茶樹組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

劉 靜

（安康學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院，陜西 安康 725000）

茶樹[Camellia sinensis（L.）O.Kuntze]屬于山茶科山茶屬植物，在我國栽培歷史悠久，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物[1]。茶葉中含有大量對(duì)人體有益的化學(xué)成分及營養(yǎng)物質(zhì)，具有很高的醫(yī)療保健價(jià)值[2]。長期以來，茶樹主要靠種子繁殖，但種子繁殖容易發(fā)生性狀分離，導(dǎo)致優(yōu)良性狀丟失，從而引起品種退化。近年來生產(chǎn)上推廣無性系茶園，利用茶樹的枝條進(jìn)行扦插繁殖[3]，但該方法存在著育苗周期長、繁殖系數(shù)低、對(duì)自然環(huán)境要求較高的缺陷，限制了茶樹新品種的繁育和推廣[4]。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)是指將植物的離體器官接種于含有特定營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基上，使植物離體器官向著人們預(yù)先設(shè)計(jì)的方向生長和發(fā)育，以取得在常規(guī)繁殖方式下難以取得成效的一種生物技術(shù)[5]。茶樹組織培養(yǎng)主要利用葉片、莖段、腋芽以及根等外植體進(jìn)行誘導(dǎo)來獲得完整的植株。這種無性繁殖的方式有利于保持茶樹優(yōu)良性狀及集約化生產(chǎn)[6]。

1 茶樹組培研究進(jìn)展

1.1 外植體選取

目前，茶樹已實(shí)現(xiàn)了利用莖尖、葉片、子葉、腋芽、花藥等為外植體來誘導(dǎo)芽、愈傷組織、胚狀體等，進(jìn)而培育出新的器官或植株。

1.1.1 莖段、腋芽

Nakamura Y[7]對(duì)茶樹腋芽進(jìn)行組織培養(yǎng)，腋芽萌發(fā)生長較好，獲得再生植株，但成梢率低，生長緩慢。黃亞輝[8]利用茶樹莖尖獲得了愈傷組織。Akula A等[9]通過茶樹莖段培養(yǎng)，誘導(dǎo)出體胚，并建立了茶樹的再生體系，誘導(dǎo)率可達(dá)60%。張建華等[10]以新梢腋芽、莖段為材料，誘導(dǎo)出愈傷組織并分化出芽。袁地順等[11]消毒茶樹幼嫩芽葉后，將其切成塊接種于固體培養(yǎng)基3周后，在切口處產(chǎn)生了少量的愈傷組織。Kato M[12]用莖段為材料，誘導(dǎo)出了愈傷組織和完整植株。

1.1.2 葉片、葉柄

Kato M[12]在不同濃度的2,4-D條件下，對(duì)茶樹試管苗未成熟的葉片進(jìn)行培養(yǎng)。從葉片直接誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚胎或在葉子基部誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織，胚胎誘導(dǎo)與葉片外植體的成熟度有關(guān)，幼嫩的葉片更好。葉片外植體的胚胎發(fā)生的反應(yīng)也與培養(yǎng)時(shí)期液體培養(yǎng)基中的2,4-D的濃度有關(guān)，胚胎發(fā)生的愈傷組織或重復(fù)的體細(xì)胞胚胎保持其再生能力超過3年。組織學(xué)觀察表明，葉中脈不同部位形成體細(xì)胞胚。體細(xì)胞胚在含有BA和IBA的瓊脂培養(yǎng)基上發(fā)芽發(fā)育成植株。劉德華等[13-14]以葉為外植體，誘導(dǎo)出了愈傷組織并且分化出植株，初步建立了植株再生體系。王毅軍等[15]利用茶樹葉片誘導(dǎo)出愈傷組織和胚狀體，并進(jìn)一步形成了小植株。嚴(yán)學(xué)成等[16]通過器官發(fā)生途徑培養(yǎng)茶樹葉片，獲得了正常的小植株，且克服了組織培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象。暨淑儀等[17]利用葉片誘導(dǎo)產(chǎn)生出愈傷組織。杜鴻標(biāo)等[18]研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)茶樹葉片產(chǎn)生愈傷組織宜選用第二葉作為外植體，污染率及褐變率相對(duì)較低，可獲得最高誘導(dǎo)效率31.4%。

