馬尾藻多糖脂質(zhì)體納米制劑對(duì)南美白對(duì)蝦抗病力的影響

崔月明　胡庭俊　秦津等

摘要：研究馬尾藻多糖脂質(zhì)體對(duì)南美白對(duì)蝦免疫功能及抗病毒活性的影響。首先，選用72尾SPF南美白對(duì)蝦，分為脂質(zhì)體組和對(duì)照組，飼喂7 d后，測(cè)血淋巴上清中總蛋白含量，酚氧化酶、溶菌酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活性；然后，選用2批180尾SPF南美白對(duì)蝦分別觀察多糖脂質(zhì)體對(duì)感染白斑綜合征病毒或桃拉病毒對(duì)蝦的保護(hù)作用，將180尾對(duì)蝦隨機(jī)分為6組，設(shè)空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組，藥物陽性對(duì)照組和高、中、低3個(gè)脂質(zhì)體劑量組，飼喂7 d后攻毒，攻毒后觀察7 d，記錄發(fā)病數(shù)、死亡數(shù)。結(jié)果表明，在免疫試驗(yàn)中，脂質(zhì)體組酚氧化酶、溶菌酶和堿性磷酸酶的活性極顯著升高；在抗病毒保護(hù)試驗(yàn)中，多糖脂質(zhì)體各劑量均能提高南美白對(duì)蝦的存活率，高劑量組存活率最高。說明馬尾藻多糖脂質(zhì)體對(duì)南美白對(duì)蝦具有免疫促進(jìn)作用，并能提高其抗病力。

關(guān)鍵詞：馬尾藻多糖；脂質(zhì)體；南美白對(duì)蝦；免疫；病毒病

中圖分類號(hào)：S945.4+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2015）11-0323-03

收稿日期：2014-11-20

基金項(xiàng)目：廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：桂科攻0992014-6）。

作者簡(jiǎn)介：崔月明（1980—），女，河南南陽人，博士研究生，講師，研究方向多糖免疫藥理學(xué)。E-mail：870180417@qq.com。

通信作者：胡庭俊，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴幟庖咚幚韺W(xué)。E-mail：tingjunhu@126.com。對(duì)蝦白斑綜合征（WSS）和桃拉綜合征（TS）是危害我國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)最多的兩大病毒病，其大面積的暴發(fā)嚴(yán)重危害了對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。2001—2006年對(duì)南美白對(duì)蝦養(yǎng)殖的主產(chǎn)地10個(gè)省份的流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，在所有檢測(cè)到的病毒性疾病中白斑綜合征病毒（WSSV）占63.84%，桃拉綜合征病毒（TSV）占32.74%，成為危害最大的2種病毒病，并且其死亡率也呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)[1]。2009—2010年在福建、海南和廣東的流行病學(xué)調(diào)查中，對(duì)蝦WSSV的陽性結(jié)果占27.1%，它和傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）同時(shí)呈現(xiàn)陽性的占16.95%[2]。針對(duì)這種病毒性疾病的大面積暴發(fā)，目前還沒有有效的救治方法，因此對(duì)病毒病的有效防治已成為對(duì)蝦養(yǎng)殖中的最主要問題[3]。對(duì)蝦和其他無脊椎動(dòng)物一樣， 缺乏脊椎動(dòng)物特異的抗原/抗體免疫反應(yīng)機(jī)制， 雖然一些病毒的重組蛋白能夠誘導(dǎo)特異的免疫反應(yīng)，但這種保護(hù)作用只是暫時(shí)的[4]，因此完全寄希望于通過疫苗免疫來控制蝦病是不切實(shí)際的。目前對(duì)病毒病的防治還是以防為主，報(bào)道稱中草藥類多糖、生物堿、有機(jī)酸、酮類等以及益生菌能激活對(duì)蝦的免疫系統(tǒng)， 增強(qiáng)抗病力，從而達(dá)到防病治病的目的[5]。楊明用烏梅為主要材料的中藥抗病毒復(fù)方飼喂南美白對(duì)蝦，其中2%劑量的試驗(yàn)組促進(jìn)對(duì)蝦的生長(zhǎng)最明顯，酚氧化酶（PO）和過氧化物酶活性亦大大提高，表明中藥復(fù)方能提高對(duì)蝦的非特異性免疫力；在WSSV感染試驗(yàn)中，免疫保護(hù)率更是達(dá)到61.98%，效果極顯著[6]。

