流式細(xì)胞術(shù)研究細(xì)胞增殖的方法與技術(shù)

摘要：流式細(xì)胞術(shù)是檢測細(xì)胞增殖的一種重要手段，較以往的檢測方法，流式細(xì)胞儀的優(yōu)點(diǎn)在于能夠?qū)崿F(xiàn)多熒光指標(biāo)同時檢測，并且可以對混合樣品中的特定細(xì)胞進(jìn)行增殖分析，本文就目前常用細(xì)胞增殖檢測染料的檢測原理，應(yīng)用范圍及染色方法作進(jìn)行闡述。

關(guān)鍵詞：細(xì)胞增殖;流式細(xì)胞;DNA染色;示蹤染料

中圖分類號：R392? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.01.016

文章編號：1006-1959（2019）01-0047-03

Method and Technique for Cell Proliferation by Flow Cytometry

HU Nai-Li

（Central Laboratory，Capital Medical University，Beijing 100069，China）

Abstract：Flow cytometry is an important means to detect cell proliferation. Compared with previous detection methods， flow cytometry has the advantages of simultaneous detection of multiple fluorescence indicators， and can perform proliferation analysis on specific cells in mixed samples. At present， the detection principle， application range and dyeing method of cell proliferation detection dyes are commonly used.

Key words：Cell proliferation;Flow cytometry;DNA staining;Tracer dye

細(xì)胞增殖是生物體的重要生命特征，細(xì)胞以分裂的方式進(jìn)行增殖，增殖是生物體生長、發(fā)育、繁殖以及遺傳的基礎(chǔ)，增殖檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、腫瘤生物學(xué)、免疫學(xué)、藥理和藥代動力學(xué)等研究領(lǐng)域。流式細(xì)胞術(shù)是一門集現(xiàn)代激光技術(shù)、電子技術(shù)、生物學(xué)技術(shù)為一體的高通量細(xì)胞檢測技術(shù)。近年來，得益于激光技術(shù)的發(fā)展和熒光染料的開發(fā)，流式細(xì)胞術(shù)在已成為檢測細(xì)胞增殖的一種重要手段，能夠快速實(shí)現(xiàn)多參數(shù)多熒光指標(biāo)的檢測。本文就目前流式細(xì)胞檢測增殖常用的方法與技術(shù)進(jìn)行闡述。

1基于DNA含量的細(xì)胞增殖分析方法

1.1原理? 利用某些熒光染料具有與DNA發(fā)生特異性結(jié)合，且被DNA結(jié)合的熒光染料的量與DNA的含量成正比，即熒光強(qiáng)度與熒光直方圖的通道數(shù)成正比的原理，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測出處于G0/G1期，S期和G2/M期的細(xì)胞的比例。根據(jù)儀器的不同激光配置及實(shí)驗(yàn)需求，有多種熒光染料可供選擇。

1.2常用檢測法? 碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色法：單細(xì)胞懸液經(jīng)通透處理后，加入能夠與DNA結(jié)合的熒光染料，此時被染熒光物質(zhì)的量與DNA含量成正比，檢測到熒光信號的強(qiáng)度即可代表DNA含量，處于G0/G1期的細(xì)胞DNA含量為二倍體，處于G2/M期的細(xì)胞DNA含量為四倍體，S期細(xì)胞染色體含量介于二倍或四倍之間，所檢測的樣品中，處于S和G2/M期的細(xì)胞越多，說明細(xì)胞增殖越活躍。PI可由488 nm或561 nm激發(fā)光激發(fā)，發(fā)射光譜為610～620 nm，由于PI也與雙鏈RNA結(jié)合，所以在DNA含量檢測前應(yīng)對樣本進(jìn)行RNase消化處理，排除RNA對DNA熒光定量的影響。目前實(shí)驗(yàn)室絕大多數(shù)流式細(xì)胞儀配備有PI的檢測通道，因此PI的應(yīng)用十分廣泛[1-3]。其染色優(yōu)點(diǎn)為操作簡單，可通過一步染色法實(shí)現(xiàn)[4]，且CV值小，熒光穩(wěn)定，抗光漂白性良好。PI在使用過程中最大的限制就其光譜與其它染料的干擾問題，PI與常用染料藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）及PE檢測通道的染料光譜幾乎是重疊的，因此PI檢測周期的樣品中不能同時利用PE標(biāo)記其他指標(biāo)。若使用488 nm激光器激發(fā)PI，PI與異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC），綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）等染料也存在部分光譜重疊。

