油菜薹和蕾中硫代葡萄糖苷組分及含量分析

彭 君胡 陽龔 照林處發(fā)高長斌*汪愛華*

（1華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430070；2武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北武漢 430070；3長江大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖北荊州 434025；4荊州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北荊州 434000）

硫代葡萄糖苷（glucosinolate，簡稱硫苷）是廣泛存在于十字花科植物中的一類含硫的陰離子次生代謝產(chǎn)物（Brader et al.，2006），尤其在蕓薹屬植物中含量較高。迄今為止，約有120種硫苷被分離鑒定，但僅20種左右能在十字花科植物中檢測到（Kirkegaard & Sarwar，1998）。所有的硫苷都由1個含糖基團、硫酸鹽基團和可變的非糖側(cè)鏈（R）組成。根據(jù)側(cè)鏈R基團的不同，可以將硫苷分為脂肪族、芳香族和吲哚族3類（Mithen，2001）。有研究報道在油菜籽中檢測到6種硫苷成分，包含5種脂肪族硫苷和1種吲哚族硫苷，其中脂肪族的2-羥基-3-丁烯基硫苷（PRO）含量最高（彭愛娟 等，2000）。而在甘藍(lán)中4-甲基亞磺酰丁基硫苷的含量最高，其是公認(rèn)的抗癌蔬菜紫甘藍(lán)和青花菜的主要抗癌活性成分（Schlaich，2007）。

十字花科蔬菜富含黑芥子酶（myrosinase，EC3.2.3.1），當(dāng)植物組織受到機械損傷或者昆蟲侵害時，硫苷與芥子酶相遇而發(fā)生水解反應(yīng)，生成異硫氰酸鹽（isothiocyanates）、硫氰酸酯（thiocyanates）和腈類（nitriles）等降解產(chǎn)物（汪俏梅和曹家樹，2001）。硫苷與這些降解產(chǎn)物具有多種生物學(xué)功能，如參與植物防衛(wèi)反應(yīng)、刺激昆蟲取食、預(yù)防癌癥發(fā)生、賦予植物特殊風(fēng)味等（陳亞洲和閻秀峰，2007；申樹芳 等，2009），其中4-甲基亞磺酰丁基硫苷（glucoraphanin，RAA）的降解產(chǎn)物蘿卜硫素（sulforaphane，SF）的抗癌作用已在青花菜中證實，可有效降低多種癌癥的發(fā)病率（Lin et al.，1998；Ambrosone et al.，2004；Sarikamis et al.，2006）。甲基硫代烷基硫苷的水解產(chǎn)物是十字花科植物具有獨特風(fēng)味的主要物質(zhì)（程坤 等，2010）。而2-羥基-3-丁烯基硫苷卻對人體有害，其降解產(chǎn)物惡唑烷-2-硫酮會引起家畜甲狀腺腫大（Fenwick et al.，1983；Pearson et al.，1983）。

油菜（Brassica napus）是重要的油料作物，亦是近幾年新興的一種薹用蔬菜。油菜薹具有產(chǎn)量高、經(jīng)濟效益好、風(fēng)味獨特等優(yōu)點，深受菜農(nóng)和市民的歡迎。本試驗通過對30個油菜品種薹和蕾中硫苷組分及含量的測定，分析不同硫苷水平下各組分及含量的變化，探明油菜薹、蕾中硫苷的主導(dǎo)成分及含量差異，進一步探討降低油菜薹中有害硫苷組分含量、提高有益硫苷組分含量的可能途徑，以期為選育高品質(zhì)的薹用油菜品種提供理論依據(jù)。同時，開展油菜中硫苷性狀研究還將有助于了解硫苷的合成代謝，有助于運用基因工程技術(shù)進一步培育安全、風(fēng)味好、具有保健作用的薹用油菜新品種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選取來源于世界各地的30個油菜品種，其中中國10個、英國2個、日本1個、新西蘭1個、澳大利亞4個、德國3個、芬蘭2個、俄羅斯1個、波蘭1個、法國2個、荷蘭1個、瑞典2個，品種名稱及抽薹特性見表1。30個油菜品種均種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所（武漢）試驗基地，2018年3月在油菜花蕾期分別對蕾和薹進行取樣、編號，每個編號3次重復(fù)，液氮迅速冷凍，真空冷凍干燥后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 參試30個油菜品種名稱、來源及抽薹特性

