間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓造血微環(huán)境對(duì)造血的調(diào)控作用及其研究進(jìn)展

周倍伊

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧 530200）

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）是骨髓內(nèi)多潛能基質(zhì)細(xì)胞，可以分化為成骨、軟骨、脂肪、成肌和神經(jīng)膠質(zhì)等多種成體細(xì)胞。造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）是血液系統(tǒng)中的成體干細(xì)胞，具有長(zhǎng)期自我更新的能力以及分化成各類成熟血細(xì)胞的能力。1978年Schofield［1］首次提出骨髓造血微環(huán)境“Niche”的概念，他發(fā)現(xiàn)Niche參與HSC的維持、自我更新和多向分化的調(diào)控。之后，人們從骨髓鑒定到多個(gè)HSC體外擴(kuò)增所必需的生長(zhǎng)因子，如干細(xì)胞因子（SCF）、促血小板生成素（TPO）等［2-3］，進(jìn)一步印證了骨髓造血微環(huán)境的存在。國(guó)內(nèi)外臨床及實(shí)驗(yàn)研究證明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是骨髓造血微環(huán)境重要的構(gòu)成細(xì)胞之一，臨床研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）與HSC共移植能加快恢復(fù)造血微環(huán)境的造血重建［4-5］，體外MSCs與HSC共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示，兩種細(xì)胞共培養(yǎng)能促進(jìn)HSC增殖［6］，證明MSCs在骨髓造血微環(huán)境中對(duì)造血調(diào)控的重要作用。本文就間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓造血微環(huán)境中對(duì)造血的影響綜述如下。

1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及生物學(xué)特征

1.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、純化及培養(yǎng) 目前常用分離、純化及培養(yǎng)MSCs的方法主要有免疫磁珠法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分離法和全骨髓貼壁培養(yǎng)法［7-8］。免疫磁珠及流式細(xì)胞儀兩種方法雖然可以分離獲得高純度的MSCs，但篩選出來的MSCs出現(xiàn)了活性低、增殖慢、貼壁性差等現(xiàn)象［9-10］。密度梯度離心法則是根據(jù)MSCs與骨髓中其他細(xì)胞密度不同進(jìn)行梯度分離［11］。但是經(jīng)密度梯度法獲得的MSCs數(shù)量少，原代培養(yǎng)首次細(xì)胞融合時(shí)間長(zhǎng)。相比前述3種方法，全骨髓貼壁培養(yǎng)是利用MSCs能在培養(yǎng)皿中貼壁生長(zhǎng)的特性，經(jīng)過多次換液除去不貼壁細(xì)胞而達(dá)到細(xì)胞純化的目的，從而進(jìn)行傳代培養(yǎng)。全骨髓貼壁培養(yǎng)法簡(jiǎn)便有效，其分離的細(xì)胞活性高，增殖快，是實(shí)驗(yàn)室目前應(yīng)用最多的MSCs培養(yǎng)方法［12］。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)及生物性特征 接種于培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞呈圓型，24 h后部分細(xì)胞開始貼壁，呈圓形、梭形或多角形。24 h換液后可見短梭形、星形細(xì)胞分散貼壁生長(zhǎng)，3～4 d可見放射狀排列的細(xì)胞集落，以梭形細(xì)胞為主，核仁清晰。6～7 d細(xì)胞呈集落生長(zhǎng)，融合率達(dá)80%～90%，呈漩渦狀時(shí)可傳代培養(yǎng)。第3代大鼠MSCs流式細(xì)胞儀表面標(biāo)志物檢測(cè)顯示，BMSCs均表達(dá)CD105、CD90、CD44，而CD34、CD45呈陰性［13-14］。

2 骨髓造血微環(huán)境的構(gòu)成細(xì)胞

目前骨髓造血微環(huán)境的構(gòu)成細(xì)胞研究最多的有三種：成骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

2.1 成骨細(xì)胞 成骨細(xì)胞是骨內(nèi)膜造血微環(huán)境的關(guān)鍵組成部分之一，HSC圍繞著成骨細(xì)胞排列在骨內(nèi)膜附近，骨內(nèi)膜造血微環(huán)境為成骨細(xì)胞和HSC之間的相互作用提供了場(chǎng)所。骨內(nèi)膜造血微環(huán)境中的成骨細(xì)胞來源于多潛能的MSCs，在HSC的增殖分化和靜止中MSCs起重要作用［15］。 Calvi等［16］和 Zhang等［17］的研究分別證明骨髓內(nèi)的成骨細(xì)胞亞群是HSC造血微環(huán)境的關(guān)鍵細(xì)胞組分，提高成骨細(xì)胞的數(shù)量能夠促進(jìn)HSC的自我更新和造血活動(dòng)。

