冷凍禽畜肉類(lèi)沙門(mén)氏菌快速分型檢驗(yàn)中實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用

李丹妮

目的：探討冷凍禽畜肉類(lèi)沙門(mén)氏菌快速分型檢驗(yàn)中實(shí)時(shí)熒光PCR（Quantitative Realtime PCR）檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值。方法：抽取2018年3月- 2018年7月冷凍禽畜肉類(lèi)樣品2000份，采取傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法與實(shí)時(shí)熒光PCR快速檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)其檢驗(yàn)結(jié)果。

結(jié)果：通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)顯示，本組樣品中檢出沙門(mén)氏菌76份（陽(yáng)性率3.80%）明顯高于傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法38份（1.90%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；進(jìn)一步對(duì)檢出沙門(mén)氏菌血清分型鑒定顯示以海德堡血清型、肯塔基血清型、鼠傷寒血清型、腸炎血清型為主。

結(jié)論：實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于冷凍禽畜肉類(lèi)沙門(mén)氏菌快速分型檢驗(yàn)中具有較好效果，有助于提升沙門(mén)氏菌檢出率，可快速分型，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等不足之處，具有更高臨床應(yīng)用價(jià)值。

沙門(mén)氏菌（salmonella）是一種常見(jiàn)的食源性致病菌，廣泛分布于自然界內(nèi)，隨著現(xiàn)代臨床檢驗(yàn)技術(shù)的不斷進(jìn)步，臨床發(fā)現(xiàn)的沙門(mén)氏菌超過(guò)1000余種，對(duì)人類(lèi)以及動(dòng)物健康均可造成嚴(yán)重影響。沙門(mén)氏菌的傳統(tǒng)鑒定方法依據(jù)形態(tài)學(xué)特征、生理生化體征、培養(yǎng)特征、抗原特征、噬菌體特征等展開(kāi)，不夠該檢驗(yàn)鑒定程度相對(duì)復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，不利于推廣應(yīng)用。熒光定量PCR（ realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR）是1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出的一種新定量試驗(yàn)技術(shù)，通過(guò)探針熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度。現(xiàn)有研究將該項(xiàng)技術(shù)引入冷凍禽畜肉類(lèi)沙門(mén)氏菌快速分型檢驗(yàn)中具有較好效果，鑒于此觀點(diǎn)，本文抽取2018年3月- 2018年7月冷凍禽畜肉類(lèi)樣品2000份展開(kāi)分析，評(píng)價(jià)實(shí)時(shí)熒光PCR檢驗(yàn)技術(shù)的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一般資料。抽取2018年3月～2018年7月冷凍禽畜肉類(lèi)樣品2000份展開(kāi)分析，其中冷凍禽類(lèi)897份，冷凍畜類(lèi)1103份。

方法。（1）試劑。選擇北京路橋公司提供的生化試劑以及泰國(guó)S&A;公司提供的分型鑒定血清、分離培養(yǎng)基、前增菌、后增菌。（2）儀器。采用全自動(dòng)核酸提取工作站，以及南京貝登電子商務(wù)有限公司提供的實(shí)時(shí)熒光PCR儀、全自動(dòng)微生物鑒定、藥敏分析儀。（3）檢測(cè)方法。檢測(cè)內(nèi)容均依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)方法展開(kāi)增菌培養(yǎng)，隨后采用全自動(dòng)核酸提取工作站進(jìn)行核酸的提取工作（磁珠法），待細(xì)胞裂解后，將細(xì)胞中核酸分子吸附于磁性顆粒上，待其反應(yīng)一定時(shí)間后，利用磁場(chǎng)作用將液體與磁性顆粒進(jìn)行分離，回收顆粒（磁珠- DNA混合物），并進(jìn)行脫洗。待各項(xiàng)程序完成后采取PCR檢測(cè)試劑盒展開(kāi)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)檢測(cè)，檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌靈敏度與特異度。待檢驗(yàn)完畢后對(duì)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性樣品者進(jìn)行增殖液接種、培養(yǎng)；生化反應(yīng)檢測(cè)通過(guò)挑取無(wú)色半透明H25菌株與可疑菌落，將其置放于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，在適量溫度環(huán)境內(nèi)（37℃）逐漸擴(kuò)大培養(yǎng)，最后采用全自動(dòng)微生物、藥敏反應(yīng)進(jìn)行鑒定與分析，各項(xiàng)操作均依據(jù)說(shuō)明書(shū)完成。血清學(xué)分型鑒定中將生化鑒定檢驗(yàn)陽(yáng)性菌種，將其點(diǎn)種于瓊脂量低的瓊脂平板內(nèi)，在濕潤(rùn)環(huán)境下誘導(dǎo)等操作內(nèi)容，隨后依據(jù)按照單因子血清、多價(jià)血清展開(kāi)血清學(xué)實(shí)驗(yàn)。