1.2 硫苷的提取及UPLC分析

硫苷的提取參考國標(biāo)油菜籽中硫代葡萄糖苷的測定方法（NY/T 1582—2007）。準(zhǔn)確稱取0.2 g冷凍干燥樣品于5 mL A離心管中，加入2 mL 70%沸甲醇后，立即加入200 μL 5 mmol·L-1內(nèi)標(biāo)溶液（苯甲基硫苷），75 ℃恒溫水浴10 min，每隔2 min旋渦混勻1次，取出離心管冷卻至室溫，5 000 r·min-1離心3 min，轉(zhuǎn)移上清液至B離心管中；向A離心管中再加入2 mL 70%沸甲醇，旋渦混勻，75 ℃恒溫水浴10 min，每隔2 min旋渦混勻1次，取出離心管冷卻至室溫，5 000 r·min-1離心3 min，轉(zhuǎn)移上清液至B離心管中；用水調(diào)節(jié)B離心管中的提取液至5 mL，取1 mL經(jīng)DEAE離子交換微柱，然后用1 mL 0.02 mol·L-1醋酸鈉溶液沖洗離子交換微柱2次，每次加入后均讓液體排干；加入200 μL硫酸酯酶溶液至離子交換微柱封口，35 ℃條件下反應(yīng)16 h，次日用1 mL水沖洗離子交換微柱2次，洗脫液收集于5 mL試管中，用水將洗脫液定容至5 mL，混勻后用0.45 μm的微孔濾膜過濾后用于超高效液相色譜（UPLC）分析（李培武 等，2005）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。檢測樣品峰值重疊的硫苷組分含量視為0 μmol·g-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜薹和蕾中硫苷組分及含量分析

由圖1可見，參試30個油菜品種總硫苷含量的變異范圍較大，在21.67～119.29 μmol·g-1之間，均值為65.32 μmol·g-1，標(biāo)準(zhǔn)差為6.65，變異系數(shù)為0.10%。其中，HJa82799的總硫苷含量最高，利戈勒-1的總硫苷含量最低。

從30個油菜品種中共檢測到7種硫苷組分（表2），薹與蕾中具有相似的硫苷組分；其中脂肪族硫苷4-戊烯基硫苷和2-羥基-3-丁烯基硫苷含量較高，兩者在薹和蕾中的含量分別占總硫苷含量的46.24%、28.52%和45.19%、29.13%；4-羥基-3-吲哚甲基硫苷的含量最低，在薹和蕾中的含量占比分別為0.41%、0.44%；4-戊烯基硫苷和3-丁烯基硫苷的標(biāo)準(zhǔn)差較大，表明其在不同油菜品種間的含量差異明顯；2-羥基-3-丁烯基硫苷的變異系數(shù)最小，表明其在不同品種間較穩(wěn)定。

由圖2可見，油菜薹與蕾之間的硫苷含量差異明顯，30個油菜品種薹中硫苷含量為10.66～60.54 μmol·g-1， 蕾 中 為 8.92～61.28 μmol·g-1； 其 中Lesira、LEDOS、HJa82470的差值較大，分別為24.55、27.61、25.22 μmol·g-1。大多數(shù)油菜品種蕾中的硫苷含量高于薹，蕾中硫苷含量的均值為37.26 μmol·g-1，薹中為 28.06 μmol·g-1。

圖1 油菜總硫苷含量

表2 油菜薹和蕾中硫苷組分、含量均值及變異系數(shù)

2.2 不同硫苷水平下油菜薹和蕾中的硫苷組分及含量分析

進一步根據(jù)總硫苷含量的高低將參試油菜品種分為3類（李培武 等，2005）：低硫苷含量（＜45 μmol·g-1）的油菜品種有8個，占比為26.7%；高硫苷含量（＞100 μmol·g-1）的油菜品種有3個，占比為10.0%；中硫苷含量（45～100 μmol·g-1）的油菜品種有19個，占比為63.3%。

由表3可知，總硫苷含量低于45 μmol·g-1的8個油菜品種薹和蕾中的硫苷含量均值分別為14.44、16.37 μmol·g-1，脂肪族硫苷含量均值為26.94 μmol·g-1。其中，4-戊烯基硫苷和 2-羥基 -3-丁烯基硫苷的含量較高，兩者在薹和蕾中的含量分別占總硫苷含量的34.89%、30.29%和35.71%、30.81%；4-羥基-3-吲哚甲基硫苷的含量較低，在薹和蕾中的含量分別占總硫苷含量的0.68%和1.02%；4-戊烯基硫苷的標(biāo)準(zhǔn)差在薹和蕾中均為最大，表明其在不同油菜品種中的含量差異明顯；2-羥基-3-丁烯基硫苷在蕾中的變異系數(shù)最小，表明其在低硫苷含量油菜品種中穩(wěn)定存在。

