基于微流控技術(shù)的納升級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選方法的研究進(jìn)展

高潔 方群

摘?要?X射線晶體學(xué)技術(shù)是目前蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定中最主要的方法。為了得到滿(mǎn)足衍射要求的高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體，研究者通常耗費(fèi)大量試劑和樣品進(jìn)行大規(guī)模結(jié)晶條件篩選。微流控技術(shù)通過(guò)對(duì)超微量流體的操縱，可大幅降低在蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選中蛋白樣品的消耗。本文依據(jù)結(jié)晶方法，分別介紹了基于微批量法、蒸氣擴(kuò)散法、自由界面擴(kuò)散法和透析法的微流控蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選方法的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞?微流控技術(shù); 蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選; 納升級(jí); 評(píng)述

1?引 言

蛋白質(zhì)作為一種生物大分子，其結(jié)構(gòu)的測(cè)定對(duì)生命科學(xué)的發(fā)展具有重要意義。生物系統(tǒng)內(nèi)的作用機(jī)制和進(jìn)化過(guò)程都與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)息息相關(guān)。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測(cè)定有助于從原子層面理解生命活動(dòng)，從而為疾病診斷和新藥設(shè)計(jì)提供新的基礎(chǔ)[1]。目前，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)主要通過(guò)3種方法測(cè)定：X射線晶體學(xué)技術(shù)（X-ray crystallography）、核磁共振波譜技術(shù)（Nuclear magnetic resonance， NMR）和電子顯微鏡技術(shù)（Electron microscopy）。NMR技術(shù)可測(cè)定的蛋白質(zhì)種類(lèi)受限較大，要求測(cè)定對(duì)象須是中小分子量的可溶性蛋白，而且濃度為1 mmol/L時(shí)不聚集。電子顯微鏡借助電子衍射技術(shù)和單顆粒技術(shù)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，但電子衍射技術(shù)需蛋白質(zhì)的二維晶體，而單顆粒技術(shù)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分辨率不佳。近年來(lái)，冷凍電鏡技術(shù)（Cyro-electron microscopy， cryo-EM）的快速發(fā)展基本解決了借助單顆粒技術(shù)解析結(jié)構(gòu)的分辨率問(wèn)題，顯著提高了電鏡技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定中的地位[2，3]。然而，X射線晶體學(xué)技術(shù)仍然是當(dāng)前蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定中最主要的方法。該技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)的分子量和可溶性沒(méi)有特殊要求，解析結(jié)構(gòu)的分辨率能達(dá)到單個(gè)原子水平。同時(shí)，同步輻射光源、微量和自動(dòng)化液體操作等相關(guān)技術(shù)的發(fā)展都在持續(xù)有力地推動(dòng)該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展[4]。

目前，結(jié)構(gòu)已被測(cè)定的蛋白質(zhì)仍只占蛋白質(zhì)總數(shù)的很小部分，據(jù)估計(jì)，每百個(gè)研究的蛋白質(zhì)中，僅約兩個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)能被成功測(cè)定[5]。利用X射線晶體學(xué)技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定的主要瓶頸之一是難以獲得滿(mǎn)足衍射分析要求的蛋白質(zhì)晶體。蛋白質(zhì)結(jié)晶過(guò)程受到蛋白質(zhì)純度和濃度、沉淀劑種類(lèi)和濃度、pH值、添加劑、離子強(qiáng)度、溫度等眾多因素的影響[6]，上述因素的細(xì)微變化都可能產(chǎn)生不利于晶體衍射的晶體性質(zhì)變化，如晶體尺寸小、形貌差、溶劑含量高、機(jī)械強(qiáng)度差等[4]。因此，高質(zhì)量的蛋白質(zhì)結(jié)晶需要依靠對(duì)成百上千個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)的篩選實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)，而很多珍稀蛋白質(zhì)的樣品本身的制備量通常不足毫克[7]，這對(duì)篩選過(guò)程的微量化、規(guī)模化和自動(dòng)化提出了很高的要求。

