基因敲減SOX4對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響*

劉 奕，周 昊，費(fèi) 偉Δ

1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 口腔科(成都 610072) 2.電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院 口腔科(成都 610072)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)是人頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，占全身腫瘤的3%。每年全球有50萬(wàn)新發(fā)病例，而其中只有50%的患者生存率大于5 年，由于其發(fā)生機(jī)制尚未明確，臨床仍很難把握其發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后[1-4]。SOX(SRY-related high-mobility-group box)基因是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其功能涉及多種早期胚胎發(fā)育過程[5-6]。SOX4屬于SOX C亞族，表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，SOX4基因的突變、缺失或過表達(dá)可導(dǎo)致發(fā)育異?；蛳忍煨约膊?，也與腫瘤的形成和發(fā)展密切相關(guān)。課題組前期研究采用LC-MS/MS技術(shù)分別從口腔扁平苔蘚(oral lichen planus, OLP)，OLP-OSCC和OSCC的福爾馬林固定石蠟包埋(formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE)樣本中鑒定出了轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白SOX4，并對(duì)其表達(dá)進(jìn)行了初步的驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比OLP樣本，SOX4蛋白在OLP-OSCC和OSCC的FFPE樣本中表達(dá)升高，在口腔鱗癌細(xì)胞UM1中表達(dá)也升高，在SOX4基因敲減后，UM1細(xì)胞中SOX4表達(dá)降低。本研究擬以前期研究為基礎(chǔ)，實(shí)現(xiàn)SOX4基因敲減，并采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法、MTT法、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)探討轉(zhuǎn)染后的口腔鱗癌細(xì)胞UM1體外生長(zhǎng)的變化，從而為進(jìn)一步研究SOX4的生物學(xué)功能提供線索。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞 舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(UM1)由中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院陶謙教授惠贈(zèng)；正常人口腔角質(zhì)形成細(xì)胞 (normal human oral keratinocytes, NHOK)購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要試劑 人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑 和LipofectamineTM3000試劑(Invitrogen公司，美國(guó))，雙鏈SOX4 siRNA (sc-38412)和非特異性對(duì)照siRNA(Santa Cruz Biotech公司，美國(guó))，Vi-cell 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀 (Beckman Coulter公司，美國(guó))，四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT, 5 mg/mL)(Sigma-Aldrich公司，美國(guó))，二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO) (Sigma公司，美國(guó))，Synergy HT多功能微孔板酶標(biāo)儀(BioTek Instruments公司，美國(guó))，HEMA 3染色試劑盒(Thermo Fisher Scientifi公司，美國(guó))，MedCalc軟件 (MedCalc Software公司，比利時(shí))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)組：轉(zhuǎn)染針對(duì)SOX4設(shè)計(jì)的特異性siRNA的UM1細(xì)胞(即 siSOX4細(xì)胞，n=5)。對(duì)照組：轉(zhuǎn)染非特異性siRNA的siCTRL 細(xì)胞(陰性對(duì)照，n=5)；空白對(duì)照組(未處理的UM1，n=5)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) NHOK細(xì)胞在EpiLife培養(yǎng)基+人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充劑中培養(yǎng)，UM1在DMEM (dulbecco's modified eagle medium)+10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)+青霉素(100 U/mL)+鏈霉素(100 U/mL)中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱，細(xì)胞90%～95%匯合后經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化傳代。參照LipofectamineTM3000試劑說明書指示：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期UM1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL接種至六孔培養(yǎng)板過夜，培養(yǎng)。取雙鏈SOX4 siRNA (sc-38412)和非特異性對(duì)照siRNA分別與稀釋后的轉(zhuǎn)染試劑混合，加入培養(yǎng)基孵育，過夜，更換新鮮的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示：UM1細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，SOX4蛋白在UM1細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于NHOK細(xì)胞，UM1細(xì)胞被成功轉(zhuǎn)染siSOX4后，siSOX4在UM1細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于對(duì)照組siCTRL在UM1中的表達(dá)。

