磷酸川芎嗪不同給藥方式在大鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)的研究

吳婷婷，楊科偉，余 婷，陳 麟，杜朝樹，蘇 青

成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院(成都 610000)

川芎嗪化學(xué)名為四甲基吡嗪，是從傳統(tǒng)中藥川芎中提取分離出來的生物堿[1]。研究[2-3]表明，川芎嗪具有抗血栓、抑制血小板聚集、保護心腦血管系統(tǒng)、抗腫瘤等藥理作用。磷酸川芎嗪(tetramethylpyrazinephosphate，TMPP)是川芎嗪的衍生物之一，是一種新型的鈣通道阻滯劑，臨床上主要用于治療心腦血管、呼吸系統(tǒng)等疾病[4-5]。目前，TMPP 用于臨床主要為片劑及注射劑。研究[6-7]表明，口服TMPP首過效應(yīng)明顯，生物半衰期短，生物利用度低。因此，臨床應(yīng)用需要頻繁給藥以維持有效血藥濃度，長期用藥十分不便，并且易造成體內(nèi)藥物蓄積，增加毒副作用。此外，TMPP注射劑刺激性較大，患者順應(yīng)性較差，將TMPP開發(fā)成控釋劑型可有效避免上述局限性。查閱相關(guān)資料[8]發(fā)現(xiàn)，川芎嗪游離堿分子量小(136.20)，熔點低(76～78 ℃)，油水分配系數(shù)適中，適合經(jīng)皮給藥。目前，有報道[9-10]研制TMPP透皮制劑，但透皮給藥系統(tǒng)不盡相同。凝膠膏劑載藥量大，與皮膚相容性好，采用親水性高分子材料提高了藥物的經(jīng)皮滲透。基于兩者優(yōu)勢，前期將TMPP開發(fā)成凝膠膏劑，制備得到的TMPP凝膠膏劑各項性能均符合藥劑學(xué)要求。本研究對TMPP凝膠膏劑、片劑以及注射劑在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)進行研究，為TMPP凝膠膏劑進一步研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

磷酸川芎嗪原料藥(南京澤朗生物科技有限公司，批號DZ20170418)；磷酸川芎嗪對照品(成都食品藥品檢驗研究院，批號100845-201002)；磷酸川芎嗪片(北京燕京藥業(yè)有限公司，批號160402)；磷酸川芎嗪注射劑(自制，批號20180110)；磷酸川芎嗪凝膠膏劑(自制，批號20171208)；香豆素(成都市科龍化工試劑廠，色譜純)；肝素鈉(成都市科龍化工試劑廠，分析純)；甲醇為色譜純，乙腈、冰醋酸為分析純；水為純化水。

1.2 實驗儀器

Agilent1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)，Sartorius BP211D電子天平(德國賽多利斯公司)，XK80-A快速混勻器(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)，Heraeus Pico 17離心機(ThermoFisher)，UPH-1-20T優(yōu)譜超純水器(成都超純科技有限公司)，pHS-4C+智能型酸度計(成都世紀(jì)方舟科技有限公司)，KH3200E超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)。

1.3 實驗動物

18只SD大鼠，隨機分為凝膠膏劑組、口服給藥組及靜脈注射組，每組各6只，雌雄兼有，體重250～300 g，四川省人民醫(yī)院動物研究所提供，動物合格證號：SCXK(川)2013-15。

1.4 方法

1.4.1 TMPP凝膠膏劑及注射劑的制備 精密稱取卡波姆5.000 g，TMPP原料藥2.172 g，加入100 g純化水充分?jǐn)嚢瑁葸^夜，作為A相。精密稱取EDTA-2Na 0.037 g、甘羥鋁 0.055 g、聚丙烯酸鈉3.560 g，加入19.300 g甘油中，攪拌均勻，充分溶脹，作為B相。精密稱取酒石酸0.054 g、PVP 1.980 g，加入12.600 g純化水中，充分溶解，作為C相。將B相分次加入A相混合攪勻，作為D相，再將C相少量多次加入D相攪勻成黏稠狀半固態(tài)流體后，涂布于面積為5 cm×5 cm的無紡布上，放置成型，加蓋聚乙烯薄膜，即得TMPP凝膠膏劑。精密稱取TMPP適量，用注射用水溶解成濃度為6 mg/mL的溶液，用10%氫氧化鈉溶液調(diào)pH至2.0～3.0，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾至澄明，灌裝，封口，115 ℃熱壓蒸汽滅菌30 min，即得TMPP注射劑。