馬尾藻多糖（SP）作為海藻中一類具有較高抗病毒活性的硫酸多糖，添加在飼料中，不僅能促進(jìn)南美白對(duì)蝦的生長(zhǎng)，而且對(duì)甲殼動(dòng)物的酚氧化酶系統(tǒng)具有激活作用，能提高南美白對(duì)蝦酸性磷酸酶（ACP）、 超氧化物歧化酶（SOD）及溶菌酶（LSZ）活性，并且在感染W(wǎng)SSV后，使免疫保護(hù)率從28%提高到74%[7]。脂質(zhì)體是將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層而制成的一種超微型球狀藥物載體制劑，結(jié)構(gòu)類似生物膜，和靶細(xì)胞之間可通過內(nèi)吞、融合、接觸釋放、吸附、脂質(zhì)交換等方式起作用，具有減少藥物治療劑量、降低藥物毒性、減輕變態(tài)反應(yīng)和免疫反應(yīng)、延緩釋放、靶向給藥等優(yōu)點(diǎn)[8]。多糖脂質(zhì)體作為免疫增強(qiáng)劑在提高對(duì)蝦的非特異性免疫，增強(qiáng)對(duì)病毒性疾病的抵抗力方面，目前國(guó)內(nèi)外都未見報(bào)道。馬尾藻多糖脂質(zhì)體納米制劑（SPL）是將溶解的馬尾藻多糖包封于磷脂雙層膜中，形成穩(wěn)定的球形納米乳劑。本試驗(yàn)通過在南美白對(duì)蝦飼料中添加SPL，測(cè)定對(duì)蝦血淋巴液上清中總蛋白（TP）含量，酚氧化酶、溶菌酶、堿性磷酸酶（ALP）和酸性磷酸酶的活性，探討SPL對(duì)南美白對(duì)蝦非特異性免疫功能的調(diào)節(jié)作用；而后人工感染W(wǎng)SSV和TSV，觀察SPL對(duì)南美白對(duì)蝦抗病力的影響，評(píng)價(jià)SPL作為免疫增強(qiáng)劑在對(duì)蝦養(yǎng)殖中的作用，為SPL的進(jìn)一步推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1藥物0.5%馬尾藻多糖脂質(zhì)體納米制劑，由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院制備。對(duì)照藥：鹽酸左旋咪唑+黃芪多糖可溶性粉，湖南湘大獸藥有限公司生產(chǎn)，商品名為瘟毒清，生產(chǎn)批號(hào)為20110680。

1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物SPF南美白對(duì)蝦的幼蝦500尾，取自廣西水產(chǎn)研究所南美白對(duì)蝦企沙養(yǎng)殖基地，暫養(yǎng)7 d后量體長(zhǎng)、稱質(zhì)量，體長(zhǎng)為（4.5±0.55） cm，體質(zhì)量為（0.69±0.31） g，挑選規(guī)格基本一致的用于試驗(yàn)。

1.1.3飼料對(duì)蝦飼料為豆粕、魚粉、面粉、蝦粉、魚油、麥麩、多維多礦、大豆磷酯組成的對(duì)蝦基礎(chǔ)飼料，試驗(yàn)組按不同劑量將SPL噴涂于飼料上。

1.1.4病毒對(duì)蝦白斑病綜合征病毒、桃拉綜合征病毒均由廣西壯族自治區(qū)水產(chǎn)研究所保存，二者的TCID50均為10-6。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)分組及處理將72尾SPF南美白對(duì)蝦分為2組——對(duì)照組和SPL組。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼料，SPL組飼料添加SPL 50 mL/kg，連續(xù)飼喂7 d。2組分別飼養(yǎng)于150 cm×80 cm×60 cm的水族箱內(nèi)，上午、下午各投料1次（按對(duì)蝦體質(zhì)量的5%投料），常溫下喂養(yǎng)。

1.2.2血淋巴液制備用藥后8 d，用帶5號(hào)針頭的1 mL注射器自蝦的頭胸甲后插入心臟取血淋巴液0.3 mL，置于 Eppendorf 管中，4 ℃冷藏，3 000 r/min 離心10 min，取上清用于免疫指標(biāo)測(cè)定。

1.2.3免疫指標(biāo)測(cè)定用南京建成生物工程研究所的試劑盒測(cè)定對(duì)蝦血淋巴液上清中總蛋白含量，以及溶菌酶、堿性磷酸酶和酸性磷酸酶活力；酚氧化酶活性用改進(jìn)的Ashida方法[9]，以L-dopa為底物，反應(yīng)時(shí)間6 min，測(cè)定490 nm下的吸光度。