微流控技術(shù)是操縱微量流體的技術(shù)。將微流控技術(shù)用于蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選，具有以下優(yōu)勢(shì)：（1）顯著降低蛋白樣品和沉淀劑的消耗，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，這一特點(diǎn)對(duì)難以表達(dá)和提純的珍稀蛋白質(zhì)的意義尤為重要; （2）實(shí)現(xiàn)常規(guī)毫升和微升體積下無(wú)法完成的操作，如對(duì)分子擴(kuò)散和晶體成核的精確控制[6]; （3）借助微體系下的自由對(duì)流環(huán)境，得到高質(zhì)量晶體[8]; （4）自動(dòng)化程度高，耗時(shí)少，篩選通量高。本世紀(jì)以來(lái)，微流控技術(shù)已成為蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選的有力工具，近年來(lái)，研究者分別從微流控蛋白質(zhì)結(jié)晶方法[4，6，9～11]、微流控結(jié)晶裝置[12]和蛋白質(zhì)結(jié)晶技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)[13]等方面對(duì)相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。本文依據(jù)結(jié)晶方法，對(duì)基于微流控技術(shù)的超微量納升級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選方法進(jìn)行了評(píng)述。

2?納升級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選方法

蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)是蛋白質(zhì)在溶液中的相轉(zhuǎn)變[14]，當(dāng)溶液中的蛋白質(zhì)和沉淀劑濃度達(dá)到相圖中的過(guò)飽和區(qū)域時(shí)，蛋白質(zhì)分子開(kāi)始成核，從溶液中析出，蛋白質(zhì)濃度減小。整個(gè)體系由成核區(qū)域（Nucleation zone）向亞穩(wěn)區(qū)域（Metastable zone）轉(zhuǎn)變，此時(shí)成核不再發(fā)生，晶體開(kāi)始生長(zhǎng)，最終達(dá)到溶解度曲線（Solubility curve）。微批量法（Microbatch）、蒸氣擴(kuò)散法（Vapour diffusion）、透析法（Dialysis）和自由界面擴(kuò)散法（Free interface diffusion， FID）是常見(jiàn)的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法，基于這4種方法的體系在晶體成核前的路徑是不同的，但成核開(kāi)始后，路徑統(tǒng)一[6]， 表1比較了4種結(jié)晶方法的優(yōu)點(diǎn)與不足。由于微批量法的實(shí)驗(yàn)裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，早期基于微流控技術(shù)的納升級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選多選用微批量法為結(jié)晶方法。在此基礎(chǔ)上，研究者逐步實(shí)現(xiàn)了基于其它結(jié)晶方法的結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。

2.1?基于微批量法的納升級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選系統(tǒng)

基于微批量法的蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)是指蛋白質(zhì)溶液和沉淀劑溶液以特定濃度混合，形成蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)器，在蛋白質(zhì)分子成核前，反應(yīng)器內(nèi)各組分的濃度均保持不變[14]。微批量法由Chayen等[15]于1990年首次提出，為防止微量樣品和試劑蒸發(fā)，大部分基于微批量法的結(jié)晶實(shí)驗(yàn)在油下進(jìn)行，故亦稱(chēng)為油下微批量法（Microbatch under oil）[16]。該方法的優(yōu)點(diǎn)主要有：蛋白質(zhì)和沉淀劑濃度可準(zhǔn)確控制，有利于對(duì)整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)晶過(guò)程進(jìn)行研究，如相圖的繪制; 油下加樣與反應(yīng)受水相蒸發(fā)的影響很小，有利于實(shí)現(xiàn)篩選的微量化和規(guī)?；? 蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選可在不同溫度下進(jìn)行，以獲得更多結(jié)晶條件[17]; 通過(guò)改變油的種類(lèi)和配比，可以實(shí)現(xiàn)油下的蒸氣擴(kuò)散法[18]，將兩種結(jié)晶方法的優(yōu)勢(shì)有效地結(jié)合起來(lái)。微批量法的局限性主要在于成核前的蛋白質(zhì)和沉淀劑濃度在反應(yīng)器中保持不變，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)濃度的篩選，沉淀劑中無(wú)法使用溶于油或與油反應(yīng)的有機(jī)試劑，蛋白質(zhì)初始濃度過(guò)高，容易產(chǎn)生碎晶和沉淀。

