多電極陣列微流控芯片內(nèi)細(xì)胞介電泳運(yùn)動(dòng)分析

姚佳烽 姜祝鵬 趙桐 王昊 陳柏 吳洪濤

摘?要?研究了多電極陣列微流控芯片內(nèi)不同細(xì)胞在介電泳力下的運(yùn)動(dòng)特征，對(duì)外部形態(tài)相同而內(nèi)部組蛋白不同的兩種細(xì)胞進(jìn)行了分離。多電極陣列微流控芯片在流道的5個(gè)正方形橫截面嵌入電極陣列，每個(gè)橫截面的一組對(duì)邊嵌入8根電極，此結(jié)構(gòu)擴(kuò)大了微流道的尺寸，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在介電泳力的作用下高流量分離。為了研究微流控芯片內(nèi)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)特征，首先通過電場(chǎng)數(shù)值分析，對(duì)一個(gè)橫截面內(nèi)多電極電場(chǎng)分布進(jìn)行了計(jì)算， 得到了最佳電極組合方式，使得電場(chǎng)分布均勻，且介電泳力最大。之后，通過實(shí)驗(yàn)分析了在不同頻率、多電極復(fù)雜電場(chǎng)下，外部形態(tài)相同而內(nèi)部組蛋白不同的人肺部成纖維細(xì)胞MRC-5的運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)。通過對(duì)介電泳力的波譜進(jìn)行分析，得到了野生型（WT）和組蛋白-GFP型（GFP-HT）兩種細(xì)胞的分離頻率為f=30 kHz。最后，在兩個(gè)入口處通入不同比例的蔗糖（Sucrose）溶液與兩種細(xì)胞混合液，計(jì)算了細(xì)胞的分離率。當(dāng)兩個(gè)入口的流量比為12∶1時(shí)，兩種細(xì)胞的分離率可以達(dá)到93.5%。本研究提出的多電極陣列微流控芯片分離細(xì)胞的方法為細(xì)胞的高流量快速分離奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞?介電泳; 細(xì)胞運(yùn)動(dòng); 多電極; 復(fù)合電場(chǎng); 最優(yōu)電極組合; 微流控芯片

1?引 言

微流控芯片能夠在單個(gè)緊湊裝置中實(shí)現(xiàn)多種功能，如細(xì)胞分離、計(jì)數(shù)和裂解分析[1～3]， 目前，有多種微流控芯片可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離[4，5]。利用微流體裝置進(jìn)行免標(biāo)記高速細(xì)胞操作是生物醫(yī)學(xué)研究中的重要技術(shù)[7～9]， 常見的免標(biāo)記分離方法有磁學(xué)[10，11]、光學(xué)[12]，流體力學(xué)[13]、聲學(xué)[14]以及電動(dòng)學(xué)技術(shù)[15]?等。在這些技術(shù)中，電動(dòng)學(xué)是最有前景的方法之一，它根據(jù)電學(xué)性質(zhì)、細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞表面積等的差異，從普通細(xì)胞中操縱特定細(xì)胞[8，16，17]。電動(dòng)學(xué)分離技術(shù)適用于由完全不同的細(xì)胞所組成的混合物的細(xì)胞操作（如癌細(xì)胞和血細(xì)胞）。然而，對(duì)外部形態(tài)相同，而內(nèi)部組蛋白不同的細(xì)胞分離仍存在一些困難。

針對(duì)以上問題，研究者開發(fā)出了一種面向細(xì)胞免標(biāo)記檢測(cè)與分離的多電極陣列微流控芯片，該芯片可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞空間內(nèi)的高速分離[18～20]。由于多電極陣列的存在，通過選擇激勵(lì)電極的不同組合，可以控制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方向和電動(dòng)力的強(qiáng)度。在介電泳力（Dielectrophoretic force， DEP）、熱浮力和電熱力等交流電動(dòng)力中，介電泳力作用于不同細(xì)胞，產(chǎn)生不同方向的運(yùn)動(dòng)，而其它力則作用于流體，產(chǎn)生渦流運(yùn)動(dòng)，以推動(dòng)細(xì)胞向電極方向靠近[21]。目前，將多電極陣列微流控芯片應(yīng)用于由外部形態(tài)相同，但細(xì)胞內(nèi)組蛋白不同的兩種細(xì)胞的高速分離，尚未得到充分研究。