7-氨基-放線菌素D（7-Aminoactinomycin D，7-AAD）也是標(biāo)記DNA的染料，主要以插入方式與DNA鏈的G-C堿基對結(jié)合，激發(fā)波長約為580 nm，最大發(fā)射波長為640 nm。利用流式細(xì)胞儀488 nm或561 nm激光器激發(fā)均可得到良好的檢測效果[5]。7-AAD屬細(xì)胞膜非通透性染料，不能通過完整的細(xì)胞膜，在進(jìn)行DNA染色前需對細(xì)胞進(jìn)行75%冷乙醇固定處理，由于7-AAD是與DNA特異性結(jié)合，因此在染色過程中無需對樣品進(jìn)行RNase處理。7-AAD的發(fā)射波長較長，可與PE、FITC等常用流式染料同時使用較少發(fā)生光譜重疊。

DAPI和Hoechst33342是常用的DNA標(biāo)記染料，可以非嵌入方式與DNA鏈上的A-T堿基對特異性結(jié)合，二者光譜較為接近，激發(fā)光為355 nm，最大發(fā)射光為461 nm，利用流式細(xì)胞儀的351 nm紫外激光器激發(fā)效果最佳，對于未配備紫外激光器的儀器，405 nm激光器激發(fā)也可得到良好的效果[6]。DAPI和Hoechst33342屬膜通透性染料，細(xì)胞染色DNA無需乙醇固定，活細(xì)胞即可，推薦染色工作液濃度均為5～10 mg/ml，避光孵育30 min后上機(jī)檢測。對于配備有355 nm或405 nm激光器的流式細(xì)胞儀而言，利用DAPI和Hoechst33342 染色細(xì)胞DNA是良好的選擇。首先，二者均使用紫外或紫色激光器激發(fā)，與488 nm、561 nm、633 nm檢測通道上的熒光染料不存在或較少存在光譜重疊，容易實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的多指標(biāo)同時檢測;其次，由于DAPI和Hoechst33342對細(xì)胞膜具有通透性，可以標(biāo)記活細(xì)胞的DNA，因此是兩種可應(yīng)用于活細(xì)胞分選的細(xì)胞周期染料。

DRAQ5是可發(fā)射遠(yuǎn)紅外熒光的蒽醌類染料，激發(fā)光譜在很寬范圍內(nèi)，流式細(xì)胞儀配備的488 nm、561 nm、633 nm激光器均可對其有效激發(fā)，但以633 nm激發(fā)效果最佳，DRAQ5具有膜通透，可對活細(xì)胞和固定的細(xì)胞進(jìn)行DNA染色分析[7]，由于它主要和DNA雙鏈結(jié)合，和RNA的親和力小，因此染色過程中樣本無需RNase消化，利用633 nm激發(fā)光，670 nm發(fā)射光檢測DRAQ5標(biāo)記細(xì)胞周期時，可與FITC、PE、GFP等熒光素同時標(biāo)記較少發(fā)生光譜重疊。

