組，分別進(jìn)行組織勻漿處理。用接種針接種于胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養(yǎng)基和硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂（TCBS）培養(yǎng)基上，劃線分離，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，挑取優(yōu)勢菌的單菌落，在TSA平板上純化培養(yǎng)3次。

1.2.3?細(xì)菌鑒定

1.2.3.1?分子生物學(xué)鑒定?對分離菌株進(jìn)行常規(guī)16s rDNA基因序列鑒定，將得到的產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對。選取同源性較高的序列，采用 Clustal X 1.83軟件進(jìn)行多重序列比對分析，并通過MEGA 6軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3.2?生化鑒定?采用法國生物梅里埃公司生產(chǎn)的微生物自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行生化特征分析。

1.2.4?人工感染試驗(yàn)?試驗(yàn)蝦為東港地區(qū)某養(yǎng)殖場健康幼蝦200尾，體長2～3 cm，暫養(yǎng)于200 L水族箱中，溫度控制在26 ℃，鹽度1.5‰，連續(xù)充氧。試驗(yàn)組與對照組各10 L水體分別放入50尾仔蝦，試驗(yàn)組水體中的細(xì)菌密度調(diào)至108cfu/mL，對照組不加入菌體。每日正常投喂，并觀察記錄發(fā)病癥狀及死亡情況。

1.2.5?藥敏試驗(yàn)?采用藥敏紙片法。

1.2.6?水質(zhì)理化指標(biāo)的測定?用水質(zhì)分析儀（YSI）檢測水體水溫、溶解氧、鹽度、pH。用7500儀器檢測氨氮、亞硝酸鹽、磷酸鹽、化學(xué)耗氧量。

2?結(jié)果與分析

2.1?病原形態(tài)特征

自南美白對蝦組織中分離獲得一株細(xì)菌，命名為DS180707，純化后在TSA平板上呈現(xiàn)為圓形光滑、黃色突起的菌落。革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察為革蘭氏陰性菌。

2.2?病原菌的生理、生化鑒定

由全自動(dòng)細(xì)菌分析儀對病原菌的生理生化檢測結(jié)果可知，該病原菌初步鑒定為溶藻弧菌（V.alginolyticus）。

2.3?菌株16s rDNA 基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將分離菌所擴(kuò)增的16s rDNA基因序列進(jìn)行Blast比對結(jié)果顯示，菌株 DS180707基因與溶藻弧菌相應(yīng)基因相似率達(dá)99%。將分離菌所擴(kuò)增的16s rDNA基因序列提交到Gen Bank，獲得序列號為MK217413，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株DS180707與溶藻弧菌聚為一支。

2.4?人工感染試驗(yàn)

人工感染48 h后，南美白對蝦開始出現(xiàn)死亡，72 h死亡率達(dá)50%。取感染后死亡幼蝦勻漿處理后進(jìn)行細(xì)菌分離，并進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、生化鑒定及分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果顯示分離菌株與原感染菌株為同一種致病菌。

2.5?藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，溶藻弧菌DS180707對氟苯尼考、氯霉素 、恩諾殺星、諾氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等抗生素敏感，對慶大霉素、多西環(huán)素、青霉素、制霉菌素耐藥（表1）。

2.6?水質(zhì)理化指標(biāo)測定結(jié)果

南美白對蝦養(yǎng)殖最適[5]溫度為 24～32 ℃，pH為7.5～8.5，溶解氧 5 mg/L以上。根據(jù)水質(zhì)理化指標(biāo)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[4]可知，該養(yǎng)殖水質(zhì)中氨氮和活性磷含量超標(biāo)（表2）。