本研究采用已開發(fā)的多電極陣列微流控芯片，首先通過數(shù)值計(jì)算，得到了最優(yōu)電極組合方式，以得到均勻的電場(chǎng)分布與最大的介電泳力。針對(duì)人肺成纖維細(xì)胞 （Medical research council cell strain 5，MRC-5），采用帶負(fù)電荷的綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein， GFP）和帶正電的組蛋白（Histone，HT）改變細(xì)胞內(nèi)部的成分，研究了綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的組蛋白-GFP細(xì)胞（GFP-HT）與野生型細(xì)胞（Wild type， WT）的不同運(yùn)動(dòng)。最后，通過實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)WT和GFP-HT兩種細(xì)胞進(jìn)行了分離。本研究提出的多電極陣列微流控芯片分離細(xì)胞的方法， 為高通量分離細(xì)胞提供了技術(shù)基礎(chǔ)。

2??實(shí)驗(yàn)方法

2.1?儀器與試劑

Eclipse LV 100顯微鏡（日本Nikon公司），配備有50倍物鏡（NA=0.55）、Fastcam SA3高速相機(jī)（日本Photron公司）。

人成纖維細(xì)胞來源的MRC-5 SV1 TG1細(xì)胞系（日本RIKEN BioResource Research Center ）; 10%胎牛血清（日本Nacalai Tesque公司）; 青霉素、鏈霉素、低葡萄糖Dulbecco改良伊格爾液（美國(guó)GIBCO公司）。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?微流控芯片加工?多電極陣列微流控芯片的制作過程如下：（1）利用光刻法在石英平板上沉積5片10 μm的電極，電極之間間隔為200 μm; （2）在沉積好的電極上再鋪一片石英平板，構(gòu)成一個(gè)電極夾層; （3）在鋪好的第二層石英平板上繼續(xù)利用光刻法沉積第二層的5個(gè)電極; （4）重復(fù)之前的方法，共沉積4層電極; （5）在石英與電極夾層的結(jié)構(gòu)上開出方形槽，作為流道，即可在流道周圍形成5個(gè)橫截面電極。加工方法步驟與文獻(xiàn)[18]類似，但文獻(xiàn)[18]采用菱形結(jié)構(gòu)的微流道，而本研究的微流道是方形結(jié)構(gòu)。

2.2.2?樣品制備?制備通過轉(zhuǎn)染綠色熒光蛋白融合組蛋白修飾的MRC-5人肺成纖維細(xì)胞系，以觀察WT細(xì)胞系和GFP-HT細(xì)胞系細(xì)胞內(nèi)電荷變化的效果。GFP-HT質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染程序參照文獻(xiàn)[22]方法。將穩(wěn)定表達(dá)GFP融合組蛋白的MRC-5細(xì)胞（GFP-HT細(xì)胞）和野生型MRC-5細(xì)胞（WT細(xì)胞）培養(yǎng)在有10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素（分別為50 u/mL和50 μg/mL）的低葡萄糖Dulbecco改良伊格爾液中。在多電極陣列微流控芯片分析細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的實(shí)驗(yàn)中，將細(xì)胞用胰蛋白酶消化并重懸于Dulbecco磷酸鹽緩沖液（D-PBS）中，調(diào)整最終密度為1.0 × 106 cell/mL。

2.2.3?實(shí)驗(yàn)過程?為了避免細(xì)胞電致穿孔現(xiàn)象，采用了交流電壓輸入，電壓Vpp=20 V，頻率f=10 MHz。 交流電顯著降低了細(xì)胞膜內(nèi)外的電勢(shì)差，因而避免了細(xì)胞電致穿孔現(xiàn)象。在實(shí)驗(yàn)中，在多層電極微流控裝置的主流通道中填充細(xì)胞懸浮液后，將AC電壓施加到第一和第三層電極，而第二和第四層電極被設(shè)定為接地。用顯微鏡觀察由于施加電壓引起的細(xì)胞顆粒運(yùn)動(dòng)。焦平面被設(shè)置為電極的第一層，在施加交流電壓后，以60 fps捕獲圖像。

采用粒子跟蹤測(cè)速（PTV）技術(shù)，通過拉格朗日方法在x-z平面跟蹤流體中的單個(gè)細(xì)胞。x-z平面平行于電極層， x方向垂直于電極，朝向多層電極微流控裝置主流通道的中心區(qū)域?？紤]時(shí)間變化，計(jì)算細(xì)胞的速度，比較3種細(xì)胞之間的細(xì)胞顆粒運(yùn)動(dòng)。在對(duì)電極施加交流電壓的狀態(tài)下，以0.1 s的時(shí)間間隔依次追蹤距離電極（25 ± 5） μm的中心線（z=0）附近的細(xì)胞，使用內(nèi)部開發(fā)的圖像分析程序計(jì)算細(xì)胞的軌跡。