2.1.1?連續(xù)流液滴技術(shù)?Ismagilov研究組[19]利用T型通道連續(xù)流液滴技術(shù)[20]，發(fā)展了一種有效調(diào)節(jié)納升級(jí)液滴組成的蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選芯片。通過(guò)改變匯流通道內(nèi)不同試劑的流速形成不同試劑配比的液滴，進(jìn)行基于微批量法的蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選。該芯片每秒生成數(shù)個(gè)蛋白質(zhì)和沉淀劑含量不同的液滴，每個(gè)液滴的蛋白樣品消耗為4 nL甚至更少，實(shí)現(xiàn)了高通量和低消耗篩選蛋白質(zhì)結(jié)晶。基于該方法，Gerdts等[21]使用名為Microcapillary Protein Crystallization System（MPCS）[22]的結(jié)晶系統(tǒng)，通過(guò)濃度梯度的篩選，用微批量法對(duì)29種蛋白質(zhì)的基于常規(guī)蒸氣擴(kuò)散法的結(jié)晶實(shí)驗(yàn)進(jìn)行重復(fù)，成功結(jié)晶了其中28種蛋白質(zhì)。 此外，Pham等[23]將該方法和小角X射線散射（Small-angle X-ray scattering， SAXS）技術(shù)結(jié)合，生成的液滴流經(jīng)X射線束，記錄SAXS數(shù)據(jù)，用于研究溶液中的蛋白質(zhì)結(jié)晶過(guò)程，顯著降低了樣品和時(shí)間消耗。為了將連續(xù)流液滴技術(shù)應(yīng)用于基于蒸氣擴(kuò)散法的蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，Ismagilov研究組[24]采用雙匯流通道，交替間隔形成結(jié)晶液滴和高濃度鹽液滴。相鄰的液滴組成基于蒸氣擴(kuò)散法的蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)器。通過(guò)調(diào)節(jié)試劑流速即可改變液滴間距，并以此調(diào)節(jié)蒸氣擴(kuò)散速率，有助于獲得理想的結(jié)晶結(jié)果。

本研究組發(fā)展了一種可進(jìn)行快速進(jìn)樣和試樣更換的連續(xù)流液滴篩選系統(tǒng)[25]。該系統(tǒng)中，不同的沉淀劑儲(chǔ)于缺口管陣列中，蛋白樣品和緩沖液儲(chǔ)于芯片上的儲(chǔ)液池中，三者匯合后，通過(guò)十字通道生成液滴，形成基于微批量法的蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)器。該系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)在于通過(guò)移動(dòng)缺口管陣列，芯片上的取樣探針可劃過(guò)不同的缺口管吸入不同的沉淀劑，從而使連續(xù)流液滴技術(shù)能夠用于不同沉淀劑的篩選實(shí)驗(yàn)，且單種沉淀劑蛋白樣品消耗僅為2.4 nL。

2.1.2?液滴儲(chǔ)存器技術(shù)?為了篩選不同的沉淀劑，Ismagilov研究組發(fā)展了一種液滴儲(chǔ)存器（Droplet cartridge）技術(shù)[26]，用于蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選。其方法是將沉淀劑液滴預(yù)先引入毛細(xì)管中儲(chǔ)存，再通過(guò)漏斗型接口將毛細(xì)管和芯片的T型通道連接，分別通入蛋白質(zhì)溶液和沉淀劑液滴，兩者融合生成結(jié)晶反應(yīng)器液滴，流入下游的的毛細(xì)管中，進(jìn)行基于微批量法的蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)。液滴儲(chǔ)存器易操作且低消耗[27]，篩選48個(gè)條件所消耗的蛋白樣品少于1 μL。

2.1.3?液滴組裝技術(shù)?本研究組[28]基于液滴組裝技術(shù)，發(fā)展了一種自動(dòng)化的微流控液滴篩選平臺(tái)——液滴實(shí)驗(yàn)室（DropLab），并將其應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選。該系統(tǒng)利用拉尖的毛細(xì)管依次吸取蛋白質(zhì)溶液、沉淀劑和油相，直接組裝生成結(jié)晶反應(yīng)器液滴，進(jìn)行基于微批量法的蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)，篩選50個(gè)不同的沉淀劑共消耗蛋白樣品300 nL。