1.2.4攻毒保護(hù)試驗(yàn)將360尾SPF南美白對(duì)蝦分成2大組，分別做SPL對(duì)WSSV和TSV的攻毒保護(hù)試驗(yàn)。將每大組的180尾SPF南美白對(duì)蝦隨機(jī)分為6組， 每組30尾，分別是空白對(duì)照組、病毒陽性對(duì)照組、藥物對(duì)照組以及多糖脂質(zhì)體納米制劑的高（200 mL/kg）、中（100 mL/kg）、低（50 mL/kg）劑量組，分別飼養(yǎng)于150 cm×80 cm×60 cm的水族箱內(nèi)。上午、下午各投料1次（按對(duì)蝦體質(zhì)量的5%投料），在常溫下喂養(yǎng)7 d，飼喂8 d時(shí)按100倍TCID50的病毒量進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。攻毒后觀察7 d，記錄發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)，計(jì)算相對(duì)保護(hù)率：相對(duì)保護(hù)率=（1-試驗(yàn)組死亡率/病毒對(duì)照組死亡率）×100%。

1.2.5數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 16.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性檢驗(yàn)，免疫指標(biāo)用獨(dú)立性t檢驗(yàn)，抗病毒保護(hù)試驗(yàn)用χ2檢驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1SPL對(duì)南美白對(duì)蝦相關(guān)免疫指標(biāo)的影響

SPL對(duì)SPF南美白對(duì)蝦免疫指標(biāo)的影響結(jié)果見表1。添加SPL的試驗(yàn)組總蛋白含量與對(duì)照組差異不顯著，而其余的相關(guān)免疫酶活性均有較大的改變，其中酸性磷酸酶活性極顯著降低（P<0.01），酚氧化酶、溶菌酶和堿性磷酸酶活性極顯著升高（P<0.01）。

2.2SPL對(duì)人工感染W(wǎng)SSV的南美白對(duì)蝦的抗感染保護(hù)作用

在對(duì)蝦飼料中添加SPL后，高、中、低劑量組與病毒對(duì)照組相比都降低了發(fā)病率和死亡率。其中藥物對(duì)照組和SPL中劑量組的死亡數(shù)顯著減少（P<0.05），SPL高劑量組死亡數(shù)極顯著減少（P<0.01），相對(duì)保護(hù)率最高，達(dá)到16.67%（表2）。

2.3SPL對(duì)人工感染TSV的南美白對(duì)蝦的抗感染保護(hù)作用

由表3可見，在飼料中添加中、高劑量的SPL能顯著提高南美白對(duì)蝦對(duì)TSV的抵抗力，使發(fā)病數(shù)顯著降低（P<0.05）。SPL組的相對(duì)保護(hù)率均高于藥物對(duì)照組，其中高劑量組最高，達(dá)到26.93%。

3討論

對(duì)蝦屬于甲殼動(dòng)物，其免疫防御系統(tǒng)由基本防御屏障（甲殼和表皮）、細(xì)胞防御屏障（血淋巴細(xì)胞免疫）和生理防御屏障（體液免疫）3個(gè)部分組成。對(duì)蝦的體液免疫包含水解和氧化等酶類、凝集素、抗菌肽、溶菌酶等體液免疫因子，它們?cè)诩讱?dòng)物的體液免疫過程中發(fā)揮著很大的作用，使得甲殼動(dòng)物能識(shí)別非己物質(zhì)，抵抗病原體的侵襲。

對(duì)蝦的酚氧化酶系統(tǒng)（proPO）作為一種非特異性識(shí)別體系是先天性體液免疫的重要組成之一，無論從組成、激活方式還是免疫功能上，都非常類似于高等動(dòng)物的補(bǔ)體系統(tǒng)，主要是通過酚氧化酶原激活系統(tǒng)、抗菌肽和凝集素等的作用達(dá)到抗病抑菌及消除異物的目的。本研究發(fā)現(xiàn)，在對(duì)蝦飼料中添加50 mL/kg 劑量的SPL可以極顯著增強(qiáng)南美白對(duì)蝦血淋巴上清中的PO活性，與對(duì)照組相比PO活性提高2倍以上，說明SPL能夠有效刺激大顆粒細(xì)胞脫顆粒，從而釋放出酚氧化酶原激活系統(tǒng)的各種組分，參與免疫識(shí)別及免疫防御反應(yīng)。