圖2 油菜薹和蕾中的硫苷含量

由表4可知，總硫苷含量高于100 μmol·g-1的3個油菜品種的薹和蕾中的硫苷含量均值分別為53.22、60.08 μmol·g-1，脂肪族硫苷含量均值為106.67 μmol·g-1。其中，4-戊烯基硫苷和2-羥基-3-丁烯基硫苷的含量較高，兩者在薹和蕾中的含量分別占總硫苷含量的49.88%、23.53%和42.62%、28.75%；4-戊烯基硫苷和3-丁烯基硫苷的標(biāo)準(zhǔn)差在薹中較大，說明這2個組分是高硫苷含量油菜品種間引起薹硫苷含量差異的主要成分，而引起蕾硫苷含量差異的主要成分則為4-戊烯基硫苷和2-羥基-3-丁烯基硫苷。與低硫苷含量油菜品種相比，4-戊烯基硫苷含量在高硫苷含量油菜品種薹和蕾中的占比分別增加了14.99和6.91個百分點，說明其是引起油菜品種硫苷含量增加的主要成分。

表3 低硫苷含量的油菜品種薹和蕾中硫苷組分及含量

表4 高硫苷含量的油菜品種薹和蕾中硫苷組分及含量

由表5可知，總硫苷含量介于45～100 μmol·g-1之間的19個油菜品種薹和蕾中的硫苷含量均值分別為30.05、42.61 μmol·g-1，脂肪族硫苷含量均值為67.94 μmol·g-1。其中，4-戊烯基硫苷和2-羥基-3-丁烯基硫苷的含量較高，兩者在薹和蕾中的含量分別占總硫苷含量的47.06%、29.23%和47.13%、28.84%；4-戊烯基硫苷的標(biāo)準(zhǔn)差最大，是引起中硫苷含量油菜品種間硫苷含量差異的主要成分。與低硫苷含量油菜品種相比，4-戊烯基硫苷含量在中硫苷含量油菜品種薹和蕾中的占比分別增加了12.17和11.42個百分比。

表5 中硫苷含量的油菜品種薹和蕾中硫苷組分及含量

3 結(jié)論與討論

本試驗根據(jù)總硫苷含量的高低將30個油菜品種分為高硫苷含量、中硫苷含量和低硫苷含量3組，并把每組樣品分為薹和蕾2組類別，對不同硫苷含量水平的油菜品種薹和蕾中硫苷組分及含量進行分析。結(jié)果表明：30個油菜品種的總硫苷含量變化范圍為 21.67～119.29 μmol·g-1，均值為 65.32 μmol·g-1，標(biāo)準(zhǔn)差為6.65，變異系數(shù)為0.10%?？傮w來說，蕾中的硫苷含量比薹高，薹中硫苷含量為10.66～60.54 μmol·g-1，均值為 28.06 μmol·g-1；蕾中硫苷含量為 8.62～61.28 μmol·g-1，均值為37.26 μmol·g-1。已有研究表明，硫苷主要在營養(yǎng)組織中合成（Latiek et al.，2011），本試驗亦發(fā)現(xiàn)油菜薹中硫苷含量標(biāo)準(zhǔn)差較大。

本試驗結(jié)果表明，脂肪族硫苷含量在高硫苷含量油菜品種中的均值為106.67 μmol·g-1，是中硫苷含量油菜品種均值的1.57倍，是低硫苷含量油菜品種均值的3.96倍。其中，4-戊烯基硫苷和2-羥基-3-丁烯基硫苷是油菜硫苷組分中的主要成分，且二者在高、中硫苷含量油菜品種中的含量均值與低硫苷含量油菜品種相比差值較大，分別是低硫苷含量油菜品種的3.96倍和2.52倍。2-羥基-3-丁烯基硫苷的含量在不同油菜品種中均較高，但其在高、中硫苷含量油菜品種中的占比卻低于低硫苷含量油菜品種；而4-戊烯基硫苷在高、中硫苷含量油菜品種中的占比與低硫苷含量油菜品種相比分別在薹和蕾中增加了14.99、12.17個百分點和6.91、11.42個百分點，說明4-戊烯基硫苷是引起油菜硫苷含量增加的主要成分。