1.3染色的結(jié)果分析? 以上所介紹的幾種染料，激發(fā)和發(fā)射光譜不同，但染色原理大致相同，都是根據(jù)染料的熒光道數(shù)與DNA含量成正比這一單一變量檢測，因此，只能根據(jù)DNA含量區(qū)分出G0/G1期，S期和G2/M期，而無法進(jìn)一步區(qū)分出DNA含量相同的G0和G1期，G2和M期。由于處于不同時相的細(xì)胞對藥物或處理會有不同的反應(yīng)，因此體外培養(yǎng)的細(xì)胞在進(jìn)行干預(yù)前應(yīng)進(jìn)行同步化處理，否則會影響實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性。細(xì)胞同步化的方法包括、短時間饑餓、照射、低溫法、藥物抑制等物理或化學(xué)方法，血清饑餓法因?qū)?xì)胞本身的干擾小且能夠獲得大量的G0/G1期細(xì)胞因此而最為常用[8-10]。此外，在檢測樣品的過程中還應(yīng)注意粘連體細(xì)胞的排除，兩個2C細(xì)胞粘連在一起，在流式細(xì)胞儀上檢測到的DNA的含量為4C，但由于兩個粘連細(xì)胞比單個細(xì)胞通過激光束的時間長，因此脈沖的寬度是大于單個細(xì)胞的，可以利用熒光通道的脈沖寬度信號W的差異進(jìn)行排除。

對于分析癌變細(xì)胞或腫瘤活檢組織的DNA含量時，通常引入DNA指數(shù)（DI）的概念，即（樣品G0/G1期細(xì)胞峰的平均熒光道數(shù)）/（正常二倍體細(xì)胞樣品G0/G1期細(xì)胞峰的平均熒光道數(shù)），理論上正常二倍體細(xì)胞DI=1，由于實(shí)際檢測存在變異系數(shù)，實(shí)際檢測到二倍體DI值為0.9～1.0，四倍體DI值為1.9～2.1，DI值對于臨床上腫瘤的診斷具有一定的參考價值?？梢允褂秒u紅細(xì)胞或正常人的淋巴細(xì)胞作對照來確定二倍體細(xì)胞[11]，市面上也有商品化的小雞紅細(xì)胞核（CEN）用于調(diào)節(jié)二倍體峰的位置。DNA含量的檢測結(jié)果通常利用周期分析軟件進(jìn)行S期劃定，一般2C峰和4C峰比較對稱，且變異系數(shù)CV較小結(jié)果比較準(zhǔn)確，若CV>8，則無法正確分析出各期細(xì)胞比例，目前市面上常用的周期分析軟件有Muticycle、ModitLT和Flowjo等，同樣樣品結(jié)果利用不同軟件分析各期比例無顯著性差異[12]。

2示蹤染料標(biāo)記法

2.1 BrdU和EdU摻入法? 5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU），是人工合成的胸腺嘧啶類似物，在DNA合成期（S期），BrdU能夠代替胸腺嘧啶而滲入正在復(fù)制的DNA分子中，用熒光標(biāo)記的BrdU抗體進(jìn)行染色，就可以標(biāo)記出處于增殖期的細(xì)胞，同時結(jié)合7-AAD進(jìn)行DNA染色，可清晰的將細(xì)胞區(qū)分出G0/G1期，S期和G2/M期[13]。BrdU/7-AAD雙參數(shù)法的優(yōu)勢在于S期的判定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果無需利用軟件分析即可區(qū)分各期細(xì)胞。在這個方案中，根據(jù)所用儀器的激光配置，可選擇BrdU與FITC或APC等不同熒光素連接的抗體，7-AAD也可被PI替代。目前BrdU有一大缺點(diǎn)，BrdU抗體分子較大，雙鏈DNA中的堿基對阻礙BrdU與抗體的結(jié)合，因此需將DNA雙鏈打開后，若DNA結(jié)構(gòu)打開不充分，BrdU與熒光抗體結(jié)合不佳，導(dǎo)致檢測到的熒光信號不能真實(shí)準(zhǔn)確的反映BrdU 的含量，為了能夠暴露BrdU的抗原表位，通常用高濃度的鹽酸，乙酸或酶解使得DNA變性，但這就破壞了DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，影響了其他染料的結(jié)合染色，導(dǎo)致染色彌散，準(zhǔn)確性降低等問題。5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）也是一種胸腺嘧啶核苷類似物，在細(xì)胞增殖時能夠插入正在復(fù)制的DNA分子中，EdU只有BrdU抗體大小的1/500，它與熒光素的結(jié)合一種被稱作“click”化學(xué)作用的Cu+催化的環(huán)加成作用，而非抗原抗體反應(yīng)。與傳統(tǒng)的免疫熒光染色比較，Edu反應(yīng)非?？焖?，且無需對DNA雙鏈變性，有效地避免了樣品損傷，檢測細(xì)胞增殖具有更高的靈敏度和更快的檢測速度，能在組織和細(xì)胞水平反映細(xì)胞增殖情況[14，15]。