2.3?多電極電場(chǎng)分布計(jì)算

本研究討論的交流電場(chǎng)控制方程是麥克斯韋方程組。在電場(chǎng)是角頻率為ω時(shí)間諧波，并且沒有相位滯后的情況下，可以使用電場(chǎng)的復(fù)數(shù)表示法=E0exp（jωt），其中電場(chǎng)的相量幅度E0是實(shí)數(shù)。對(duì)于微電極結(jié)構(gòu)，磁效應(yīng)可以忽略不計(jì)[20]。因此，復(fù)雜形式的麥克斯韋方程簡(jiǎn)化為：

其中，σ和ε是流體的電導(dǎo)率和介電常數(shù)， ρe是局部電荷密度，u是流體速度。式（1）表明，可采用復(fù)合電勢(shì)描述復(fù)合電場(chǎng)，即：

其中，0是電勢(shì)的相位幅度。式（2）中的對(duì)流項(xiàng)ρeu是可以忽略的，因?yàn)樵诖藯l件下電雷諾數(shù)估計(jì)為Reel=U/（σD）～10111[14]。此外，假設(shè)電導(dǎo)率和介電常數(shù)的空間變化很小，通過應(yīng)用小擾動(dòng)理論[4]，式（2）和式（3）減小到拉普拉斯方程的電勢(shì)，20=0。為了方便描述電動(dòng)運(yùn)動(dòng)的時(shí)間平均效應(yīng)，本研究采用復(fù)合場(chǎng)相量幅度的均方根（RMS）場(chǎng)。相應(yīng)地，拉普拉斯方程=02求解，之后，靜電場(chǎng)E=Ε0/2的RMS由式（4）計(jì)算：

多電極電壓施加方式分類，其中數(shù)字①②③④代表微流道單側(cè)電極序號(hào)。單側(cè)4個(gè)電極施加電壓方式分為4類（A、B、C和D）：A（10××）、B（1000）、C（1001）、D（1010）。以A（10××）為例，其含義為，第一個(gè)電極加電壓（用1表示），第二個(gè)電極接地（用0表示），第三、四個(gè)電極空置不使用（用×表示），具體分類見表1。

2.4?正負(fù)介電泳（DEP）

為了分離兩種細(xì)胞，需要得到不同方向的DEP力。分析產(chǎn)生DEP力的公式，在交流電作用下，介電泳（DEP）力可表示為：

其中，dc是細(xì)胞直徑， εf是溶液介電常數(shù)，ω是外加電場(chǎng)的角頻率，Erms是電場(chǎng)強(qiáng)度的均方根。 Re[CM（ω）]是方程（5）中復(fù)數(shù)CM（ω）的實(shí)部。

實(shí)際材料的介電常數(shù)和電導(dǎo)率僅是在特定頻率下材料的“常數(shù)”，并反映了在該頻率下極化與場(chǎng)強(qiáng)關(guān)系的斜率。通常，介電常數(shù)和電導(dǎo)率是頻率的單調(diào)變化函數(shù)。懸浮體和周圍介質(zhì)之間這些變化的相互作用引起介質(zhì)中物體的凈極化，介質(zhì)在頻率范圍內(nèi)可能具有相當(dāng)復(fù)雜的形狀。

其中，εc 和εf是細(xì)胞和流體的復(fù)介電常數(shù)。式（6）在一定頻率范圍內(nèi)具有正值和負(fù)值，就產(chǎn)生了正、負(fù)介電泳，即DEP力對(duì)于 Re[CM（ω）]的正值是正的，對(duì)于Re[CM（ω）]的負(fù)值是負(fù)的。