1.1.3 子葉

莫典義[19]以子葉為外植體，誘導(dǎo)出胚狀體并再生出植株。顏幕勤等[20]用茶樹子葉誘導(dǎo)形成胚狀體。幾周后胚狀體即可長成小植株，待胚根長到一定長度時(shí)進(jìn)行移栽。陳平等[21]利用子葉誘導(dǎo)出愈傷組織并分化出叢生苗，移栽成活。Arulpragasam P V等[22]從子葉培養(yǎng)中獲得胚狀體，并再生出植株。劉德華等[23]培養(yǎng)茶籽子葉柄和下胚軸，子葉柄不經(jīng)愈傷組織可直接分化出芽，是保持種性的一種較好材料。下胚軸分化芽能力較強(qiáng)，繁殖系數(shù)大，對(duì)雜交育種有重要意義。Ponsamuel J等[24]培養(yǎng)子葉胚獲得完整植株。

1.1.4 花藥

日本學(xué)者勝尾清等[25]最早開始茶樹花藥的研究，并獲得愈傷組織和根。陳振光等[26-27]用“福云7號(hào)”茶樹花藥，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，獲得完整的植株。郭玉瓊等[28]研究花藥時(shí)，發(fā)現(xiàn)蔗糖濃度和基本培養(yǎng)基條件相同時(shí)，2,4-D濃度增加有助于提高花藥愈傷組織的誘導(dǎo)率。其他條件不變時(shí)，隨著蔗糖濃度的升高花藥愈傷組織誘導(dǎo)率下降，適于茶樹花藥愈傷組織誘導(dǎo)的蔗糖濃度為5%～7%。楊娟[29]發(fā)現(xiàn)，植物花期、植物激素濃度、品種差異等都會(huì)影響茶樹花藥愈傷組織誘導(dǎo)。誘導(dǎo)愈傷組織的茶樹花藥選用以即將開放花苞為宜，愈傷組織出愈率相對(duì)較高，在培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT中，出愈率高達(dá)34.4%，在相同條件下，花藥愈傷組織誘導(dǎo)能力會(huì)隨茶樹品種不同而有差異。在茶樹不同品種花藥愈傷組織誘導(dǎo)研究報(bào)道中，僅“福云7號(hào)”的花藥誘導(dǎo)形成植株，而分化得到的單倍體及純合二倍體誘導(dǎo)研究未有繼續(xù)報(bào)道。