3?討論

作者首次從丹東地區(qū)患病的南美白對蝦體內(nèi)分離出溶藻弧菌，并命名為DS180707。該菌對多種水生生物[6]均能造成危害。通過人工感染試驗(yàn)可知，該菌是致病菌，也是對蝦細(xì)菌病的主要病原之一，能引起對蝦攝食率下降，爛鰓黑鰓[7-9]，游動(dòng)緩慢等癥狀。該病多發(fā)在夏秋季節(jié)[10]，溫度在25～28 ℃易暴發(fā)流行。該養(yǎng)殖池塘發(fā)病時(shí)已進(jìn)入夏季，是全年氣溫、水溫較高時(shí)期，隨著溫度的上升水產(chǎn)病害明顯增加。且氨氮和活性磷含量過高，氨氮[11]作為養(yǎng)殖水體重要的脅迫因子，含量過高會(huì)造成對蝦免疫力及抗病力下降，增加對弧菌的感染性。活性磷[12]過高易造成水體富營養(yǎng)化，研究表明，蝦病暴發(fā)前養(yǎng)殖池中的無機(jī)磷含量通常超過閾值。

由藥敏試驗(yàn)結(jié)果可知，溶藻弧菌DS180707對氟苯尼考、氯霉素、恩諾殺星、諾氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星等6種抗生素敏感。在防治水產(chǎn)生物細(xì)菌性疾病時(shí)不要濫用[13]抗生素類藥物，避免細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，增加病害控制的難度。確定藥物的最低有效濃度及菌株的耐藥性是下一步工作的方向。

綜上所訴，造成南美白對蝦養(yǎng)殖池發(fā)病的主要病原是溶藻弧菌。針對氨氮和磷酸鹽過高的情況應(yīng)及時(shí)采取措施調(diào)節(jié)。經(jīng)常潑灑碘液和微生態(tài)制劑可以調(diào)節(jié)水質(zhì)，同時(shí)確保充足優(yōu)質(zhì)的餌料供應(yīng)，是提高對蝦抗病力的主要手段。

參考文獻(xiàn)：

[1] 沈文英，陽會(huì)軍，尹軍霞.南美白對蝦的病害及防治研究現(xiàn)狀[J].水利漁業(yè)，2004，24（1）：58-60.

[2] 張偉強(qiáng)，林東年.南美白對蝦（Penaeus vannamei Boone）人工繁育技術(shù)的研究[J].現(xiàn)代漁業(yè)信息，2004，19（9）：25-27.

[3] 鄔國民.南美白對蝦養(yǎng)殖技術(shù)（上）[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2000（8）：8-9.

[4] 鄭斌，鄒紹林，姚洪，等.池塘養(yǎng)殖海蜇疾病的病因分析[J].中國水產(chǎn)，2016（04）：82-87.

[5] 冉永明.南美白對蝦淡水養(yǎng)殖試驗(yàn)[J].農(nóng)技服務(wù)，2017（17）：76.

[6] 苗鵬飛，楊映，譚淑雯，等.羅氏沼蝦致病性溶藻弧菌的鑒定及藥敏分析[J].水產(chǎn)科學(xué)，2018，37（3）：384-388.

[7] 胡超群，陶保華.綜述：對蝦弧菌病及其免疫預(yù)防的研究進(jìn)展[J].熱帶海洋，2000，19（3）：84-94.

[8] 趙永軍，劉延鑫，徐文彥.南美白對蝦淡水養(yǎng)殖常見細(xì)菌性病害及防制技術(shù)[J].鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2006，26（1）：37-38.

[9] 張洪沂，趙勇，戴習(xí)林，等.南美白對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中弧菌為主的致病菌群的分子比較[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008，23（B06）：257-262.

[10] 姚剛，覃映雪，鄒文政，等.致病性溶藻弧菌生物膜形成特性研究[J].水產(chǎn)科學(xué)，2012，31（2）：73-78.

[11] 葛紅星.兩種主要無機(jī)氮脅迫下凡納濱對蝦免疫因子變化及其對副溶血弧菌易感性的研究[D].上海海洋大學(xué)，2014.

[12] 李玉全.工廠化養(yǎng)殖系統(tǒng)分析及主要養(yǎng)殖因子對對蝦生長，免疫及氮磷收支的影響[D].中國海洋大學(xué)，2006.

[13] 李正義，賈俊濤，陳曉，等.養(yǎng)殖大菱鲆出血病病原菌的分子生物學(xué)鑒定[J].水產(chǎn)科學(xué)，2010，29（1）：44-47.