大氣細顆粒物對膠原結構樣巨噬細胞受體基因敲除小鼠呼吸和循環(huán)系統(tǒng)的影響

范 威，王 貴，安 珍，張艷格，姜 靜，姚三巧，吳衛(wèi)東

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院公共衛(wèi)生學院，河南 新鄉(xiāng) 453000)

大氣細顆粒物(fine particulate matter,PM2.5)粒徑小，在大氣中滯留時間長，可隨呼吸進入人體，直達肺泡甚至穿過氣血屏障進入血液循環(huán)系統(tǒng)。研究表明，PM2.5可引起急性呼吸道和心血管系統(tǒng)炎癥[1-2]。肺泡巨噬細胞作為呼吸系統(tǒng)重要的免疫防御細胞，能夠通過識別、吞噬作用清除進入體內(nèi)的PM2.5，從而發(fā)揮保護機體的作用。然而，暴露于PM2.5也可能引起巨噬細胞發(fā)生一系列生理、生物化學改變，如氧化應激和肺組織炎癥反應，繼而引發(fā)全身性炎癥反應[3]。膠原結構樣巨噬細胞受體(macrophage receptor with collagenous structure,MARCO)是A類清道夫受體家族的一種亞型，主要存在于肺泡巨噬細胞表面，是重要的識別、結合顆粒物的受體[4-5]。PM2.5進入呼吸道后，肺泡巨噬細胞通過表面受體識別并吞噬顆粒物形成塵細胞，由呼吸道上皮細胞分泌的黏液包裹形成痰液，通過纖毛的擺動作用排出體外[6-7]。在此過程中，肺泡巨噬細胞可以釋放以炎性因子為主的大量生物活性物質，包括白細胞介素(interleukin,IL)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等。這些炎性因子不僅與呼吸系統(tǒng)受損傷程度直接相關，還參與了肺組織內(nèi)的免疫反應過程，調(diào)節(jié)肺內(nèi)其他免疫細胞的活性，同時，這些炎性因子還可能進入血液循環(huán)系統(tǒng)而影響全身[8-9]。未被肺泡巨噬細胞清除的PM2.5會直接刺激肺上皮細胞發(fā)生免疫反應，引起表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)磷酸化表達增加[10]。研究發(fā)現(xiàn)，MARCO參與肺泡巨噬細胞對矽塵的識別和吞噬過程，并在肺部炎癥發(fā)生中發(fā)揮重要作用[11-12]。目前，PM2.5誘發(fā)急性呼吸和循環(huán)系統(tǒng)炎癥的機制尚未闡明，探討清道夫受體MARCO是否參與PM2.5致急性呼吸及循環(huán)系統(tǒng)炎癥的過程具有重要意義，本研究旨在為采取有效措施預防PM2.5的健康危害提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物12周齡野生型C57BL/6小鼠和MARCO-/-型C57BL/6小鼠各12只，雌雄不拘，體質量18～30 g，均由新鄉(xiāng)醫(yī)學院免疫模式動物實驗室梁銀明教授饋贈。12只野生型C57BL/6小鼠隨機分為野生型生理鹽水組和野生型PM2.5組，12只MARCO-/-型C57BL/6小鼠隨機分為MARCO-/-型生理鹽水組和MARCO-/-型PM2.5組，每組6只；分籠飼養(yǎng)，12 h/12 h晝夜交替，溫度控制在23～26 ℃，相對濕度控制在40%～70%，自由進食、飲水，適應性喂養(yǎng)1周。

1.2主要試劑與儀器C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)、TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒(武漢華美生物工程有限公司)，乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，EGFR抗體(丹麥DAKO公司)，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)(北京索萊寶科技有限公司)，烏拉坦(中國醫(yī)藥集團有限公司)；Tisch Environmental TE-6070 PM2.5大流量采樣器(美國Tisch公司)，Christ真空冷凍干燥機(德國Christ公司)，超聲波清洗機(鄭州生元儀器有限公司)，ICP/MS離子色譜聯(lián)用系統(tǒng)(德國Thermo公司)，OHAUS電子天平[奧豪斯儀器(常州)有限公司]，微量移液器、低速臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，JW-1042R 低速冷凍離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司)，斡旋儀(海門其林貝爾儀器制造有限公司)，超純水器(北京普析通用儀器有限責任公司)，雙功能氣浴恒溫振蕩器(金壇市杰瑞爾電器有限公司)，Enspire多標志微孔板檢測儀(美國 Perkin Elmer公司)。