1.2 基本培養(yǎng)基選擇

培養(yǎng)基是根據(jù)植物的生長要求，人工配制的含有多種營養(yǎng)成分的營養(yǎng)液，主要包含大量元素、微量元素、有機(jī)成分、植物生長調(diào)節(jié)劑、瓊脂和蔗糖等。植物組織培養(yǎng)能否成功，不僅與培養(yǎng)材料有關(guān)，還與培養(yǎng)基的類型有很大的關(guān)系。茶樹組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基主要有：MS、1/2MS、改良MS、ER、MT，其中以MS培養(yǎng)基應(yīng)用較為廣泛[30]。日本學(xué)者Nakamura Y[31]研究發(fā)現(xiàn)，Nitsch、Gamborg和MS培養(yǎng)基對(duì)頂芽的誘導(dǎo)生長比較好。Kuboi T等[32]認(rèn)為B5液體培養(yǎng)基比固體培養(yǎng)基更有利于茶樹愈傷組織的生長。Mondal T K等[33]比較了不同濃度的BAP和TDZ對(duì)芽或新梢誘導(dǎo)和增殖的效果，發(fā)現(xiàn)在以MS為基本培養(yǎng)基的組合上外植體的生長比以WPM為基本培養(yǎng)基的組合上生長的要好。張建華[10]研究發(fā)現(xiàn)，茶樹組織培養(yǎng)，尤其是增殖培養(yǎng)中，ER培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基更適合。張婭婷等[34]培養(yǎng)藪北茶樹芽苗時(shí)發(fā)現(xiàn)，在附加等量植物生長調(diào)節(jié)劑的MS、N6和White培養(yǎng)基上，MS培養(yǎng)基在芽苗的數(shù)量和芽苗的高度方面均優(yōu)于其他兩種基本培養(yǎng)基。楊國偉等[35]報(bào)道，就茶樹愈傷組織的生長而言，MS培養(yǎng)基比Heller、White培養(yǎng)基更優(yōu)，愈傷組織在MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率可達(dá)到90%，并認(rèn)為MS培養(yǎng)基中的大量元素對(duì)茶樹組織培養(yǎng)有很大影響。成浩等[36]研究發(fā)現(xiàn)，1/2MS培養(yǎng)基有利于山茶科植物莖段的誘導(dǎo)和生長，還能夠有效減少莖段的褐化率。張婭婷等[34]發(fā)現(xiàn)，1/2MS培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基效果好，并認(rèn)為MS培養(yǎng)基中含有的較高濃度無機(jī)離子對(duì)芽苗的分化起到了一定的抑制作用。但在組織培養(yǎng)應(yīng)用中，全量的大量元素一般被用于誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)，而半量的大量元素在生根培養(yǎng)時(shí)采用。

1.3 生長調(diào)節(jié)劑選擇

在外植體愈傷組織的誘導(dǎo)和器官分化過程中，植物生長調(diào)節(jié)劑起著明顯的調(diào)節(jié)作用，外源激素種類與配比對(duì)外植體能否成功啟動(dòng)起著至關(guān)重要的作用。王立等[37]以未成熟胚為外植體，在改良的ER+2.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)率為100%，誘導(dǎo)出了合子胚、不定胚及不定芽并形成完整植株。孫仲序等[38]在培養(yǎng)基MS+1.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ZT中得到最佳芽分化率，在培養(yǎng)基為1/2MS+0.2 mg/L IBA+20 g/L蔗糖中得到最佳生根率。周健等[39]研究了激素對(duì)茶樹芽增殖和生長的影響，認(rèn)為組培苗增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+3.0 mg/L GA3。楊國偉等[35]報(bào)道，MS+1.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L 2,4-D組合對(duì)茶樹愈傷組織的誘導(dǎo)效果較好。陳玉玲等[40]研究發(fā)現(xiàn)，用茶樹葉片和莖段為外植體，莖段誘導(dǎo)愈傷組織的效果好于葉片，誘導(dǎo)莖段愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+0.4 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2,4-D。姚永宏等[41]認(rèn)為誘導(dǎo)茶樹幼莖愈傷組織最適培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L NAA+1.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT。袁毅君等[42]研究發(fā)現(xiàn)，利用莖段誘導(dǎo)愈傷組織的最佳培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2,4-D+1.0 mg/L NAA，最佳的葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.5 mg/L NAA+1.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L KT。在茶樹組織培養(yǎng)中，兩類常用的植物激素是生長素（2,4-D、NAA、IBA）和細(xì)胞分裂素（6-BA、KT、ZT），它們的種類、濃度與比例均對(duì)外植體誘導(dǎo)和增殖起著很大的作用。一般來說，在進(jìn)行增殖培養(yǎng)時(shí)，生長素用量通常比較低，生長素含量過高，容易誘導(dǎo)出愈傷組織，但愈傷組織的出現(xiàn)又會(huì)導(dǎo)致增殖率降低。此外，細(xì)胞分裂素含量高，會(huì)對(duì)愈傷組織的形成產(chǎn)生抑制作用，但對(duì)芽的誘導(dǎo)和生長有一定的促進(jìn)作用。李家華等[43]在沒有添加BA的情況下，發(fā)現(xiàn)無叢生芽長出，而在有BA的情況下長出了叢生芽。譚和平等[44]報(bào)道，在細(xì)胞分裂素（CK）用量相同的情況下，生長素（IAA）比萘乙酸（NAA）對(duì)茶樹芽的誘導(dǎo)效果更好。

