三花龍膽化學成分及抗腫瘤活性研究

周艷麗 王大利 張艷 張寧 李碩熙 吳嬌

[摘要] 目的 探討三花龍膽（Gentiana triflora Pall.）的化學成分及其體外抗腫瘤活性。 方法 采用95%乙醇對三花龍膽根莖進行回流提取，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進行萃取，萃取物用硅膠柱色譜、制備型高效液相色譜進行分離純化，根據(jù)理化性質和波譜數(shù)據(jù)對化合物進行結構鑒定;采用四氮唑鹽還原法（MTT）評價各化合物的抗腫瘤活性。 結果 從乙酸乙酯和正丁醇萃取部位分離得到5個化合物，分別鑒定為globuloside A（1）、cornusoside A（2）、cornolactone A（3）、6，9-epi-8-O-Acetylshanziside methyl ester（4）、5，9-epi-Penstemoside（5）;抗腫瘤活性實驗表明，化合物1對HepG2細胞的體外增殖具有一定的抑制作用，IC50值為6.7 μmol/L。 結論 所有化合物均首次從該植物中分離得到;化合物1對HepG2細胞的增殖具有明顯的抑制活性。

[關鍵詞] 三花龍膽;化學成分;結構鑒定;抗腫瘤活性

[中圖分類號] R284.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）01（a）-0020-04

三花龍膽（Gentiana triflora Pall.）為龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬（Gentiana）多年生草本植物，喜陰，耐寒;主要分布于中國東北、華北，以及日本、朝鮮、俄羅斯東部等地，具有較高的觀賞價值和藥用價值，在民間多用于清濕熱、瀉肝火[1]。龍膽屬植物主要含有環(huán)烯醚萜、裂環(huán)環(huán)烯醚萜及其苷類化合物[2-16]。然而，國內外關于常用藥材的三花龍膽的化學成分及生物活性的研究報道較少。有文獻[17]報道，龍膽屬植物具有抗腫瘤活性，但發(fā)現(xiàn)的活性成分很少。為明確三花龍膽的化學成分、探討其抗腫瘤藥效物質基礎，本研究對三花龍膽的化學成分及體外抗腫瘤活性進行研究，以期為確定三花龍膽的抗腫瘤藥效物質基礎提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Mercury Plus 400 MHz核磁共振儀（美國Varian公司）;Agilent 1260高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）;LC-20AR制備型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）;YMC ODS-A制備色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司）;RV 10 digital V旋轉蒸發(fā)儀（德國IKA公司）;柱色譜硅膠（300～400目，青島海洋化工廠）。Multiskan GO 酶標儀（美國Thermo-Fisher公司）;TS-100F倒置顯微鏡（日本Nikon公司）;MCO-20AIC CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）;SW-CJ-2FD超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司）;TGL-16M臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.2 試藥

實驗所用試劑為分析純和色譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司）。

實驗用三花龍膽于2015年8月購買于河北省安國市，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院陳效忠副教授鑒定為龍膽屬（Gentiana）植物三花龍膽（Gentiana triflora Pall.）的全草。藥材標本保存于黑龍江中醫(yī)藥大學佳木斯學院標本館。

2 方法與結果

2.1 提取與分離方法

稱取三花龍膽干燥全草5 kg粉碎，用體積分數(shù)為95%的乙醇加熱回流提取3次，合并提取液，經(jīng)減壓濃縮得到浸膏425 g，加40℃去離子水均勻分散，之后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，濃縮萃取液，得到石油醚萃取物28 g、乙酸乙酯萃取物35 g、正丁醇萃取物77 g。乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇溶劑系統(tǒng)（50∶1→5∶1）梯度洗脫，分段為5個部分（Fr1～Fr5），其中Fr1（6 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇溶劑系統(tǒng)（100∶1→5∶1）梯度洗脫，得化合物2（12 mg），化合物3（7 mg）;正丁醇萃取物經(jīng)硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇溶劑系統(tǒng)（50∶1→1∶1）梯度洗脫，分段為6個部分（Fr1～Fr6），其中Fr1（13 g）經(jīng)硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇溶劑系統(tǒng)（100∶1→1∶1）梯度洗脫，分為8個流分（Fr.1-1～Fr.1-8）。Fr.1-1（1.5 g）經(jīng)制備型高效液相色譜分離，用45%甲醇-水等度洗脫，得到化合物1（9 mg）、化合物4（13 mg）;Fr.1-2（2.1 g）經(jīng)制備型高效液相色譜分離，用30%甲醇-水等度洗脫，得化合物5（15 mg）。