1.3PM2.5混懸液的制備2017年11月至2018年1月，采用美國Tisch Environmental TE-6070 PM2.5大流量采樣器收集PM2.5，采集地點周圍無建筑物遮擋，為非工業(yè)區(qū)。采樣膜為玻璃纖維濾膜，采樣結束后用錫箔紙包裹濾膜避免污染，4 ℃冰箱保存。使用前將濾膜裁剪成2 cm×3 cm方片浸入超純水，超聲震蕩20 min，共3次，洗脫液經(jīng)真空冷凍干燥后收集PM2.5粉末，-20 ℃保存。使用時用生理鹽水配成相應濃度的PM2.5混懸液，超聲振蕩混勻備用。

1.4各組小鼠處理方式采用吸入式氣管滴注法染毒各組小鼠[13]：將小鼠放入乙醚麻醉缸內(nèi)，迅速封住缸口，小鼠倒下不動、呼吸深慢視為麻醉成功，然后將小鼠上門齒懸掛于支架上，用鑷子將其舌頭拉出體外；將移液槍緩慢垂直插入小鼠口中至有輕微抵觸感，野生型PM2.5組和MARCO-/-型PM2.5組小鼠按4 mg·kg-1[14]的劑量氣管內(nèi)注入2 g·L-1PM2.5混懸液，野生型生理鹽水組和MARCO-/-型生理鹽水組小鼠給予等體積無菌生理鹽水，捏住鼻腔10 s，取下小鼠，平放于手心輕輕搖晃，聽到明顯肺部濕啰音提示滴注成功，隔日1次，共6次。

1.5各組小鼠血清中TNF-α、CRP、LDH及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF)中IL-6、TNF-α、LDH水平檢測各組小鼠末次氣管滴注24 h后，按1.2 mg·kg-1的劑量腹腔注射200 g·L-1的烏拉坦溶液進行麻醉，固定小鼠，經(jīng)腹主動脈取血，于4 ℃靜置30 min，3 000 r·min-1離心20 min,收集血清；取血完成后，結扎右側肺葉，將0.5 mL生理鹽水緩慢灌入左肺內(nèi)，1 min后將生理鹽水回收，連續(xù)進行3次，收集BALF，4 ℃ 1 500 r·min-1離心20 min，收集上清液。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清中TNF-α、CRP水平及BALF中IL-6、TNF-α水平，采用微板法測定血清及BALF中LDH水平，操作嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6免疫組織化學法檢測小鼠肺組織中磷酸化EGFR表達取各組小鼠未經(jīng)灌洗的右肺，用生理鹽水沖洗干凈，取適量右下肺組織浸入體積分數(shù)4%中性甲醛中，固定24 h，石蠟包埋，切片。石蠟切片脫蠟至水，檸檬酸抗原修復緩沖液進行抗原修復，PBS洗滌3次，每次5 min；體積分數(shù)3%過氧化氫溶液洗滌3次，每次5 min；體積分數(shù)3%牛血清白蛋白室溫封閉30 min；滴加一抗，4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min；滴加二抗，室溫孵育50 min；PBS洗滌3次，每次5 min；二氨基聯(lián)苯胺 (diaminobenzidine，DAB)顯色數(shù)分鐘，自來水沖洗終止顯色；蘇木精復染3 min，自來水沖洗，體積分數(shù)1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒，自來水沖洗，氨水返藍，流水沖洗；切片脫水透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。蘇木精將細胞核染為藍色，肺組織中磷酸化EGFR經(jīng)DAB染色后陽性表達為棕黃色。

2 結果

2.14組小鼠BALF中IL-6、TNF-α及LDH水平比較結果見表1。野生型生理鹽水組與MARCO-/-型生理鹽水組小鼠BALF中IL-6、TNF-α、LDH水平比較差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.230、-0.964、1.263，P>0.05)。野生型PM2.5組小鼠BALF中IL-6、TNF-α和LDH水平與野生型生理鹽水組比較有所上升，但差異無統(tǒng)計學意義 (t=-0.583、-2.130、-1.016，P>0.05)。MARCO-/-型PM2.5組小鼠BALF中IL-6、TNF-α和LDH水平顯著高于MARCO-/-型生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(t= 2.469、3.364、3.000，P<0.05)。MARCO-/-型PM2.5組小鼠BALF中IL-6、TNF-α和LDH水平與野生型PM2.5組小鼠比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.723、1.114、-0.324，P>0.05)。