本試驗中，脂肪族的4-戊烯基硫苷和2-羥基-3-丁烯基硫苷是油菜中含量較高的硫苷組分，兩者累加占總硫苷含量的74.51%。其中2-羥基-3-丁烯基硫苷在油菜薹和蕾中的含量均值分別為 8.00、10.85 μmol·g-1，占比分別為 28.52% 和29.13%。在參試的大部分油菜品種中，2-羥基-3-丁烯基硫苷的含量均較高，因此現(xiàn)階段選用雙低（低芥酸、低硫苷）油菜來作為薹用蔬菜的開發(fā)是較好的選擇。不同類型蔬菜中硫苷的主要成分不同（李培武 等，2002；陳新娟 等，2006），芥藍(lán)（Brassica alboglabra Bailey）葉片和花薹中硫苷的組分亦不同（李鋒 等，2006）。但油菜薹和蕾中含有相似的硫苷組分，4-戊烯基硫苷、2-羥基-3-丁烯基硫苷和3-丁烯基硫苷的含量較高，且標(biāo)準(zhǔn)差大，表明不同油菜品種間硫苷含量差異明顯，具有較大的遺傳改良潛力。對擬南芥硫苷的研究結(jié)果表明，在生物體內(nèi)硫苷由不同的R基團控制合成，可通過調(diào)控硫苷的R基團來改變特定硫苷的含量（Halkier & Du，1997）。本試驗以期在提高總硫苷含量的基礎(chǔ)上，降低易引起人體甲狀腺腫大的2-羥基-3-丁烯基硫苷含量，提高具有抗癌作用的4-甲亞砜丁基硫苷含量，為培育品質(zhì)優(yōu)良的薹用油菜新品種提供理論基礎(chǔ)。

近年來，硫苷的含量在油菜籽中研究較多，在油菜薹中的研究較少。硫苷合成于營養(yǎng)器官，通過葉片、莖稈運輸?shù)椒N子中，種子中硫苷易積累（李施蒙，2016），硫苷含量的變化也較大，最高達到143.09 μmol·g-1（顧思凱，2017）。在油菜籽高硫苷、中硫苷含量品種中主要組分是脂肪族的2-羥基-3-丁烯基硫苷和3-丁烯基硫苷（李培武 等，2005），與本試驗中油菜薹中硫苷的主要組分不一致。油菜薹與油菜籽相同的主要成分為2-羥基-3-丁烯基硫苷。在油菜籽中，對脂肪酸的研究得到突破，降低芥酸含量是油菜長期育種目標(biāo)（劉后利，2000；傅廷棟，2004）。隨著“雙低”（低硫苷、低芥酸）油菜大面積推廣，傳統(tǒng)育種方法無法選育抗病抗蟲品種，近年來甘藍(lán)型油菜的代謝途徑以及育種研究成為熱點。由于油菜基因組的復(fù)雜性，絕大多數(shù)硫苷的合成和調(diào)控基因具有多個拷貝，硫苷合成代謝途徑及調(diào)控機制仍了解的不夠深入（姚琳 等，2018）。有研究表明，硫苷含量變化主要受基因型控制，硫苷含量難以降低是由于低硫苷等位基因可能和其他基因的互作而促進硫苷的正向合成，低硫苷基因的挖掘是培育低硫苷品種的有效途徑（陳洪成 等，2014）。隨著人民生活水平的不斷提高和油菜育種工作的深入發(fā)展，油菜薹品質(zhì)改良已成為重要的育種目標(biāo)。油菜薹中硫苷的組分和含量影響其營養(yǎng)及風(fēng)味，加強油菜薹品質(zhì)性狀的研究可以拓寬油菜的利用價值，提高油菜的種植效益，增加農(nóng)民的收益，豐富市民的菜籃子。同時，開展油菜薹中硫苷性狀的研究還將有助于了解硫苷的合成代謝，以及運用基因工程技術(shù)進一步培育安全、風(fēng)味好、具有保健作用的油菜薹品種。本試驗首次將油菜薹作為一種新型蔬菜，測定其硫苷組分及含量，可通過遠(yuǎn)緣雜交或轉(zhuǎn)基因育種等方法提高4-甲亞砜丁基硫苷含量、降低2-羥基-3-丁烯基硫苷含量來進一步提高其營養(yǎng)品質(zhì)。油菜薹中硫苷含量標(biāo)準(zhǔn)差大，為低硫苷的基因定位以及基因型鑒定提供理論基礎(chǔ)。將油菜薹分為薹組織、蕾組織兩類，且2-羥基-3-丁烯基硫苷和3-丁烯基硫苷配合力較低的親本組合有利于培育低硫苷品種（張敏 等，2015），因此培育出營養(yǎng)組織的有利硫苷組分含量高而種子中有害硫苷組分含量低的油蔬兩用油菜品種是可行的。