溶菌酶是對(duì)蝦血細(xì)胞吞噬異物后分泌的一些堿性蛋白質(zhì)，主要水解細(xì)菌細(xì)胞壁的糖苷鍵，引起細(xì)菌細(xì)胞裂解死亡，破壞和消除侵入體中的異物。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼喂含SPL的飼料7 d后，LSZ的活力極顯著升高。與劉小玲等研究的樺褐孔菌多糖以及覃振林等研究的馬齒莧對(duì)對(duì)蝦非特異性免疫的效果[10-11]一致。

磷酸酶可以催化磷酸單脂的水解反應(yīng)和磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而將表面帶有磷酸單酯的異物破壞降解。依據(jù)它們起催化作用的最適pH值不同，分為堿性磷酸酶和酸性磷酸酶。在本試驗(yàn)中，同時(shí)測(cè)定了對(duì)蝦血淋巴上清液中ALP與ACP的活性，與對(duì)照組相比均有極顯著差異，說明SPL影響了磷酸酶的分泌和活性。其中ALP是極顯著升高，與大多數(shù)相關(guān)的研究結(jié)果[10，12]一致，而ACP的含量卻是極顯著降低，這可能與飼喂時(shí)間以及對(duì)蝦的生長(zhǎng)期有關(guān)。李桂英等在對(duì)蝦飼料中添加腸道益生菌后發(fā)現(xiàn)，根據(jù)飼喂的時(shí)間不同，ACP的活性在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)有較大的差異，在第10天達(dá)到最高，之后就下降了[13]；王新霞用β-葡聚糖飼喂幼蝦，在第9天的時(shí)候活性明顯升高，而在第14天測(cè)定時(shí)活性就下降了，甚至低于對(duì)照組[14]。除了時(shí)間因素外，還可能與脂質(zhì)體的主要組成是磷脂和膽固醇有關(guān)，因?yàn)榱字杀涣姿崦杆?，二者之間可以發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。所以，本研究測(cè)定的ACP含量降低的原因還需要進(jìn)一步探討。

病毒感染對(duì)蝦之后，會(huì)引起對(duì)蝦的免疫防御反應(yīng)[15-16]。WSSV可感染對(duì)蝦顆粒細(xì)胞，使超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶的活性顯著降低[17]；WSSV也能使對(duì)蝦的酚氧化酶體系明顯上調(diào)，對(duì)蝦痊愈后其酚氧化酶活性降到正常值[18]，暗示病毒也會(huì)激活酚氧化酶體系，進(jìn)而啟動(dòng)對(duì)蝦的免疫反應(yīng)。在TSV感染2～3 d后，對(duì)蝦總淋巴細(xì)胞數(shù)、透明細(xì)胞數(shù)、半顆粒細(xì)胞數(shù)及顆粒細(xì)胞數(shù)都有大幅度下降，SOD、PO活性分別下降了約 25%、68%，這表明TSV可能通過降低對(duì)蝦血液學(xué)免疫力而實(shí)現(xiàn)其高致病性[19]。Chang等研究發(fā)現(xiàn)，多糖類物質(zhì)（如β-葡聚糖、脂多糖、肽聚糖等）能有效激活對(duì)蝦的酚氧化酶系統(tǒng)，進(jìn)而提高對(duì)蝦自身的免疫水平，抑制體內(nèi)病毒擴(kuò)增，阻止未帶毒個(gè)體染病，從而預(yù)防控制WSSV感染[20]。本研究利用具有抗病毒活性的馬尾藻硫酸多糖制成的脂質(zhì)體納米制劑作為免疫增強(qiáng)劑，觀察對(duì)WSSV和TSV感染后對(duì)蝦的保護(hù)作用發(fā)現(xiàn)，SPL高劑量組可以極顯著減少病死蝦的數(shù)量，對(duì)WSSV感染后保護(hù)率達(dá)1667%，對(duì)TSV感染后保護(hù)率達(dá)26.93%。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，飼料添加SPL 50 mL/kg，能顯著提高南美白對(duì)蝦的酚氧化酶、溶菌酶、堿性磷酸酶活性，對(duì)對(duì)蝦的非特異性免疫具有免疫促進(jìn)作用。在人工感染W(wǎng)SSV和TSV后，高、中、低劑量的SPL對(duì)南美白對(duì)蝦均有一定的保護(hù)作用，效果優(yōu)于對(duì)照藥物瘟毒清，其中高劑量組保護(hù)效果最好。說明脂質(zhì)體作為一種新型的藥物制劑，可以增強(qiáng)甲殼類動(dòng)物的免疫活性，提高其抗病毒能力，有作為綠色免疫增強(qiáng)劑開發(fā)的潛力。

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