2.2 內(nèi)皮細(xì)胞 內(nèi)皮細(xì)胞在保持HSC干性及增殖上起著重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞通過分泌細(xì)胞因子使體內(nèi)未成熟的造血細(xì)胞增加，在骨髓外維持著HSC功能［18］。Winkler等［19］發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞特異性細(xì)胞黏附分子E-選擇素能夠促進(jìn)HSC的體內(nèi)增殖，證實(shí)內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)HSC具有促增殖作用。Heissig等［20］發(fā)現(xiàn)敲除內(nèi)皮細(xì)胞上的Kit配體基因會(huì)導(dǎo)致HSC的減少，也證明了內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)HSC維持的重要意義。

2.3 間充質(zhì)干細(xì)胞 MSCs可以分化為成骨細(xì)胞，MSCs在骨髓造血微環(huán)境起著重要作用已經(jīng)得到證實(shí)。Méndez-Ferrer等［21］研究發(fā)現(xiàn)骨髓造血微環(huán)境是由MSCs與HSC共同組成的一個(gè)獨(dú)特的造血龕（Niche），Niche調(diào)控骨髓造血微環(huán)境的造血功能。在臨床上，將MSCs與HSC共移植可促進(jìn)移植后白血病患者的造血重建，機(jī)體造血功能恢復(fù)加快［22-23］。所以，無論是臨床觀察還是實(shí)驗(yàn)研究都證明MSCs是骨髓造血微環(huán)境重要的構(gòu)成細(xì)胞。

3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)骨髓造血微環(huán)境的造血調(diào)控

3.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)骨髓造血微環(huán)境中造血干細(xì)胞的影響 MSCs與HSC共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MSCs與HSC接觸共培養(yǎng)，HSC的增殖能力比HSC單獨(dú)培養(yǎng)、MSCs與HSC非接觸共培養(yǎng)增殖能力更強(qiáng)［6］。Méndez-Ferrer［21］等也發(fā)現(xiàn)骨髓造血微環(huán)境內(nèi)MSCs數(shù)量的增加則促進(jìn)HSC數(shù)量的增加。徐志娟等［24］用來源于臍血的造血干細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)14 d，發(fā)現(xiàn)與間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)的造血干細(xì)胞增殖率明顯高于單獨(dú)培養(yǎng)的造血干細(xì)胞（P＜0.05）。杜幸軍等［25］利用人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合人外周血造血干細(xì)胞共移植，植入嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠體內(nèi)，觀察對(duì)小鼠早期造血的影響，發(fā)現(xiàn)人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)人外周血造血干細(xì)胞的植入，縮短造血干細(xì)胞移植后造血恢復(fù)時(shí)間。王金福等［26］的臨床研究顯示，MSCs與HSC共移植增加了HSC的量，他們推測(cè)其原因可能與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞所創(chuàng)造的復(fù)雜造血微環(huán)境有關(guān)。

3.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子對(duì)骨髓造血微環(huán)境造血干細(xì)胞的作用 MSCs與HSC直接接觸可分泌黏附因子，加快HSC歸巢。MSCs分泌黏附因子如血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）、細(xì)胞間黏附因子-1（ICAM-1）以及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1），介導(dǎo)HSC歸巢，促使HSC穿過血管進(jìn)入骨髓［27］。Bernardo 等［28］發(fā)現(xiàn) MSCs還能產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)分子，如膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等，介導(dǎo)HSC與骨髓基質(zhì)的黏附，使歸巢的HSC穩(wěn)定黏附于骨髓造血微環(huán)境。體外培養(yǎng)MSCs能分泌大量細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素-3（IL-3）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-8（IL-8）、巨噬細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）、促血小板生成素（TPO）等，可以解決機(jī)體細(xì)胞因子相對(duì)不足的問題［29］。靜脈輸注HSC后，HSC沿干細(xì)胞因子（SCF）濃度梯度遷移到骨髓，并與表達(dá)SCF的骨髓基質(zhì)細(xì)胞黏附結(jié)合，以此加速HSC的歸巢，開啟HSC細(xì)胞周期進(jìn)程。Walenda 等［30］發(fā)現(xiàn)MSCs與 SCF、TPO、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因-1（FGF-1）聯(lián)合應(yīng)用能顯著增強(qiáng)MSCs造血支持作用。