結(jié)果

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)顯示，本組樣品中檢出沙門(mén)氏菌76份（陽(yáng)性率3.80%）明顯高于傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法38份（1.90%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；進(jìn)一步對(duì)檢出沙門(mén)氏菌血清分型鑒定顯示以海德堡血清型、肯塔基血清型、鼠傷寒血清型、腸炎血清型為主。

討論

近年來(lái)我國(guó)正處于經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展階段，隨著人們生活水平的改善，對(duì)于禽類(lèi)、畜類(lèi)等肉制品需求愈發(fā)增高。而與此同時(shí)冷凍禽畜肉類(lèi)批次增多、數(shù)量增大，這便對(duì)多批次巨量冷凍禽畜肉類(lèi)檢驗(yàn)工作提出更高要求。若檢驗(yàn)周期延長(zhǎng)不僅可影響整個(gè)冷凍肉類(lèi)供應(yīng)的產(chǎn)業(yè)鏈及時(shí)性，同時(shí)對(duì)冷庫(kù)儲(chǔ)存、周轉(zhuǎn)等運(yùn)作效率形成限制，增加了冷庫(kù)儲(chǔ)存周轉(zhuǎn)壓力。

沙氏門(mén)菌沙門(mén)氏菌病是指由各種類(lèi)型沙門(mén)氏菌所引起的對(duì)人類(lèi)、家畜以及野生禽獸不同形式的總稱(chēng)。感染沙門(mén)氏菌的人或帶菌者的糞便污染食品，可使人發(fā)生食物中毒。據(jù)統(tǒng)計(jì)在世界各國(guó)的種類(lèi)細(xì)菌性食物中毒中，沙門(mén)氏菌引起的食物中毒常列榜首，我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)也以沙門(mén)氏菌為首位，具有菌型多樣化、分布廣泛、檢驗(yàn)復(fù)雜等特點(diǎn)。沙氏門(mén)菌的傳統(tǒng)檢驗(yàn)主要包括分離培養(yǎng)、前后增菌的檢測(cè)、生化鑒定以及分型檢驗(yàn)等程序，郭丹桂的研究中指出，傳統(tǒng)檢驗(yàn)時(shí)間需要耗費(fèi)4- 10d左右，由此可見(jiàn)其耗時(shí)表現(xiàn)費(fèi)力，在現(xiàn)實(shí)工作中難以滿足需求。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)主要利用DNA擴(kuò)增反應(yīng)，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法，在擴(kuò)增期間，通過(guò)熒光信號(hào)，對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)。由于在PCR擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以可成為定量的依據(jù)。在本次研究中通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)顯示，本組樣品中檢出沙門(mén)氏菌76份（陽(yáng)性率3.80%）明顯高于傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)方法38份（1.90%），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；由此可見(jiàn)實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)確有較高檢出率。進(jìn)一步分型可見(jiàn)顯示以海德堡血清型、肯塔基血清型、鼠傷寒血清型、腸炎血清型為主，這與趙建梅等人的研究結(jié)果表現(xiàn)一致性。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于冷凍禽畜肉類(lèi)沙門(mén)氏菌快速分型檢驗(yàn)中具有較好效果，有助于提升沙門(mén)氏菌檢出率，可快速分型，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等不足之處，具有更高臨床應(yīng)用價(jià)值。