HBV相關(guān)肝纖維化中Klotho蛋白的表達(dá)及臨床意義*

聶 芳，黃 蝶，黃琪蕓，許 穎Δ

1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科 (成都 610500)；2.成都醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院(成都 610500)

肝纖維化是乙型肝炎病毒(HBV)引起的慢性乙肝發(fā)展成肝硬化的中間過程，是多種肝病所共有的組織學(xué)改變，炎癥是慢性肝病的基本病變，所有肝臟損傷修復(fù)都必然經(jīng)歷炎癥、肝纖維化這一過程。肝纖維化是由各種致病因素所致的肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM) 包括膠原、非膠原糖蛋白、蛋白多糖過度沉積的病理過程，是一系列損傷因子作用后引起的一種可逆性性損傷后修復(fù)的過程[1]。肝纖維化以及肝硬化早期在通過適當(dāng)?shù)呐R床干預(yù)后其實(shí)能夠逆轉(zhuǎn)，早期發(fā)現(xiàn)確診并進(jìn)行有效的治療以阻斷肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展，使其降解、逆轉(zhuǎn)，對(duì)預(yù)防肝硬化具有重要意義。

Klotho是新近發(fā)現(xiàn)的一種抗衰老基因，其表達(dá)產(chǎn)物分為膜結(jié)合型和分泌型兩種蛋白。在許多抗衰老研究中也已經(jīng)證實(shí)分泌型Klotho蛋白還能夠抑制細(xì)胞和組織的氧化應(yīng)激，抑制凋亡。Klotho抑制了CsA誘發(fā)的EMT和腎纖維化，發(fā)現(xiàn)CsA可以降低Klotho表達(dá)，促進(jìn)腎的纖維化，并激活EMT反應(yīng)，表現(xiàn)為TGF-β1的增加和α-SMA的表達(dá)，E-cadherin表達(dá)的減少；Klotho能通過調(diào)節(jié)腎臟內(nèi)EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，明顯改善腎臟的病理病變[2]。然而，目前關(guān)于Klotho基因與肝纖維化的相關(guān)作用機(jī)制和臨床應(yīng)用幾乎處于空白。本實(shí)驗(yàn)從人體血清學(xué)水平研究分泌型Klotho在HBV導(dǎo)致肝臟纖維化中的表達(dá)及臨床意義，闡述Klotho表達(dá)水平與乙型肝炎病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

分別收集2017年2月至2018年2月成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院健康體檢、收治入院或門診就診的符合條件的5組入選人群共319例，其中正常組77例、慢性乙型肝炎組(分為輕、中、重度3組，分別為59例、51例、64例)、肝硬化組68例。所有入選者統(tǒng)一入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡在30～88歲，性別不限，排除合并糖尿病、高血壓、肝癌、甲狀腺疾病、心血管疾病、除HBV外其他病毒感染引起的急慢性肝炎，以及其他原因?qū)е碌母斡不?自身免疫性肝炎、酒精性肝硬化、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、遺傳代謝性或藥物性肝炎)等。其中健康體檢者作為正常組，除統(tǒng)一入選標(biāo)準(zhǔn)外，既往均無乙型肝炎病史或新近發(fā)現(xiàn)乙型肝炎；輕度乙肝組入選標(biāo)準(zhǔn)：既往有乙型肝炎病史或新近發(fā)現(xiàn)乙型肝炎，6個(gè)月內(nèi)未經(jīng)抗病毒治療，HBV DNA小于1 000 IU/mL，ALT在正常值范圍內(nèi)，影像學(xué)檢查(B超、CT)未見肝臟纖維化改變；中度乙肝組入選標(biāo)準(zhǔn)：既往有乙型肝炎病史或新近發(fā)現(xiàn)乙型肝炎，6個(gè)月內(nèi)未經(jīng)抗病毒治療，HBV DNA>1 000 IU/mL，ALT在正常值范圍內(nèi)，影像學(xué)檢查(B超、CT)未見肝臟纖維化改變；重度乙肝組入選標(biāo)準(zhǔn)：既往有乙型肝炎病史或新近發(fā)現(xiàn)乙型肝炎，6個(gè)月內(nèi)未經(jīng)抗病毒治療，HBV DNA>1 000 IU/mL，6個(gè)月內(nèi)至少2次ALT超過正常值上限的2倍，影像學(xué)檢查(B超、CT)可見肝臟纖維化改變；肝硬化組均為經(jīng)肝組織活檢所診斷，入選標(biāo)準(zhǔn)：既往有乙型肝炎病史，6個(gè)月內(nèi)未經(jīng)抗病毒治療，HBV DNA>1 000 IU/mL，6個(gè)月內(nèi)影像學(xué)檢查和肝組織活檢均診斷為肝硬化。