單個(gè)細(xì)胞在流體中運(yùn)動(dòng)受力為：

其中， mc為細(xì)胞的質(zhì)量，uc為細(xì)胞的速度，F(xiàn)D為細(xì)胞受到流體的曳力，其表達(dá)式為：

3?結(jié)果與討論

3.1?兩類細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

在細(xì)胞和分子生物學(xué)中，蛋白質(zhì)印跡法是用于鑒定蛋白質(zhì)的重要技術(shù)[23]。根據(jù)顯微鏡觀察和蛋白質(zhì)印跡法對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)成分的鑒定[18]，建立了GFP-HT和WT兩種細(xì)胞的示意圖。兩類細(xì)胞在相襯圖像和熒光圖像中的觀察結(jié)果如圖3右方所示。相襯圖像表示了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，熒光圖像顯示了細(xì)胞中GFP的量。從熒光圖像中可以看出，GFP-HT細(xì)胞顯示斑點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)， 表明對(duì)于GFP-HT細(xì)胞，GFP僅出現(xiàn)在細(xì)胞核中。在本研究中，蛋白質(zhì)印跡法確定了兩種細(xì)胞中的蛋白質(zhì)類型與含量，各種蛋白質(zhì)成分含量影響兩種不同細(xì)胞的電氣參數(shù)，對(duì)細(xì)胞分離起到了關(guān)鍵作用[22]。此細(xì)胞示意圖為實(shí)驗(yàn)研究中分析細(xì)胞介電泳運(yùn)動(dòng)提供了基礎(chǔ)。

3.2?細(xì)胞懸浮液的電學(xué)性質(zhì)

細(xì)胞懸浮液的電學(xué)參數(shù)決定了介電泳力的正負(fù)值，本研究考察了不同細(xì)胞懸浮液的電學(xué)參數(shù)特點(diǎn)。在f=0～5 MHz時(shí)，對(duì)比WT、GFP-HT和蔗糖（Sucrose）3種溶液的相對(duì)介電常數(shù)。隨著頻率增大，相對(duì)介電常數(shù)都下降，這是因?yàn)殡娙莩煞衷诟哳l下逐漸被導(dǎo)通。由于細(xì)胞的導(dǎo)電性比蔗糖大，蔗糖的相對(duì)介電常數(shù)值明顯低于兩種細(xì)胞懸浮液。3種溶液的相對(duì)介電常數(shù)在不同頻率下都存在差別，可以產(chǎn)生不同的介電泳力，不同介電參數(shù)的細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)分離。為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分離所需的確切頻率值，以及產(chǎn)生更大介電泳力的多電極如何組合，需要通過仿真與實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析。

3.3?多電極電場(chǎng)的計(jì)算

本研究采用多電極微流控芯片實(shí)現(xiàn)高速細(xì)胞分離，施加電流時(shí)，不同的電極組合方式會(huì)產(chǎn)生不同的電場(chǎng)分布，進(jìn)而影響細(xì)胞分離效果。因此，本研究采用數(shù)值計(jì)算尋找最佳的電極組合方式。

多電極陣列微流控芯片一個(gè)橫截面內(nèi)不同電極組合的電場(chǎng)分布數(shù)值計(jì)算結(jié)果。其中，組合方式B（1000）、C（1001）和D（1010）得到了y方向上較均勻的電場(chǎng)，容易在x方向得到均勻分布的DEP力; 組合方式A（10××）的電場(chǎng)強(qiáng)度主要集中在右上方，無法在整個(gè)橫截面上施加DEP力。定量對(duì)比了電場(chǎng)強(qiáng)度的大小與分布均勻性， ?組合方式D（1010）中，第1和3根電極施加電流，2和4電極接地， 能夠在y方向上得到相對(duì)均勻的電場(chǎng)強(qiáng)度平方的梯度。由式（5）得知，電場(chǎng)強(qiáng)度平方的梯度與DEP力成正比。根據(jù)式（5），此組合方式也可在y方向上產(chǎn)生較大且均勻的DEP力。故選擇組合方式D（1010）為最佳電極組合方式，進(jìn)行細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)分析。

3.4?不同細(xì)胞運(yùn)動(dòng)對(duì)比分析?按照組合方式D（1010）施加電場(chǎng)后，在不同頻率下分析了野生型（WT）細(xì)胞和組蛋白-GFP（GFP-HT）型細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)方向與速度。對(duì)于兩種細(xì)胞，在施加頻率為f=10 kHz時(shí)，運(yùn)動(dòng)方向均為遠(yuǎn)離電極的方向，表明在此頻率下，兩種細(xì)胞均受到負(fù)DEP力; 在施加頻率為f ≥ 100 kHz時(shí)，運(yùn)動(dòng)方向均為靠近電極的方向，表明兩種細(xì)胞受到了正DEP力。顏色也表明，越靠近電極，運(yùn)動(dòng)速度越大。