表14組小鼠BALF中IL-6、TNF-α及LDH水平比較

組別nIL-6/(ng·L-1)TNF-α/(ng·L-1)LDH/(U·L-1)野生型生理鹽水組 63.256±2.1091 014.936±268.51938.551±31.658野生型PM2.5組64.367±3.3581 661.281±557.16467.826±48.182MARCO-/-型生理鹽水組63.524±1.5971 137.548±137.34415.768±9.512MARCO-/-型PM2.5組67.984±4.953a2 051.062±650.919a58.667±36.916a

注：與MARCO-/-型生理鹽水組小鼠比較aP<0.05。

2.24組小鼠血清CRP、TNF-α、LDH水平比較結果見表2。野生型生理鹽水組與MARCO-/-型生理鹽水組小鼠血清CRP、TNF-α和LDH水平比較差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.944、-1.908、-0.392，P>0.05)。野生型PM2.5組小鼠血清CRP、TNF-α和LDH水平均較野生型生理鹽水組升高，但差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.890、-1.649、-0.885，P>0.05)。MARCO-/-型PM2.5組小鼠血清CRP、LDH水平顯著高于MARCO-/-型生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學意義(t= 2.530、4.605，P<0.05)；MARCO-/-型PM2.5組與MARCO-/-型生理鹽水組小鼠血清TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.911，P>0.05)。MARCO-/-型PM2.5組與野生型PM2.5組小鼠血清中CRP和TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.643、1.311，P>0.05)。MARCO-/-型PM2.5處組小鼠血清LDH水平顯著高于野生型PM2.5組，差異有統(tǒng)計學意義(t=2.378，P<0.05)。

表24組小鼠血清CRP、TNF-α、LDH水平比較

組別nCRP/(μg·L-1)TNF-α/(ng·L-1)LDH/(U ·L-1)野生型生理鹽水組6649.362±554.2001 100.695±102.1791 695.906±258.239野生型PM2.5組61 061.124±752.8321 278.316±204.7171 956.725±536.525MARCO-/-型生理鹽水組6914.277±343.4631 214.364±85.7771 751.462±192.495MARCO-/-型PM2.5組61 664.401±639.806a1 499.927±376.2532 677.193±413.748ab

注：與MARCO-/-型生理鹽水組小鼠比較aP<0.05；與野生型PM2.5組比較bP<0.05。

2.34組小鼠肺組織中磷酸化EGFR的表達結果見圖1。野生型與MARCO-/-型生理鹽水組小鼠肺組織中均未見磷酸化EGFR表達，而野生型和MARCO-/-型PM2.5組小鼠肺組織中均可見磷酸化EGFR表達，且MARCO-/-型PM2.5組小鼠磷酸化EGFR水平高于野生型PM2.5組。

A：野生型生理鹽水組；B：MARCO-/-型生理鹽水組；C：野生型PM2.5組；D：MARCO-/-型PM2.5組。

圖14組小鼠肺組織中磷酸化EGFR表達情況(免疫組織化學染色，×400)

Fig.1ExpressionofphosphorylatedEGFRinlungtissuesofmiceinthefourgroups(immunohistochemistry,×400)

3 討論

空氣污染尤其是PM2.5對人體健康的危害已受到普遍關注。PM2.5被認為是大氣中的首要污染物，可通過呼吸進入人體而引起多種呼吸系統(tǒng)疾病，也可穿過肺間質進入血液中，從而對心血管系統(tǒng)造成危害[15-16]。流行病學調(diào)查表明，PM2.5與呼吸、循環(huán)系統(tǒng)疾病的發(fā)病率和病死率密切相關[17-18]，急性炎癥是PM2.5引起呼吸、循環(huán)系統(tǒng)損傷的重要機制之一[19]。有研究認為，機體受到PM2.5刺激后，炎癥細胞聚集及炎癥因子和黏附因子的分泌是由大氣顆粒物刺激肺泡巨噬細胞，使其釋放部分細胞因子和前炎癥因子所引起[20-21]。而肺泡巨噬細胞作為肺的第1道防線，在機體免疫防御、清除肺部大氣顆粒物的過程中不可或缺[22]。JALAVA等[23]研究表明，PM2.5可以導致小鼠巨噬細胞活力下降，而TNF-α的表達隨顆粒物濃度的增加而升高。有研究證明，顆粒物可導致大鼠巨噬細胞活力降低、吞噬功能下降[24-25]。以上研究均表明，PM2.5刺激對巨噬細胞活性及功能有著潛在的影響。