1.4.2 血漿樣品中TMPP測定方法建立 1)色譜條件：色譜柱：welchrom-C18( 250 mm×4.6 mm，5 μm) ；流動相：甲醇-水(體積分?jǐn)?shù)為35∶65) ，冰醋酸調(diào)pH至(3.7±0.05)；流速1.0 mL/min；檢測波長293 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 L。2)內(nèi)標(biāo)溶液配制：精密稱取香豆素適量，用甲醇溶解制得20 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。3)血漿樣品處理方法：精密吸取200 μL空白血漿樣品，加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，渦旋混勻5 min，加入300 μL乙腈，渦旋混勻5 min，12 000 r/min，離心半徑7 cm，高速離心10 min后，取上清液，待用。4)血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取TMPP對照品適量，加甲醇配成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用流動相稀釋成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。加入血漿200 μL，再分別加入各標(biāo)準(zhǔn)溶液配成濃度為0.1、0.2、0.4、1、2、4、8、10、20、40、60、80、120、150 μg/mL的血漿溶液。按3)項下操作，并按照HPLC測定方法進行測定，以樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值對樣品濃度作線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。5)方法專屬性：在本實驗條件下，分別將空白血漿、TMPP對照品及樣品血漿注入液相色譜儀進行測定，記錄保留時間及色譜圖。6)精密度、準(zhǔn)確度試驗：按4)項下方法配制低、中、高3種不同濃度TMPP(0.2、10、120 μg/mL)血漿樣品溶液各5份，于1 d內(nèi)與連續(xù)3 d處理并測定，計算日內(nèi)和日間精密度及回收率。7)提取回收率：分別配制低、中、高3種不同濃度TMPP(0.2、10、120 μg/mL)血漿樣品溶液各5份，按照血漿樣品預(yù)處理方法和HPLC測定方法進行測定，記錄平均峰面積；同時配制同等濃度TMPP標(biāo)準(zhǔn)溶液各5份進行測定，記錄平均峰面積。計算兩者峰面積比值。8)穩(wěn)定性：分別配制低、中、高3種不同濃度TMPP(0.2、10、120 μg/mL)血漿樣品溶液各3份，分別考察血漿樣品在室溫下放置24 h、4 ℃下放置2 d、-20 ℃下反復(fù)凍融3次以及在-40 ℃下放置7 d的穩(wěn)定性。

1.4.3 體內(nèi)藥動學(xué)實驗 1)貼劑給藥及血樣采集 SD大鼠6只，雌雄各半，實驗前1 d以刀片于背部脫毛，確保皮膚完好，用生理鹽水洗凈，待用。單次給予TMPP凝膠膏劑1貼，緊密貼于大鼠背部裸露皮膚，用醫(yī)用膠帶加以固定。于給藥前和給藥后0、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10、12、15、24(除去貼劑)、36、48 h尾靜脈取血約500 μL，置于預(yù)先用肝素潤洗過的離心管中，5 000 r/min，離心半徑7 cm，離心10 min，取上清血漿200 μL。按1.4.2中3)項下方法進行血漿樣品處理，采用HPLC內(nèi)標(biāo)法測定血漿中TMPP濃度。2)口服給藥及血樣采集 SD大鼠6只，雌雄各半，實驗前禁食12 h，自由飲水，單次灌胃TMPP片劑，給藥劑量為31.25 mg/kg，于給藥前及給藥后0、0.083、0.167、0.250、0.333、0.667、1、1.5、2、4 h尾靜脈取血約500 μL，置于預(yù)先用肝素潤洗過的離心管中，5 000 r/min，離心半徑7 cm，離心10 min，取血漿200 μL。按1.4.2中3) 項下方法進行血漿樣品處理，采用HPLC內(nèi)標(biāo)法測定血漿中TMPP濃度。3)注射給藥及血樣采集 SD大鼠6只，雌雄各半，尾靜脈注射TMPP注射液，劑量為10 mg/kg[11]，分別于給藥后0.083、0.167、0.333、0.5、1、1.5、2、3、4、6 h尾靜脈取血約500 μL，置于預(yù)先用肝素潤洗過的離心管中，5 000 r/min，離心半徑7 cm，離心10 min，取血漿200 μL。按1.4.2中3)項下方法進行血漿樣品處理，采用HPLC內(nèi)標(biāo)法測定血漿中TMPP濃度。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血藥濃度測定方法的建立