2.1.4?滑動(dòng)芯片技術(shù)?Ismagilov研究組[29]在基于基片的預(yù)裝載技術(shù)[30]的基礎(chǔ)上，發(fā)展了一種滑動(dòng)芯片（Slipchip）技術(shù)，用于蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選。實(shí)驗(yàn)時(shí)先將預(yù)先生成的沉淀劑液滴加入下層基片的微孔中，再滑動(dòng)上層基片，使上層基片的微孔和下層基片的微槽連成一條完整的通道，然后從通道一端通入蛋白樣品，使上層基片的微孔中充滿(mǎn)樣品，最后再滑動(dòng)上層基片，使上下兩層基片的微孔對(duì)準(zhǔn)，沉淀劑和蛋白樣品混合，形成基于微批量法的蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)器。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于芯片結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，無(wú)須鍵合，且操作過(guò)程不用借助泵和閥，受實(shí)驗(yàn)條件限制小。每個(gè)反應(yīng)僅消耗蛋白樣品5 nL，單塊芯片可同時(shí)完成48個(gè)結(jié)晶反應(yīng)篩選。該研究組[31]將滑動(dòng)芯片進(jìn)一步改進(jìn)，簡(jiǎn)化了沉淀劑裝載的方法，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)和沉淀劑不同混合比例的篩選。他們還通過(guò)改變芯片結(jié)構(gòu)在滑動(dòng)芯片上實(shí)現(xiàn)了基于自由界面擴(kuò)散法的蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選[32]。上層基片上加工的微槽，在裝載試劑和樣品時(shí)用于連接微孔，在反應(yīng)發(fā)生時(shí)作為自由界面擴(kuò)散的通道，下層基片上加工有裝載沉淀劑和蛋白樣品的微孔。通過(guò)改變通道尺寸及對(duì)應(yīng)微孔之間的距離，獲得不同的擴(kuò)散平衡時(shí)間，增加了篩選條件的多樣性。

2.1.5?離心芯片技術(shù)?Li等[33]利用毛細(xì)作用和離心力驅(qū)動(dòng)技術(shù)發(fā)展了一種用于納升級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選的微流控離心芯片。先將沉淀劑和蛋白質(zhì)溶液加入相應(yīng)的芯片通道入口，溶液在毛細(xì)作用下流入并充滿(mǎn)對(duì)應(yīng)的通道，由于毛細(xì)截止閥的作用，溶液無(wú)法流入反應(yīng)腔室內(nèi)。然后，在大于6000 r/min的轉(zhuǎn)速下將芯片離心1 min，通道中的沉淀劑和蛋白質(zhì)溶液在離心力驅(qū)動(dòng)下，進(jìn)入反應(yīng)腔室并混合。最后，加油密封，形成基于微批量法的蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)器。每個(gè)結(jié)晶反應(yīng)消耗試劑31 nL，單塊芯片可同時(shí)完成24個(gè)反應(yīng)。為了在離心芯片上實(shí)現(xiàn)基于蒸氣擴(kuò)散法的蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選，該研究組[34]對(duì)該芯片進(jìn)行改進(jìn)，增加了沉淀劑儲(chǔ)存通道和蒸氣擴(kuò)散腔室。蒸氣擴(kuò)散腔室和反應(yīng)腔室、沉淀劑儲(chǔ)存通道以細(xì)通道相連接，形成二級(jí)毛細(xì)截止閥。6000 r/min的轉(zhuǎn)速只能使通道中的溶液沖破一級(jí)毛細(xì)截止閥，而無(wú)法通過(guò)二級(jí)毛細(xì)截止閥，在擴(kuò)散腔室保留氣體空間以進(jìn)行蒸氣擴(kuò)散。采用該芯片篩選得到的結(jié)晶條件多于傳統(tǒng)懸滴法。

2.1.6?濃度梯度技術(shù)?Yang等[35]將其研制的濃度梯度芯片[36，37]進(jìn)行改進(jìn)，用于納升級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選。該芯片包含濃度梯度形成通道、油相通道和液滴生成通道。濃度梯度形成原理為，兩種溶液在弧形通道匯合，以1：1的比例流入直型通道，混合后的溶液在下一級(jí)的弧形通道重復(fù)以上過(guò)程，每種溶液在流經(jīng)一級(jí)弧形和直型軌道后，產(chǎn)生3種不同濃度的溶液[36]。在蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選實(shí)驗(yàn)中，沉淀劑、蛋白樣品或兩者的混合溶液從水相入口通入，經(jīng)過(guò)濃度梯度形成區(qū)域形成不同配比的結(jié)晶反應(yīng)溶液，然后借助T型通道生成液滴，形成基于微批量法的結(jié)晶反應(yīng)器。通過(guò)調(diào)節(jié)油相的流速可改變生成液滴的體積，最小可達(dá)到0.57 nL，在單塊芯片上，可同時(shí)完成5種沉淀劑各8個(gè)不同濃度的篩選。