1.2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況 分別從培養(yǎng)皿中收集實(shí)驗(yàn)組siSOX4細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶處理，制備單細(xì)胞混懸液，將細(xì)胞以每孔1×105濃度接種于12孔板中孵育，分別在24、48、72 h收集細(xì)胞并重懸于500 μL培養(yǎng)液，Vi-cell 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)。

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平 siSOX4 細(xì)胞無血清饑餓培養(yǎng)24 h，以每孔4 000個(gè)細(xì)胞/100 μL培養(yǎng)液接種于96孔板中，置于37 ℃培養(yǎng)。在每個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)，每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)，37 ℃繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄孔內(nèi)上清液，每孔加入200 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在Synergy HT多功能微孔板酶標(biāo)儀上490 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸收值。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估SOX4敲減后UM1細(xì)胞的遷移能力。6孔板接種細(xì)胞之前先用marker筆在背面畫橫線標(biāo)記，每孔劃4條線，將濃度為5×105的細(xì)胞消化后接種于6孔板，數(shù)量以貼壁后鋪滿板底為宜。細(xì)胞鋪滿板底后，用1 mL槍頭垂直于孔板制造細(xì)胞劃痕，盡量保證各個(gè)劃痕寬度一致，吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS沖洗孔板3次，洗去劃痕產(chǎn)生的細(xì)胞碎片。加入無血清培養(yǎng)基，拍照記錄。將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，8 d后取出拍照，使用NIH Image J 軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 該實(shí)驗(yàn)用于評(píng)估SOX4敲減后UM1細(xì)胞的侵襲能力。UM1/siRNA細(xì)胞無血清饑餓培養(yǎng)24 h，收集消化細(xì)胞，重懸于100 μL含0.1%FBS的DEME培養(yǎng)液中，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104加入上室，下室加入500 μL含10%FBS的DEME培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后棉簽輕拭小室內(nèi)的Matrigel和細(xì)胞，用HEMA 3染色試劑盒固定染色穿過膜的細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)取4個(gè)高倍視野并照相，記錄穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SOX4基因敲減后對(duì)UM1細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響

在不同時(shí)間點(diǎn)(24、48、72 h)使用細(xì)胞計(jì)數(shù)法和MTT法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染siSOX4后UM1細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖能力，結(jié)果顯示，與siCTRL對(duì)照組相比，SOX4基因敲減后，UM1細(xì)胞在48、72 h的生長(zhǎng)和增殖能力明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.770，P<0.01)(圖1)。

圖1 SOX4基因敲減后對(duì)UM1細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的影響注：A ：細(xì)胞計(jì)數(shù)法，與對(duì)照組相比較，**P<0.01；B：MTT法，與對(duì)照組相比較，**P<0.01

2.2 SOX4基因敲減后對(duì)UM1細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞培養(yǎng)8 h后，與siCTRL對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組siSOX4細(xì)胞處理后，培養(yǎng)板中細(xì)胞空白區(qū)域更寬，證明SOX4基因敲減后，UM1細(xì)胞的遷移能力下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(圖2)。

2.3 SOX4基因敲減后對(duì)UM1細(xì)胞侵襲能力的影響

與對(duì)照組比較，siSOX4實(shí)驗(yàn)組過膜細(xì)胞數(shù)量減少68%(P<0.01)，證明SOX4基因敲減后，UM1細(xì)胞的侵襲能力下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.253,P<0.01)(圖3)。

圖3 SOX4基因敲減后對(duì)UM1細(xì)胞侵襲能力的影響 注：A ：細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，Scale bar 100 μm；B： 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果灰度值分析，與對(duì)照組比較，**P<0.01