在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前均取得所有入選者的知情同意，同時(shí)通過成都醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)(人體實(shí)驗(yàn))倫理審查。留取所有受試者的血液樣品，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)后凍存在-80 ℃冰箱以備后續(xù)檢測(cè)。

1.2 研究方法

在本院檢驗(yàn)科抽靜脈血6 mL于紅色采血管中,離心15 min獲得血清，然后將血清分為3份，1份用于檢測(cè)生化相關(guān)指標(biāo)，1份用于檢測(cè)肝纖4項(xiàng)中的HA(透明質(zhì)酸)濃度，最后1份凍存在-80 ℃冰箱用于后續(xù)檢測(cè)Klotho蛋白濃度。采用日立全自動(dòng)生化分析儀7600檢測(cè)各組血清中肝功能生化指標(biāo)：丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)、堿性磷酸酶(ALP)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、前白蛋白(PA)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、膽汁酸(TBA)的濃度；采用熒光定量PCR儀檢測(cè)血清HBV DNA水平；采用安圖公司Autobio A2000plus 全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀分析系統(tǒng)檢測(cè)各組血清中透明質(zhì)酸(HA)的濃度；采用人Klotho ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，CSB-E13235h)檢測(cè)各組血清中Klotho蛋白的濃度，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組肝功能生化指標(biāo)在各組中的比較

5組在性別、年齡一般資料方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。生化指標(biāo)結(jié)果顯示：5組血清中總蛋白(TP)含量，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與正常組相比較，ALT表達(dá)量在重度乙肝組中更高(P<0.05)，ALB表達(dá)量在中度乙肝組、重度乙肝組和肝硬化組中更低(P<0.05)，AST、GGT、ALP、TBIL、DBIL、TBA表達(dá)量在重度乙肝組和肝硬化組中更高，PA表達(dá)量在輕度、中度、重度乙肝組和肝硬化組中均較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)

表1 各組肝功能生化指標(biāo)含量的比較

注：與正常組相比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 Klotho與肝纖維化指標(biāo)HA在各組中的表達(dá)差異

輕度、中度、重度乙肝組和肝硬化組患者血清中Klotho蛋白表達(dá)水平均高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=35.770，P<0.001)；重度乙肝組和肝硬化組患者血清中Klotho蛋白表達(dá)水平均高于正常組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=40.450，P<0.001)(表2、圖1)。

表2 Klotho與肝纖維化指標(biāo)HA在各組中的表達(dá)差異

注：與正常組相比較,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖1 Klotho與肝纖維化指標(biāo)HA在各組中的表達(dá)差異

注：A：5組患者血清中Klotho蛋白表達(dá)水平比較，與正常組相比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；B： 5組患者血清中HA蛋白表達(dá)水平比較，與正常組相比較，**P<0.01，***P<0.001

2.3 Klotho與各項(xiàng)肝功能指標(biāo)的相關(guān)性

Klotho與AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA均成正相關(guān)(P<0.05)，與ALB、PA成負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與ALT、GGT、TP均無相關(guān)性(P>0.05)(表3)。

2.4 Klotho與肝纖維化指標(biāo)HA的相關(guān)性

Klotho和HA蛋白濃度經(jīng)過Log Transform處理后進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明在乙型肝炎和肝硬化患者中Klotho和HA成明顯的正相關(guān)(r=0.782,P<0.05)(圖2)。