能夠同時(shí)對(duì)兩類細(xì)胞產(chǎn)生正與負(fù)的DEP力的頻率被稱為分離頻率。為了更加定量化確定細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向與分離頻率的關(guān)系，對(duì)細(xì)胞在不同頻率下的Re[CM（ω）]進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)分析。對(duì)于WT細(xì)胞，在頻率為f=25 kHz時(shí)，Re[CM（ω）]=0，說明f=25 kHz是WT細(xì)胞產(chǎn)生正負(fù)DEP力的分界點(diǎn); 對(duì)于GFP-HT細(xì)胞，f=35 kHz時(shí)，Re[CM（ω）]=0，說明f=35 kHz是GFP-HT產(chǎn)生正與負(fù)的DEP力的分界點(diǎn)。

負(fù)的Re[CM（ω）]產(chǎn)生負(fù)DEP力，細(xì)胞遠(yuǎn)離電極運(yùn)動(dòng); 同樣地，正的Re[CM（ω）]產(chǎn)生正DEP力，細(xì)胞靠近電極運(yùn)動(dòng)。因此基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以取f=30 kHz為兩種細(xì)胞的分離頻率。

從等效電路的觀點(diǎn)來看，對(duì)于一個(gè)單細(xì)胞，細(xì)胞膜具有電容成分，可等價(jià)為電容器，細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核可等價(jià)為電阻。對(duì)于兩種類型的細(xì)胞，不同的運(yùn)動(dòng)最初來自細(xì)胞內(nèi)成分中的蛋白質(zhì)量。具有較小介電常數(shù)的組蛋白GFP型細(xì)胞在電場(chǎng)作用下表現(xiàn)出較低的極化效應(yīng)，產(chǎn)生不同的Re[CM（ω）]，并對(duì)應(yīng)不同方向的DEP力。

3.5?細(xì)胞分離應(yīng)用

利用以上分析結(jié)果，對(duì)多電極陣列微流控芯片5個(gè)橫截面的單側(cè)電極都采用D（1010）類型的電流施加方式，施加f=30 kHz的電流，對(duì)兩種細(xì)胞WT和GFP-HT進(jìn)行了分離實(shí)驗(yàn)。在傳統(tǒng)的微流體裝置中，流體動(dòng)力聚焦是通過多個(gè)泵和/或壓力源仔細(xì)控制流速實(shí)現(xiàn)的。本研究中的分離實(shí)驗(yàn)采用的微流控芯片有3個(gè)入口，采用位于兩邊的2個(gè)入口可以使細(xì)胞運(yùn)動(dòng)形成鞘流（Sheath flow），從而縮小了細(xì)胞懸浮液流動(dòng)的區(qū)域，使細(xì)胞懸浮液聚焦于一側(cè)電極界面附近，并大大減小了擴(kuò)散距離。

入口A通入蔗糖溶液，入口B通入WT與GFP-HT兩種細(xì)胞混合液。調(diào)整入口A和B的流量，可以調(diào)整細(xì)胞混合液的在微流道內(nèi)的濃度。通過檢測(cè)出口A和B中兩種細(xì)胞的濃度，可以得到細(xì)胞分離率。結(jié)果表明，增大入口A的入口流量，可以顯著提高分離率。當(dāng)入口A與B的流量比為12∶1時(shí)，細(xì)胞分離率可達(dá)到93.5% （表2）。當(dāng)細(xì)胞濃度過大時(shí)，細(xì)胞間的干涉強(qiáng)烈，不利于WT和GFP-HT兩種細(xì)胞的分離。

4?結(jié) 論

利用多電極陣列微流控芯片的特殊結(jié)構(gòu)，在不同頻率、多電極復(fù)雜電場(chǎng)下，研究了外部形態(tài)相同而內(nèi)部組蛋白成分不同的人肺部成纖維細(xì)胞MRC-5的運(yùn)動(dòng)特點(diǎn)。通過對(duì)一個(gè)橫截面的電極陣列進(jìn)行數(shù)值計(jì)算，可以發(fā)現(xiàn)，橫截面內(nèi)單側(cè)4個(gè)電極交替施加電流時(shí)，可以得到均勻的電場(chǎng)分布與最大的介電泳力。進(jìn)一步通過實(shí)驗(yàn)對(duì)MRC-5野生型（WT）與組蛋白-GFP型（GFP-HT）細(xì)胞進(jìn)行了介電泳力的頻譜分析，發(fā)現(xiàn)在多電極電場(chǎng)下兩種細(xì)胞的分離頻率為f=30 kHz。細(xì)胞分離實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，較小的細(xì)胞混合液可以得到較大的分離率， 即當(dāng)入口A與B的流量比為12∶1時(shí)，細(xì)胞的分離率可以達(dá)到93.5%。 本研究提出的多電極陣列微流控芯片分離細(xì)胞的方法為細(xì)胞的高流量分離提供了研究基礎(chǔ)。