3 討論

SOX4基因在不同類型腫瘤中的具體作用機(jī)制研究未得到統(tǒng)一結(jié)論，作為轉(zhuǎn)錄因子，SOX4在基因表達(dá)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中，其功能也許不是單一的，腫瘤的類別、分級(jí)以及SOX4蛋白與其他調(diào)節(jié)蛋白的相互作用等因素共同決定著該基因在腫瘤中的確切作用[7]。Yoon 等[8]研究者發(fā)現(xiàn)相較，周圍正常黏膜組織，SOX4在OSCC組織中的表達(dá)明顯上調(diào)，且促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的存活能力，增強(qiáng)其對(duì)放化療藥物的抵抗能力。但是，有研究[9]發(fā)現(xiàn)SOX4在某些腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起到抑制作用，這可能與SOX4影響p53活化而引起DNA損傷有關(guān)。有研究[10]發(fā)現(xiàn)，在組織學(xué)分級(jí)較好，及TMN分期早期的原發(fā)性膽囊癌中，SOX4表達(dá)升高。

SOX4 mRNA在人類多種腫瘤中是最為常見的一種上調(diào)基因，已被確認(rèn)為是64種腫瘤標(biāo)志基因中的一種。近年來對(duì)SOX4基因的研究逐步從其生理功能轉(zhuǎn)向了在疾病中的作用分析，研究[7]認(rèn)為SOX4在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制有以下幾種：1) 對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)節(jié)；SOX4在Wnt、Hedgehog、Notch通路中對(duì)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)起到復(fù)雜的調(diào)節(jié)作用。2)對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控：在前列腺癌細(xì)胞中抑制SOX4基因的表達(dá)后導(dǎo)致其下游靶基因p53正向細(xì)胞凋亡調(diào)控因子水平降低，間接抑制腫瘤細(xì)胞凋亡；沉默SOX4基因的表達(dá)后可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中NF-κB的激活因子Bcl10水平降低，凋亡抑制因子表達(dá)丟失，腫瘤凋亡增加。3)對(duì)miRNA的表達(dá)調(diào)控：在子宮內(nèi)膜癌患者，SOX4的上游調(diào)控基因miRNA-129-2的過度甲基化而使其功能難以發(fā)揮，從而使SOX4過表達(dá)。4)對(duì)細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移及分化的調(diào)控：SOX4可通過上調(diào)各類生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)而刺激細(xì)胞的增殖。到目前為止，對(duì)SOX4基因在不同類型腫瘤中的具體作用機(jī)制研究未得到統(tǒng)一的結(jié)論，作為轉(zhuǎn)錄因子，在基因表達(dá)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中，其功能也許不是單一的，腫瘤的類別、分級(jí)以及SOX4蛋白與其他調(diào)節(jié)蛋白的相互作用等因素共同決定著該基因在腫瘤中的確切作用。

課題組在SOX4的表達(dá)驗(yàn)證前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)SOX4蛋白在OLP-OSCC和OSCC的FFPE樣本中較OLP樣本表達(dá)升高，在口腔鱗癌細(xì)胞UM1中SOX4的表達(dá)也升高，在SOX4基因敲減后，UM1細(xì)胞中SOX4表達(dá)降低。在前期研究基礎(chǔ)上，課題組繼續(xù)深入研究SOX4基因，結(jié)果顯示在UM1細(xì)胞中SOX4基因敲減后，UM1細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖能力，以及細(xì)胞遷移和侵襲能力均下降。課題組的研究結(jié)果均提示SOX4蛋白在OLP向口腔鱗癌轉(zhuǎn)變的過程中可能具有促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展的作用。此外，課題組正在進(jìn)一步研究SOX4基因敲減后，在OLP癌變過程中，SOX4對(duì)部分炎癥相關(guān)腫瘤啟動(dòng)子信號(hào)通路的影響，以期能通過初步了解OLP癌變的機(jī)制而進(jìn)一步探索口腔黏膜慢性炎癥轉(zhuǎn)化為口腔鱗癌的內(nèi)在機(jī)制。