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y=0.265 6X-0.052 (R2=0.999 9)，表明血漿中TMPP的濃度在0.1～150 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.1.2 方法專屬性 TMPP保留時間約為16.503 min，內(nèi)標(biāo)物保留時間約為18.520 min，主藥與內(nèi)標(biāo)能較好分離，血漿內(nèi)源性成分不干擾樣品的測定，說明此方法測定血漿中TMPP的專屬性較高，最小檢測濃度為0.1 μg/mL (S / N ≥3 )(圖1)。

圖1 高效液相色譜圖注：A：空白血漿；B：TMPP對照品；C： 血漿樣品；1：TMPP；2：內(nèi)標(biāo)(香豆素)

2.1.3 精密度、準(zhǔn)確度 測得日內(nèi)RSD分別為4.41%、3.88%、3.04%，日間RSD分別為5.92%、4.68%、3.26%(表1)。

表1 TMPP在大鼠血漿中的精密度和準(zhǔn)確度

2.1.4 提取回收率 血漿中TMPP平均提取回收率分別為82.94%，102.57%，87.71%，RSD分別為1.04%，3.08%，7.08%。表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.1.5 穩(wěn)定性 TMPP在各貯存條件下穩(wěn)定性良好，結(jié)果如下(表2)。

2.2 血藥濃度-時間曲線

TMPP 3種不同劑型在大鼠體內(nèi)藥時曲線如下(圖2)。由此可看出，大鼠在給予TMPP片劑和注射劑后，吸收和消除迅速，凝膠膏劑吸收消除則較為緩慢，血藥濃度波動小，作用時間延長。

圖2 大鼠給予3種TMPP制劑后的平均血藥濃度-時間曲線

2.3 藥動學(xué)參數(shù)

TMPP凝膠膏劑組的t1/2是口服給藥組的8.6倍，是靜脈注射組的4.1倍。TMPP凝膠膏劑的達峰時間較片劑明顯延長，AUC0-t是片劑的1.4倍，是注射劑的2.6倍，MRT0-t是片劑的4.8倍，是注射劑的8.9倍。TMPP凝膠膏劑主要藥動學(xué)參數(shù)與片劑及注射劑相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明凝膠膏劑給藥較片劑及注射劑有明顯優(yōu)勢(表3～4)。

表3 TMPP凝膠膏劑與片劑藥動學(xué)參數(shù)

注：與凝膠膏劑相比，*P<0.05

表4 TMPP凝膠膏劑與注射劑藥動學(xué)參數(shù)

注：與凝膠膏劑相比，*P<0.05

3 討論

本研究建立了大鼠血漿中TMPP的HPLC分析方法，專屬性高。內(nèi)標(biāo)法排除血漿中內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，方法精密度、回收率良好，符合藥動學(xué)研究要求。

目前，國內(nèi)外均沒有TMPP凝膠膏劑的上市產(chǎn)品，因此采用上市片劑及注射劑為參比制劑，考察凝膠膏劑與片劑及注射劑在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)差異。TMPP凝膠膏劑的吸收較片劑緩慢而持久，表觀消除速率較片劑及注射劑小，主要藥動學(xué)參數(shù)(t1/2、AUC0-∞、MRT0-∞)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TMPP凝膠膏劑能維持較為平穩(wěn)及持續(xù)的血藥濃度，具有明顯的緩釋作用，能夠避免片劑帶來的血藥濃度波動，說明TMPP經(jīng)皮給藥是可行的。

使藥物在較短的時間內(nèi)達到有效血藥濃度并維持恒定釋放是經(jīng)皮制劑研究的重點[12]。本研究中，TMPP凝膠膏劑能平穩(wěn)持續(xù)釋放藥物，但其在大鼠體內(nèi)的Cmax較口服片劑小，究其原因可能是由于給藥劑量過小，因此，如何選擇合適的給藥劑量還需要深入考察，以確保凝膠膏劑能夠在較短時間內(nèi)達到有效治療血藥濃度，同時能夠保證在安全劑量范圍內(nèi)。

實驗過程中，貼劑在24 h后移除，繼續(xù)采集36、48 h的血漿樣品，測定結(jié)果均在最低定量限以下。由于沒有采集24 ～36 h的血樣，因此看不出在移除貼劑后血藥濃度是否有明顯下降。透皮制劑基質(zhì)處方以及制備工藝不盡相同，因此，本研究開發(fā)的TMPP凝膠膏劑在大鼠皮膚內(nèi)有無蓄積還需要進一步考察。