1.4 組織培養(yǎng)條件

茶樹組織培養(yǎng)除了與外植體、培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑等方面因素有關(guān)外，還與培養(yǎng)時(shí)外界環(huán)境（溫度、光照）有很大關(guān)系。鐘俊輝等[45]發(fā)現(xiàn)，愈傷組織在35℃的環(huán)境下培養(yǎng)，將會(huì)褐變，甚至枯死。劉德華等[46]研究發(fā)現(xiàn)，不定芽的分化率與光照強(qiáng)度呈正相關(guān)。雷攀登等[47]報(bào)道，升高溫度會(huì)導(dǎo)致多酚氧化酶活性增加，從而加速外植體的褐化。降低培養(yǎng)溫度或暗培養(yǎng)能鈍化多酚氧化酶的活性，減少多酚類物質(zhì)的氧化，明顯減輕外植體的褐化。周琳等[48]報(bào)道，光質(zhì)不同會(huì)對(duì)茶樹愈傷組織的生長和內(nèi)含物積累產(chǎn)生不同的效應(yīng)，紅光處理下茶多酚含量最大，促進(jìn)外植體的褐化，而藍(lán)光下愈傷組織生長情況較好。

2 展望

外植體的污染是茶樹組織培養(yǎng)過程中較難解決的重要問題，主要原因是茶樹體內(nèi)帶有較多的內(nèi)生菌，常規(guī)的表面消毒對(duì)于內(nèi)生菌來說效果不是很好，難以控制內(nèi)生菌的污染，導(dǎo)致茶樹組織培養(yǎng)污染率居高不下。另外茶樹體內(nèi)多酚類物質(zhì)含量較高，組培過程中茶樹外植體切割后產(chǎn)生傷口，一些酚類、醌類等有害物質(zhì)被氧化產(chǎn)生褐色的有害物質(zhì)，引起外植體發(fā)生褐化，繼而死亡。以上兩種原因使得茶樹組織培養(yǎng)體系不穩(wěn)定，可重復(fù)性差，再生頻率低，導(dǎo)致茶樹離體再生較困難且轉(zhuǎn)化效率極低，很大程度地限制了組培技術(shù)在茶樹中的應(yīng)用。因此，今后的研究應(yīng)加強(qiáng)對(duì)茶樹組培的基礎(chǔ)研究，如防止外植體污染，預(yù)防和控制褐化，激素的調(diào)控機(jī)理，培養(yǎng)條件優(yōu)化，大田移栽試驗(yàn)等，實(shí)現(xiàn)組培苗的工廠化生產(chǎn)。

茶樹利用種子繁殖，雖有方法簡單、成本低、后代適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但茶樹是異花授粉植物，容易發(fā)生性狀分離，易產(chǎn)生變異，導(dǎo)致優(yōu)良性狀丟失，且種子繁殖生育周期長、座果率低等原因?qū)е潞茈y對(duì)其進(jìn)行遺傳改良。利用組織培養(yǎng)技術(shù)可為茶樹基因轉(zhuǎn)移提供大量的理想受體，將茶樹基因工程與組織培養(yǎng)相結(jié)合，建立穩(wěn)定高效的茶樹離體再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系，培育出更多的新優(yōu)特品種，從而提高茶樹育種效率。目前，我國茶樹品種逐漸被無性系良種所取代，對(duì)于數(shù)量稀少的野生茶樹和不育或敗育率很高的品種，可望通過組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行茶樹種質(zhì)資源保存，這對(duì)節(jié)約時(shí)間、空間及維持我國茶樹品種的多樣性較有意義。