References

1?Whitesides G M. Nature， 2006， 442（7101）： 368-373

2?LIN Dong-Guo， LIN Jin-Qiong， LI Pei-Wen， YANG Na， XU Bang-Lao， LIU Da-Yu. Chinese J. Anal. Chem.， ?2018， ?46（1）： 113-120

林冬果， 林錦瓊， 李佩文， 楊 娜， 徐邦牢， 劉大漁. 分析化學(xué)， 2018， ?46（1）： 113-120

3?Guo J H. Anal. Chem.， ?2016， 88（24）： 11986-11989

4?YANG Li-Jun， ZHU Li， LU Bao-Chun， ZHANG Wei-Yi， Chinese J. Anal. Chem.， ?2017， ?45（6）： 922-930

楊利軍， 朱 麗， 陸寶春， 章維一. 分析化學(xué)， ?2017， ?45（6）： 922-930

5?LIN Bing-Cheng. Laboratory on a Microfluidic Chip. Beijing： Science Press， ?2013： ?456-463

林炳承. 微納流控芯片實(shí)驗(yàn)室. ?北京： 科學(xué)出版社， 2013： ?456-463

6?Bonner W， Hulett H， Sweet R， Herzenberg L. Rev. Sci. Instrum.， ?1972， ?43（3）： 404-409

7?Zhang J， Yan S， Yuan D， Alici G， Nguyen N T， Warkiani M E， Li W. Lab Chip， ?2016， ?16（1）： 10-34

8?Shim S， Stemke-Hale K， Tsimberidou A M， Noshari J， Anderson T E， Gascoyne P R. Biomicrofluidics， ?2013， ?7（1）： 11807

9?Pethig R. Biomicrofluidics， ?2010， ?4（2）： 022811

10?Yan S， Zhang J， Chen H， Yuan D， Alici G， Du H， Zhu Y， Li W. Biomed. Microdevices， ?2016， ?18（4）： 1-9

11?HUANG Shuang， HE Yong-Qing， JIAO Feng. Chinese J. Anal. Chem.， ?2017， ?45（8）： 1238-1247

黃 爽， 何永清， 焦 鳳. 分析化學(xué)， ?2017， ?45（8）： 1238-1247

12?Alvarez N J， Jeppesen C， Yvind K， Mortensen N A， Hassager O. Lab Chip， ?2013， ?13（5）： 928-939

13?Xiang N， Zhang X， Dai Q， Cheng J， Chen K， Ni Z. Lab Chip， ?2016， ?16（14）： 2626-2635

14?Skotis G， Cumming D， Roberts J， Riehle M， Bernassau A. Lab Chip， ?2015， ?15（3）： 802-810

15?Gao J， Sin M L， Liu T， Gau V， Liao J C， Wong P K. Lab Chip， ?2011， ?11（10）： 1770-1775

16?Xiang N， Huang D， Cheng J， Chen K， Zhang X J， Tang W L， Ni Z H. Appl. Phys. Express， ?2016， ?9（2）： 027001

17?Gascoyne P R， Shim S. Cancers （Basel）， ?2014， ?6（1）： 545-579

18?Yao J， Kodera T， Obara H， Sugawara M， Takei M. Biomicrofluidics， ?2015， ?9（4）： 044129

19?Yao J， Obara H， Sapkota A， Takei M. Biomicrofluidics， ?2016， ?10（2）： 024105

20?Yao J， Sugawara M， Obara H， Mizutani T， Takei M. IEEE Trans. Biomed. Circuits Syst.， ?2017， ?11（6）： 1450-1458

21?Haeberle S， Zengerle R. Lab Chip， ?2007， ?7（9）： 1094-1110

22?Mizutani T， Takeda K， Haga H， Todo M， Kawabata K. Histochem. Cell Biol.， ?2014， ?141（5）： 473-481

23?Mahmood T， Yang P C. North Am. J. Med. Sci.， ?2012， ?4（9）： 429-434