項(xiàng)目Log(Klotho)rPLog(HA)0.7820.001

圖2 Klotho與肝纖維化指標(biāo)HA的相關(guān)性分析

3 討論

在當(dāng)今社會(huì)肝纖維化是一個(gè)預(yù)后極差且病死率很高的疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康，常見于多數(shù)慢性肝臟疾病中[3]。在發(fā)達(dá)國(guó)家，導(dǎo)致肝臟纖維化的主要原因包括慢性丙型肝炎病毒感染、酗酒和非酒精性脂肪性肝病等。而在發(fā)展中國(guó)家中，慢性乙型肝炎病毒感染、酗酒是導(dǎo)致肝纖維化的主要因素[4]。因此，肝纖維化也是各種慢性肝臟疾病發(fā)展至肝硬化的關(guān)鍵，作為進(jìn)一步發(fā)展肝硬化及肝癌的中間過程，也是肝臟炎癥、肝臟腫瘤等許多慢性肝臟疾病的重要中間環(huán)節(jié)，對(duì)探索肝癌等其他疾病的發(fā)生有重要的意義。以往研究者[5]認(rèn)為肝纖維化是不可逆的，但是近年來臨床上越來越多的實(shí)際病例表明，肝纖維化這種疾病在經(jīng)過治療后，可能會(huì)繼續(xù)發(fā)展，也可能會(huì)逆轉(zhuǎn)。重視肝纖維化的及早治療，從而使“慢性肝炎-肝纖維化-肝硬化-肝癌”這條慢性進(jìn)展過程得以終止。

目前臨床上用病理肝穿、B超、CT、MRI、實(shí)驗(yàn)室診斷等診斷肝纖維化，血清學(xué)指標(biāo)的高低與肝穿診斷的肝纖維化嚴(yán)重程度密切相關(guān)，不如肝穿刺檢查來得直接，但對(duì)于某一病人來說，往往很難根據(jù)一次化驗(yàn)指標(biāo)高低來確定肝纖維化的程度。血清化驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)是取材方便、容易復(fù)查，如果能定期檢查(如每半年或一年)則可以根據(jù)這些指標(biāo)是升高或降低的總趨勢(shì)來了解肝臟纖維化的發(fā)展變化情況，也可大致了解抗纖維化治療的臨床效果。目前肝纖維化和肝硬化無創(chuàng)診斷的血清學(xué)模型參數(shù)主要是肝纖維化四項(xiàng)血清指標(biāo)PCIII(III型前膠原)、IV-C(IV型膠原)、LN(層粘連蛋白)、HA(透明質(zhì)酸酶)，尤其是HA，對(duì)判斷肝纖維化有較好的相關(guān)性，臨床診斷價(jià)值較高[6]。

Klotho是一種新發(fā)現(xiàn)的抗衰老基因，最初人們發(fā)現(xiàn)，該基因缺陷小鼠會(huì)出現(xiàn)一系列類似人類衰老的表型變化，包括生長(zhǎng)阻滯、動(dòng)脈硬化、骨質(zhì)疏松、代謝功能紊亂等[7]，其表達(dá)產(chǎn)物有膜結(jié)合型和分泌型兩種蛋白，二者分別是膜結(jié)合受體和體液調(diào)節(jié)因子，能通過如調(diào)節(jié)維生素D和鈣、磷代謝，抗凋亡、保護(hù)心血管系統(tǒng)等途徑，抗衰老等多種疾病進(jìn)行調(diào)節(jié)。分泌型Klotho蛋白在體內(nèi)可作為一種內(nèi)分泌激素，能夠在血液、尿液、腦脊液中檢測(cè)到。有研究[8]顯示，Klotho蛋白在腎癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、胰腺癌等多種腫瘤組織中表達(dá)水平較低，尤其在腎癌組織中的表達(dá)量與腫瘤大小、臨床分期成負(fù)相關(guān)，與病人的生存率成正相關(guān)，說明Klotho蛋白可能是一個(gè)腫瘤抑制因子，其能抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Camilli等[9]在對(duì)黑色素細(xì)胞瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，Klotho基因表達(dá)的上調(diào)能夠抑制鈣蛋白酶，減少細(xì)絲蛋白A的裂解，進(jìn)而改變細(xì)胞骨架，能夠促進(jìn)細(xì)胞間葉標(biāo)志物神經(jīng)鈣黏蛋白的下調(diào)，并使在細(xì)胞間起粘連調(diào)節(jié)作用的上皮鈣黏蛋白表達(dá)的上調(diào)，促進(jìn)EMT相關(guān)基因表達(dá)的下調(diào)，在逆轉(zhuǎn)EMT方面發(fā)揮重要作用。現(xiàn)今EMT過程在纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中的作用越來越受到重視，EMT可能是肝纖維化另外一條重要機(jī)制。因此，本課題旨在研究Klotho在乙肝肝硬化中的表達(dá)差異，以及其含量與HA的相關(guān)性。