Abdallah等[38]利用聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane， PDMS）材料加工了一個(gè)微流控濃度梯度裝置，用于蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選。該裝置分為流體層、薄膜和控制層，薄膜呈自然狀態(tài)時(shí)，閥門(mén)呈關(guān)閉狀態(tài)。先將負(fù)壓施加于控制層，薄膜向下彎曲，閥門(mén)打開(kāi)。再將正壓施加于流體層，推動(dòng)兩個(gè)入口的純水和沉淀劑進(jìn)入通道，清洗裝置。然后將清水更換為蛋白樣品，使沉淀劑和蛋白樣品在每個(gè)微孔中以不同的比例混合。最后向控制層加正壓，閥門(mén)關(guān)閉，形成基于微批量法的結(jié)晶反應(yīng)器。每個(gè)反應(yīng)器僅消耗蛋白樣品25 nL，共形成170個(gè)不同濃度的結(jié)晶反應(yīng)器。

2.1.7?順序操作液滴陣列技術(shù)?本研究組[39]將順序操作液滴陣列（Sequential operation droplet array， SODA）技術(shù)[40]應(yīng)用于納升級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選。實(shí)驗(yàn)中，先將毛細(xì)管、玻璃芯片和儲(chǔ)液池固定在液滴機(jī)器人的特定位置，利用自動(dòng)平移臺(tái)按計(jì)算機(jī)程序操縱毛細(xì)管逐個(gè)從多孔板儲(chǔ)液池中吸取沉淀劑，注入芯片上的微孔內(nèi)形成沉淀劑液滴，待生成由不同的沉淀劑液滴構(gòu)成的液滴陣列后，再操縱毛細(xì)管吸取蛋白樣品溶液，并依次將定體積蛋白質(zhì)溶液加入每個(gè)沉淀劑液滴內(nèi)。蛋白質(zhì)加入操作采用半接觸點(diǎn)樣方式進(jìn)行，避免產(chǎn)生不同沉淀劑之間的交叉污染。上述操作均在油的覆蓋下完成，蛋白樣品與沉淀劑液滴混合形成基于微批量法的結(jié)晶器。借助SODA技術(shù)生成的液滴體積僅為4～8 nL，每種蛋白樣品篩選的結(jié)晶條件最多達(dá)到96個(gè)，且有向更大篩選規(guī)模拓展的潛力。

2.2?基于蒸氣擴(kuò)散法的納升級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選系統(tǒng)

蒸氣擴(kuò)散法是目前常規(guī)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選中使用最廣泛的方法[14]?；谡魵鈹U(kuò)散法的蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)器通常由兩部分組成，較低濃度的蛋白質(zhì)與沉淀劑混合溶液反應(yīng)器和高濃度沉淀劑儲(chǔ)液池。由于反應(yīng)器中的水分經(jīng)由擴(kuò)散途徑向儲(chǔ)液池?cái)U(kuò)散，處于不飽和區(qū)域的蛋白質(zhì)和沉淀劑濃度逐漸升高，進(jìn)入過(guò)飽和區(qū)域，蛋白質(zhì)分子開(kāi)始成核。蒸氣擴(kuò)散發(fā)生的過(guò)程，本身就自動(dòng)完成了對(duì)蛋白質(zhì)和沉淀劑濃度的篩選。該方法的優(yōu)點(diǎn)主要有：通過(guò)對(duì)濃度的篩選提高篩選成功率; 通過(guò)調(diào)節(jié)儲(chǔ)液池中溶液的濃度，可靈活控制反應(yīng)器中的各個(gè)成分及濃度; 通過(guò)改變反應(yīng)器和儲(chǔ)液池之間的距離，可調(diào)節(jié)擴(kuò)散速率。蒸氣擴(kuò)散法的局限性主要在于體系較為復(fù)雜，且其蒸氣擴(kuò)散是動(dòng)態(tài)過(guò)程，一旦實(shí)驗(yàn)開(kāi)始，條件難以精確定量控制。同時(shí)，揮發(fā)性試劑和溫度的變化對(duì)結(jié)晶反應(yīng)影響較大，可能會(huì)造成晶體溶解。