本研究應用敲除MARCO基因的小鼠來探討巨噬細胞表面顆粒物識別受體MARCO在PM2.5急性暴露過程中的作用，發(fā)現(xiàn)MARCO-/-小鼠對PM2.5急性暴露較野生型小鼠更加易感。IL-6、TNF-α在炎癥反應中起著重要作用，作為炎癥反應早期釋放的促炎性因子，其不僅可以直接反映炎癥損傷程度，還可以間接誘導多種細胞因子參與并加重機體炎癥[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，野生型生理鹽水組與MARCO-/-型生理鹽水組小鼠BALF中IL-6、TNF-α水平比較差異無統(tǒng)計學意義；野生型PM2.5組小鼠BALF中IL-6、TNF-α水平與野生型生理鹽水組比較有所上升，但差異無統(tǒng)計學意義；而MARCO-/-型PM2.5組小鼠BALF中IL-6、TNF-α水平顯著高于MARCO-/-型生理鹽水組。結果提示，PM2.5急性暴露可引起MARCO-/-型小鼠呼吸系統(tǒng)炎性損傷。

LDH是反映毒物毒性效應的早期檢測指標，也是細胞受損的重要標志物之一[27]。本研究結果顯示，MARCO-/-型生理鹽水組與野生型生理鹽水組小鼠BALF及血清LDH水平比較差異均無統(tǒng)計學意義；在同等劑量PM2.5暴露后，野生型PM2.5組與野生型生理鹽水組小鼠BALF及血清LDH水平比較差異無統(tǒng)計學意義，而MARCO-/-型PM2.5組小鼠BALF及血清LDH水平顯著高于MARCO-/-型生理鹽水組，且MARCO-/-型PM2.5組小鼠血清LDH水平顯著高于野生型PM2.5組。該結果提示，PM2.5急性暴露對MARCO-/-型小鼠呼吸系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)的損傷效應較野生型小鼠明顯。

CRP是機體受到感染、炎癥損傷及創(chuàng)傷后分泌的一種急性時相反應蛋白，是反映機體炎癥狀況的重要指標[28]。一項關于PM2.5暴露對人體心血管系統(tǒng)損傷的隊列研究發(fā)現(xiàn)，暴露于PM2.5后導致血清CRP水平顯著升高[29]。本研究結果顯示，野生型生理鹽水組與MARCO-/-型生理鹽水組小鼠血清CRP水平比較差異無統(tǒng)計學意義；PM2.5急性暴露后，野生型PM2.5組小鼠血清CRP水平較野生型生理鹽水組有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義；MARCO-/-型PM2.5組與野生型PM2.5組小鼠血清CRP水平比較差異無統(tǒng)計學意義；而MARCO-/-型PM2.5組小鼠血清CRP水平較MARCO-/-型生理鹽水組小鼠顯著升高，提示PM2.5急性暴露可以引起MARCO-/-型小鼠產(chǎn)生心血管系統(tǒng)炎癥反應。

EGFR作為一種具有內(nèi)在酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白，參與炎癥發(fā)生中多條信號通路調(diào)控作用[30]。研究證實，EGFR信號通路參與大氣顆粒物介導的呼吸系統(tǒng)炎癥的發(fā)生[31-32]，PM2.5暴露可直接或間接激活EGFR信號傳導通路，使EGFR磷酸化，因此，磷酸化EGFR表達水平升高可以作為氣管上皮細胞損傷的標志[15]。為進一步探討MARCO在PM2.5致呼吸系統(tǒng)急性炎癥中的作用機制，本研究檢測了肺組織中EGFR磷酸化水平，結果發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)PM2.5暴露的野生型與MARCO-/-型小鼠肺組織中均未見磷酸化EGFR表達，而PM2.5急性暴露后野生型與MARCO-/-型小鼠肺組織中均檢測到磷酸化EGFR表達，且MARCO-/-型小鼠較野生型小鼠肺組織中磷酸化EGFR表達更明顯。本研究結果提示，MARCO可能參與PM2.5誘導的肺組織EGFR磷酸化，進而引起呼吸系統(tǒng)炎癥，這一結果也進一步支持了MARCO-/-型小鼠對PM2.5急性暴露更加易感。

綜上所述，在受試劑量范圍內(nèi)，PM2.5急性暴露導致的MARCO-/-小鼠呼吸及循環(huán)系統(tǒng)炎性效應較野生型小鼠嚴重，MARCO可能在PM2.5導致的小鼠急性呼吸及循環(huán)系統(tǒng)炎癥中發(fā)揮重要作用，更加深入的機制有待后續(xù)研究。