2.2 體外抗腫瘤活性實驗方法

采用四氮唑鹽還原法（MTT比色法）分別評價5個化合物對三種腫瘤細胞（人肝癌細胞HepG2、BeL7402和小鼠肝癌細胞H22）的抑制作用。腫瘤細胞使用DMEM（含10%胎牛血清、1%雙抗）培養(yǎng)基在含5%CO2的孵箱中于37℃條件下培養(yǎng)。首先，在96孔培養(yǎng)板的每個孔中接種100 μL處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞（個數(shù)約為1×104），培養(yǎng)12 h后加入梯度濃度的受試藥物，每個劑量設5個復孔，同時設空白對照孔、調零孔，在37℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后，每孔加入20 μL的5 g/L的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后，離心棄去培養(yǎng)液，每空加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO），振蕩10 min，待結晶充分溶解后，用酶標儀于570 nm處測定各孔的吸光度（OD值）。

2.3 化學成分鑒定

化合物1：白色粉末?；衔餅閍和b兩部分構成的二聚體。a部分：1H NMR （CDCl3，400 MHz）δ：5.06（1H，dd，J = 6.0，1.8 Hz，H-3），5.08（1H，dd，J = 6.0， 4.7 Hz，H-4），2.29（1H，m，H-5），3.92（1H，brs，H-6），3.51（1H，brs，H-7），2.59（1H，dd，J = 9.7，7.6 Hz，H-9），4.98（1H，d，J = 12.5 Hz，H-10a），4.23（1H，d，J = 12.5Hz，H-10b），5.01（1H，d，J = 8.1 Hz，H-1′），4.79（1H，dd，J = 8.1，9.5 Hz，H-2′），3.55（1H，t，J = 9.5 Hz，H-3′），3.38（1H，m，H-4′），3.39（1H，m，H-5′），3.96（1H，brd，J = 12.0 Hz，H-6a′），3.70（1H，dd，J = 12.0，5.5 Hz，H-6b′），7.66（1H，m，H-2′′），7.42（1H，m，H-3′′），7.42（1H，m，H-4′′），7.42（1H，m，H-5′′），7.66（1H，m，H-6′′），7.71（1H，d，J = 16.0 Hz，H-a），6.59（1H，d，J = 16.0 Hz，H-b）;b部分：1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ：6.38（1H，s，H-1），7.41（1H，d，J =1.8 Hz，H-3），3.61（1H，m，H-5），2.57（1H，m，H-6a），1.46（1H，m，H-6b），2.52（1H，m，H-7），4.29（1H，brd，J = 12.5 Hz，H-10a），4.20（1H，dd，J = 12.5，1.0 Hz，H-10b），4.70（1H，d，J = 7.9 Hz，H-1′），3.17（1H，dd，J = 7.9，9.0 Hz，H-2′），3.40（1H，m，H-3′），3.30（1H，m，H-4′），3.32（1H，m，H-5′），3.88（1H，m，H-6a′），3.69（1H，m，H-6b′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道的化合物基本一致，故鑒定化合物為globulosideA（圖1）。

化合物2：白色粉末。1H NMR （CDCl3，400 MHz）δ：3.99（1H，dd，J = 10.4，3.6 Hz，H-1a），3.39（1H，m，H-1b），3.96（1H，d，J = 5.6 Hz，H-4），3.38（1H，q，J = 7.2 Hz，H-5），5.05（1H，t，H-6），2.01（1H，dd，J = 13.6， 6.0 Hz，H-7a），1.49（1H，ddd，J = 13.6，11.6，6.0 Hz，H-7b），1.91（1H，m，H-8），1.85（1H，m，H-9），0.96（3H，d，J = 5.6 Hz，H-10），3.70（3H，s，OMe），4.07（1H，d，J = 7.8 Hz，H-1′），2.94（1H，td，J = 8.0，4.4 Hz，H-2′），3.12（1H，m，H-3′），3.05（1H，m，H-4′），3.08（1H，d，J = 3.9 Hz，H-5′），3.65（1H，m，H-6a′），3.45（1H，m，H-6b′），4.74（1H，d，J = 4.3 Hz，OH-2′），4.95（1H，d，J = 5.0 Hz，OH-3′），4.94（1H，d，J = 5.5 Hz，OH-4′），4.47（1H，t，J = 5.9 Hz，OH-6′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道的化合物基本一致，故鑒定化合物為cornusoside A（圖2）。