2.2.1?超聲液滴噴射技術(shù)?超聲液滴噴射技術(shù)是一種微量液滴操縱技術(shù)，通過(guò)超聲發(fā)生器將超聲能量聚焦于液氣界面上，噴射出微量液滴。由于其完全非接觸式的液滴操縱方式，可有效解決不同樣品/試劑之間的交叉污染和樣品吸附問(wèn)題。將該技術(shù)用于蛋白結(jié)晶篩選，在提升晶體質(zhì)量[41]和提高篩選通量[42]方面具有優(yōu)勢(shì)。Teplitsky等[43]利用Labcyte公司的Echo 550超聲液滴操縱儀器，進(jìn)行了蛋白質(zhì)之間或與小分子和配體的共結(jié)晶實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中，由超聲液滴操縱儀器向孔板內(nèi)噴射2.5 nL蛋白樣品、2.5 nL沉淀劑和2.5 nL小分子溶液，組成一個(gè)混合液滴?？装宓膬?chǔ)液池中存有母液，孔板蓋能夠防止液滴向外界蒸發(fā)，因此每個(gè)液滴在孔板中形成基于蒸氣擴(kuò)散法的蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)器。每個(gè)孔可容納18個(gè)液滴， 在一個(gè)96孔板中能同時(shí)進(jìn)行1728個(gè)結(jié)晶反應(yīng)。

2.2.2?3D打印芯片技術(shù)?本研究組[44]將3D打印技術(shù)應(yīng)用到液滴陣列芯片的加工中，結(jié)合SODA技術(shù)，發(fā)展了一種基于蒸氣擴(kuò)散法的納升級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選方法系統(tǒng)。利用3D打印技術(shù)可在加工出具有高深寬比，且深度不同的微孔結(jié)構(gòu)。3D打印芯片的表面有一層聚對(duì)二甲苯（Parylene）涂層，借助該涂層和熔融石蠟填充，可封閉3D打印材料內(nèi)的微孔隙，保證芯片的密封性和穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)中，借助液滴操縱機(jī)器人在毛細(xì)管中吸入沉淀劑和蛋白樣品，注入加油的結(jié)晶液滴孔中生成結(jié)晶液滴，再向沉淀劑孔中加入高濃沉淀劑，最后密封形成基于蒸氣擴(kuò)散法的結(jié)晶反應(yīng)器。每個(gè)反應(yīng)器僅消耗蛋白樣品10 nL，每塊芯片中可完成84個(gè)結(jié)晶反應(yīng)，且能通過(guò)控制油層厚度調(diào)節(jié)蒸氣擴(kuò)散速度。

2.3?基于透析法的納升級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選系統(tǒng)

透析法是基于透析膜的一種蛋白質(zhì)結(jié)晶方法，利用透析膜將蛋白質(zhì)和沉淀劑分隔，蛋白質(zhì)因分子量較大無(wú)法通過(guò)透析膜，而小分子沉淀劑可以透過(guò)[6]。在基于透析法的結(jié)晶實(shí)驗(yàn)中，蛋白質(zhì)一側(cè)的蛋白濃度始終保持不變，而沉淀劑由另一側(cè)通過(guò)透析膜擴(kuò)散進(jìn)入蛋白質(zhì)一側(cè)，在結(jié)晶過(guò)程中，其濃度逐漸升高，直至使結(jié)晶反應(yīng)進(jìn)入成核區(qū)域。此外，還有一類(lèi)透氣膜也被用于類(lèi)似透析法的蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選中，只有水和小分子量有機(jī)溶劑的蒸氣能夠通過(guò)該透氣膜，而鹽、高分子和蛋白質(zhì)都無(wú)法通過(guò)，這使得溶液中所有成分的濃度可快速、精確地可逆轉(zhuǎn)變[45]。相較于其它幾種蛋白質(zhì)結(jié)晶方法，透析法能可逆地調(diào)節(jié)結(jié)晶反應(yīng)器內(nèi)的濃度，將晶體成核和生長(zhǎng)過(guò)程分開(kāi)，獨(dú)立地進(jìn)行濃度優(yōu)化。因此，基于透析法的蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選系統(tǒng)的最大的優(yōu)點(diǎn)在于能夠得到高質(zhì)量的大晶體，而其不足是體系較復(fù)雜，且實(shí)現(xiàn)高通量篩選難度較大。