3.3 調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的信號(hào)通路對(duì)骨髓造血微環(huán)境造血的影響 Notch基因編碼是一類高度保守的細(xì)胞表面受體，它們調(diào)節(jié)多種生物細(xì)胞的發(fā)育，Notch信號(hào)在正常發(fā)育過程中發(fā)揮重要的角色，能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞增殖水平，通過抑制JunB蛋白調(diào)節(jié)抑制BMP9誘導(dǎo)的MSCs成骨分化［31］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，造血微環(huán)境信號(hào)通路對(duì)化療后的造血重建具有積極的調(diào)控作用，其機(jī)制可能是Notch信號(hào)通路激活骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的PI3K增殖信號(hào)通路，從而加速細(xì)胞周期的進(jìn)程［32］；趨化因子受體CXCR4與其主要配體CXCL12的CXCL12／CXCR4信號(hào)通路對(duì)骨髓造血微環(huán)境中造血干祖細(xì)胞的保留和遷移起著至關(guān)重要的作用。異位的CXCR4可促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞CXCL12配體依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在進(jìn)行臍血來源的造血干細(xì)胞移植后增加造血祖細(xì)胞存活和增殖能力［33］；由配體蛋白質(zhì)Wnt和膜蛋白受體結(jié)合的Wnt信號(hào)通路（Wnt／β-catenin）是經(jīng)典的信號(hào)通路，其調(diào)控許多重要的細(xì)胞功能，如干細(xì)胞增殖和維持。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以分化為成骨細(xì)胞，Wnt信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的骨合成代謝作用，提高成骨細(xì)胞的Jagged 1的表達(dá)，可促進(jìn)HSC的自我更新和增殖［34-35］；Tie2／Ang-1信號(hào)通路是HSC和骨髓造血微環(huán)境內(nèi)細(xì)胞之間作用的關(guān)鍵信號(hào)通路。HSC在骨表面的定位受成骨細(xì)胞特異性黏附分子如N-鈣黏蛋白的調(diào)節(jié)，一旦HSC與成骨細(xì)胞相鄰定位，成骨細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生Ang-1并激活HSC上的Tie2，促進(jìn)HSC在骨髓中的緊密黏附，從而使HSC處于靜止?fàn)顟B(tài)，可自主保護(hù)骨髓造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞免受損傷，還可增強(qiáng)造血重建［36-37］。有研究顯示骨髓造血微環(huán)境的信號(hào)調(diào)控存在整合，如Wnt信號(hào)通路與Notch信號(hào)通路協(xié)同調(diào)控HSC的功能［38］，周倍伊等［39-40］研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方扶芳藤合劑可以促進(jìn)大鼠MSCs增殖，增加小鼠外周血HSC，其機(jī)制可能是通過激活Notch、Wnt兩條信號(hào)通路產(chǎn)生協(xié)同調(diào)控的結(jié)果。

4 討論和展望

造血干細(xì)胞在體內(nèi)的增殖分化、干性維持等生理活動(dòng)受其周圍環(huán)境的影響，骨髓造血微環(huán)境是HSC賴以生存的微環(huán)境。作為研究最多的構(gòu)成細(xì)胞MSCs對(duì)骨髓造血微環(huán)境造血產(chǎn)生的重要影響已經(jīng)得到證實(shí)，MSCs與HSC在骨髓造血微環(huán)境中通過細(xì)胞接觸產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，以及在造血微環(huán)境內(nèi)調(diào)節(jié)MSCs的多個(gè)信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)HSC的功能，維持其生物特性的相對(duì)穩(wěn)定。隨著對(duì)造血微環(huán)境研究的深入，我們對(duì)于造血微環(huán)境中的構(gòu)成細(xì)胞及信號(hào)作用機(jī)制也有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，但這些信號(hào)通路之間是如何整合調(diào)控HSC的機(jī)制尚不清楚，在今后的研究中，應(yīng)進(jìn)一步闡明機(jī)制，有助于在體外培養(yǎng)、擴(kuò)增HSC，從而將HSC廣泛用于再生醫(yī)學(xué)。