本研究顯示，319例臨床病例中重度乙肝組和肝硬化組血清HA蛋白均高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而Klotho在輕、中度乙肝組的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，在重度慢性HBV相關(guān)性肝病尤其是乙肝肝硬化中較正常組表達(dá)明顯更高。肝纖維化是重度乙型肝炎發(fā)展為肝硬化的重要病理過程，這些結(jié)果表明Klotho可能成為肝纖維化中一個(gè)更為敏感的檢測(cè)指標(biāo)，并且提示Klotho可能參與了肝纖維化的病理發(fā)病機(jī)制。

另外，我們發(fā)現(xiàn)Klotho與肝功能指標(biāo)AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA均成正相關(guān)，與ALB、PA成負(fù)相關(guān)，與ALT、GGT、TP均無相關(guān)性，這些結(jié)果表明Klotho與肝功能炎癥損害密切相關(guān)，但是Klotho與肝臟炎癥活動(dòng)的重要指標(biāo)ALT無相關(guān)性，其可能解釋是ALT易受降酶藥物等諸多因素的影響，且部分肝炎患者在肝臟炎癥活動(dòng)時(shí)ALT卻不出現(xiàn)明顯異常，部分肝硬化患者或肝細(xì)胞嚴(yán)重壞死者其ALT水平與肝臟炎癥或損傷程度也不成平行關(guān)系。

Klotho與肝纖指標(biāo)HA水平呈正相關(guān)性預(yù)示著它們可能在肝纖維化中發(fā)揮著相同的作用機(jī)制。HA的主要作用是參加構(gòu)成蛋白聚糖多聚體，能夠被內(nèi)皮細(xì)胞攝取和降解。如果肝細(xì)胞遭到刺激而受傷，處于沉睡狀態(tài)下的肝星狀細(xì)胞(HSC)就會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，HA合成和排泌上調(diào)，再加上內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量相對(duì)減少，功能降低致透明質(zhì)酸降解減少，從而致使透明質(zhì)酸間接增多[10]。相關(guān)研究[11]表明在慢性肝病的發(fā)展中，HA在急性肝炎、慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化中濃度由低到高。血清HA對(duì)肝纖維化的病情改變比其它血清學(xué)指標(biāo)更敏感，是目前反映肝纖維化和肝炎癥的所有血清學(xué)指標(biāo)中最敏感的指標(biāo)，Klotho與HA 的正相關(guān)關(guān)系預(yù)示Klotho可以作為肝纖維化診斷模型一個(gè)獨(dú)立或附加參數(shù)，聯(lián)合肝纖四項(xiàng)形成新的預(yù)測(cè)模型，使慢性乙型肝炎肝纖維化診斷模型更準(zhǔn)確更多樣化，對(duì)預(yù)防肝硬化，指導(dǎo)早期干預(yù)具有重要意義。

綜上所述，Klotho蛋白可能參與了肝功能炎癥損害和肝纖維化的發(fā)生發(fā)展，為探討Klotho對(duì)肝纖維化的抗炎作用，以及抑制肝纖維化的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用，還需要在后續(xù)的動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究具體的作用機(jī)制及分子機(jī)制。相關(guān)研究在完善肝纖維化的分子調(diào)控機(jī)制方面具有重要意義。