化合物3：白色粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz） δ：3.88（1H，dd，J = 11.0，4.0 Hz，H-1a），3.59（1H，dd，J = 11.0，9.0 Hz，H-1b），2.68（1H，dd，J = 18.8，4.7 Hz，H-4a），2.61（1H，dd，J = 18.8，9.8 Hz，H-4b），3.15（1H，m，H-5），5.02（1H，t，J = 6.0 Hz，H-6），2.22（1H，dd，J = 14.0，5.0 Hz，H-7a），1.45（1H，ddd，J = 14.0，11.8，5.5 Hz，H-7b），1.83（1H，m，H-8），1.81（1H，m，H-9），1.03（3H，d，J = 5.6 Hz，H-10）。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道的化合物基本一致，故鑒定化合物為cornolactone A（圖3）。

化合物4：白色粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz） δ：5.92（1H，d，J = 2.5 Hz，H-1），7.46（1H，d，J = 1.5 Hz，H-3），3.08（1H，dd，J = 1.5，9.0 Hz，H-5），4.35（1H，m，H-6），2.21（1H，brd，H-7a），2.05（1H，brd，H-7b），3.01（1H，dd，J = 2.5，9.0 Hz，H-9），1.53（1H，s，H-10），3.74（3H，s，OMe-11），2.03（1H，s，OCOCH3-8），4.65（1H，d，J = 8.0 Hz，H-1′），3.18（1H，dd，J = 8.0，9.0 Hz，H-2′），3.38（1H，t，J = 9.0 Hz，H-3′），3.28（1H，t，J = 9.0 Hz，H-4′），3.31（1H，m，H-5′），3.91（1H，dd，J = 2.0，12.0 Hz，H-6a′），3.68（1H，dd，J = 6.0，12.0 Hz，H-6b′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道的化合物基本一致，故鑒定化合物為6，9-epi-8-O-Acetylshanziside methyl ester（圖4）。

化合物5：白色粉末。1H NMR（CDCl3，400 MHz） δ：5.83（1H，s，H-1），7.57（1H，s，H-3），4.30（1H，t，J = 4.5 Hz，H-6），1.49（1H，ddd，J = 5.0，6.5，11.5 Hz，H-7a），1.82（1H，ddd，J = 4.5，7.0，11.5 Hz，H-7b），2.63（1H，s，H-8），2.59（1H，m，H-9），0.95（1H，d，J = 7.0 Hz，H-10），3.75（3H，s，OMe-11），4.59（1H，d，J = 8.0 Hz，H-1′），3.20（1H，dd，J = 8.0，9.0 Hz，H-2′），3.39（1H，t，J = 9.0 Hz，H-3′），3.26（1H，t，J = 9.0 Hz，H-4′），3.32（1H，m，H-5′），3.93（1H，dd，J = 2.0，12.0 Hz，H-6a′），3.67（1H，dd，J = 6.0，12.0 Hz，H-6b′）。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道的化合物基本一致，故鑒定化合物為5，9-epi-Penstemoside（圖5）。

2.4 抗腫瘤活性

藥理活性測試發(fā)現(xiàn)，化合物1對HepG2的增殖具有明顯的抑制作用，IC50值為6.7 μmol/L，且在測定濃度范圍內劑量依賴性較好;其他化合物均無顯著的抗腫瘤活性（化合物2～4的IC50值分別為38.6、22.5、30.7 μmol/L）。

3 討論

三花龍膽是一種常用藥用植物資源，應用范圍廣，療效確切，但關于其藥效物質基礎的研究很少。本研究對該植物進行了系統(tǒng)的化學成分分析，首次從該植物中獲得5個環(huán)烯醚萜類化合物，其中一個化合物具有良好的抗腫瘤活性，為闡明三花龍膽的抗腫瘤作用奠定了物質基礎。繼續(xù)研究該植物的化學成分，并分析活性化合物的作用機制，以期為該藥用資源更好地應用奠定基礎。

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（收稿日期：2018-05-28? 本文編輯：王? ?蕾）