Shim等[45]結(jié)合透析法和晶種法的優(yōu)勢(shì)發(fā)展了一種相芯片（Phase chip），該芯片以一層15 μm厚的PDMS為透氣膜。實(shí)驗(yàn)中，先將1 nL蛋白質(zhì)結(jié)晶液滴引入裝置中，液滴會(huì)在表面張力的驅(qū)動(dòng)下有序地進(jìn)入每個(gè)微孔中。在儲(chǔ)液池中通入空氣或高濃度的鹽溶液，液滴中的水分通過(guò)PDMS膜向儲(chǔ)液池?cái)U(kuò)散，液滴中各組分的濃度升高，進(jìn)入過(guò)飽和區(qū)域，蛋白質(zhì)分子成核，出現(xiàn)大量小晶體。然后，在儲(chǔ)液池中通入純水，純水向結(jié)晶液滴擴(kuò)散，各組分的濃度變低，小晶體（晶種）溶解到溶液中，這一現(xiàn)象有利于大晶體的生長(zhǎng)，從而獲得大尺寸、高質(zhì)量的晶體。

2.4?基于自由界面擴(kuò)散法的納升級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選系統(tǒng)

自由界面擴(kuò)散法又稱(chēng)液-液擴(kuò)散法，是指兩種溶液通過(guò)微通道相連，溶液中的組分通過(guò)兩溶液界面進(jìn)行自由擴(kuò)散。在基于自由界面擴(kuò)散法的蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)中，對(duì)于蛋白質(zhì)溶液一側(cè)，反應(yīng)初始時(shí)，蛋白質(zhì)濃度最高，而沉淀劑濃度為0。隨著擴(kuò)散的進(jìn)行，蛋白質(zhì)濃度逐漸降低，同時(shí)沉淀劑濃度逐漸升高，進(jìn)入過(guò)飽和區(qū)域，蛋白質(zhì)分子開(kāi)始成核。自由界面擴(kuò)散法的優(yōu)點(diǎn)是成核概率高，且晶體質(zhì)量好。但該方法樣品消耗量較大，且存在重力的混雜效應(yīng)，在蛋白質(zhì)結(jié)晶領(lǐng)域并不常用[46]。引入微流控技術(shù)后，上述兩個(gè)問(wèn)題均被解決，自由界面擴(kuò)散法在該領(lǐng)域得到了一定應(yīng)用。

Quake研究組[47]利用PDMS微泵微閥技術(shù)[48]發(fā)展了一種基于自由界面擴(kuò)散法的蛋白質(zhì)結(jié)晶芯片。通過(guò)控制微閥使沉淀劑和蛋白質(zhì)溶液分別進(jìn)入各自的反應(yīng)微孔，再打開(kāi)連接兩微孔通道上的微閥，使兩種溶液形成擴(kuò)散界面，進(jìn)行基于自由界面擴(kuò)散法的蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)。該芯片在單個(gè)反應(yīng)平均消耗12.5 nL蛋白質(zhì)溶液的條件下，相較傳統(tǒng)方法出晶概率更高、出晶速度更快、晶體質(zhì)量更好。Maeki等[49]對(duì)該方法進(jìn)行改進(jìn)，將兩側(cè)微孔中的溶液改為結(jié)晶溶液和晶種溶液，將自由界面擴(kuò)散法和微晶種法結(jié)合，從而控制蛋白質(zhì)結(jié)晶過(guò)程，用于研究有限空間內(nèi)蛋白質(zhì)晶體的生長(zhǎng)行為。Quake研究組[50]還將基于自由界面擴(kuò)散法和蒸氣擴(kuò)散法的蛋白質(zhì)結(jié)晶實(shí)驗(yàn)集成在一塊芯片上進(jìn)行。蒸氣擴(kuò)散通過(guò)反應(yīng)微孔和儲(chǔ)液池之間的一層透氣PDMS薄膜實(shí)現(xiàn)。該芯片通過(guò)滲透浴強(qiáng)度調(diào)節(jié)蒸氣擴(kuò)散速率，通過(guò)通道長(zhǎng)度控制自由界面擴(kuò)散速率，從而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的動(dòng)態(tài)優(yōu)化。

基于PDMS微泵微閥技術(shù)，Quake研究組[51]還發(fā)展了一種配比芯片（Formulator chip），該芯片由液體量取和液體混合兩個(gè)結(jié)構(gòu)單元組成，能在5 nL的反應(yīng)器中快速混合蛋白樣品和沉淀劑，用于系統(tǒng)地研究蛋白質(zhì)相行為。Hansen研究組[52]在配比芯片的基礎(chǔ)上，結(jié)合液滴技術(shù)，發(fā)展了一個(gè)集成試劑混合、液滴生成和晶體孵育的微流控蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)芯片中，沉淀劑和蛋白樣品在5 nL的圓環(huán)中混合后，借助油相生成納升級(jí)液滴，形成基于微批量法的蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)器。

該平臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)為在每個(gè)反應(yīng)的樣品消耗低于5 nL的情況下集成實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)相圖研究和結(jié)晶篩選實(shí)驗(yàn)。

2.5?其它納升級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選方法

Feuerborn等[53]利用水相在油水間隔流中的水平對(duì)流在反應(yīng)溶液中形成濃度梯度，用于進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選。實(shí)驗(yàn)中，先在充滿(mǎn)油相FC-40的Teflon管中通入少量空氣，再通入60 nL蛋白樣品，然后間隔通入油和20 nL沉淀劑，形成5個(gè)沉淀劑液滴。當(dāng)管內(nèi)液體開(kāi)始流動(dòng)時(shí)，由于不同物質(zhì)在FC-40中的界面張力不同，水相液滴的移動(dòng)速度>油相液滴速度>氣泡速度，使水相液滴包裹住油相液滴，形成一個(gè)大液滴，并產(chǎn)生水平對(duì)流。大液滴中油相間隔的半開(kāi)放反應(yīng)腔室與蛋白樣品向后方的對(duì)流形成了濃度梯度，晶體在合適的濃度孵育生成。

3?總結(jié)與展望

近十幾年來(lái)，基于微流控技術(shù)的納升級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選方法得到了飛速發(fā)展。利用微流控技術(shù)，常規(guī)體系下的基于微批量法、蒸氣擴(kuò)散法、透析法和自由界面擴(kuò)散法的蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)都能在微體積下實(shí)現(xiàn)。此外，微流控蛋白質(zhì)結(jié)晶芯片材料的發(fā)展，顯著地推動(dòng)了原位衍射技術(shù)[54]在蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選領(lǐng)域的發(fā)展。芯片材質(zhì)由玻璃[55]和PDMS[50]，發(fā)展到聚碳酸酯（Polycarbonate， PC）[22]、聚甲基丙烯酸甲酯（Polymethyl methacrylate， PMMA）[56]、環(huán)烯烴共聚物（Cyclic olefin copolymer， COC）[57，58]和聚酯薄膜（Mylar）[59，60]等材料，使得通過(guò)微量的蛋白質(zhì)結(jié)晶反應(yīng)即有可能獲得用于結(jié)構(gòu)解析的全套衍射數(shù)據(jù)。

盡管基于微流控技術(shù)的納升級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選系統(tǒng)具有低消耗、集成化、自動(dòng)化、對(duì)結(jié)晶反應(yīng)的操控性強(qiáng)、利于成核和晶體生長(zhǎng)、可用于原位衍射等優(yōu)點(diǎn)，但目前文獻(xiàn)報(bào)道的大部分系統(tǒng)的應(yīng)用還停留于模型蛋白的結(jié)晶篩選水平，尚未應(yīng)用于實(shí)際蛋白樣品的篩選。這可能主要是由兩個(gè)原因造成的： （1）多數(shù)納升級(jí)蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選系統(tǒng)的篩選規(guī)模不大，篩選沉淀劑的種類(lèi)尚未達(dá)到實(shí)際蛋白樣品結(jié)晶條件初篩的要求; （2）相較于商業(yè)化蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選儀器[61]，微流控系統(tǒng)在通量、操作難度和自動(dòng)化程度等方面，尚存在一定劣勢(shì)。相信隨著微流控技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，微流控蛋白質(zhì)結(jié)晶篩選系統(tǒng)能夠解決上述問(wèn)題，從而應(yīng)用于實(shí)際蛋白樣品的篩選， 為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定提供強(qiáng)有力的工具。

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