2.2 CFSE標(biāo)記法? 羧基熒光素琥珀酰亞胺酯（carboxy fluorescein succinimidyl ester，CFSE）是目前應(yīng)用廣泛的一種檢測細(xì)胞增殖的染料，CFSE的前體羧基熒光二乙酸鹽素琥珀酰亞胺酯（carboxy fluorescein diactate succinimidyl ester，CFSE-SE）是沒有熒光的，但可自由透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞后，其乙酸基團(tuán)被胞內(nèi)酯酶切除后，可產(chǎn)生具有熒光的CFSE，CFSE不可逆地細(xì)胞內(nèi)的氨基結(jié)合偶聯(lián)到細(xì)胞蛋白質(zhì)上并且長時間存在于細(xì)胞內(nèi)。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖時，具有熒光的胞質(zhì)蛋白平均分配到兩個第二代細(xì)胞中，這樣與第一代細(xì)胞相比，其熒光強(qiáng)度便會減弱至一半，再次分裂后，第三代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度會比第二代再減弱一半，以此類推，細(xì)胞增殖代數(shù)越多，得到細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度相比第一代減弱更明顯，利用流式細(xì)胞儀488 nm激光激發(fā)，520 nm接收可檢測到細(xì)胞CFSE染色熒光，從而反映細(xì)胞的增殖情況。

CFSE探針多用于各種干細(xì)胞，淋巴細(xì)胞的增殖研究中[16，17]，可用于體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂跟蹤，也可用于注入動物器官內(nèi)觀測細(xì)胞體內(nèi)增殖。由于CFSE對細(xì)胞是有一定毒性作用的，因此，染色濃度及時間對細(xì)胞增殖、分化存在著影響。有研究指出，CFSE對細(xì)胞進(jìn)行染色時呈現(xiàn)濃度依賴型[18]，細(xì)胞的熒光隨著CFSE 染色終濃度升高而增強(qiáng)，但隨著染色濃度的增大，CFSE的細(xì)胞毒性也逐漸體現(xiàn)出來，在一定程度上可引起細(xì)胞的凋亡，不同種類的細(xì)胞CFSE的最佳標(biāo)記濃度有所區(qū)別，最佳的染色濃度是使父代細(xì)胞熒光強(qiáng)度比未染色細(xì)胞高3～3.5個數(shù)量級[19]。CFSE染色的持續(xù)時間也很重要，孵育時間過長，可增加細(xì)胞毒性[20]，體外培養(yǎng)細(xì)胞孵育時間一般控制在10 min內(nèi)，而后用40%體積的冷小牛血清終止標(biāo)記10 min后重懸細(xì)胞。此外，培養(yǎng)體系或緩沖液中若存在游離氨基酸，會與CFSE結(jié)合而影響其染色效果，因此推薦用PBS配制工作液。對于檢測結(jié)果的分析，可利用ModitLT軟件進(jìn)行增值代數(shù)的劃定或直接進(jìn)行細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度的比較。

3總結(jié)

細(xì)胞增殖的檢測時評估細(xì)胞功能的重要實(shí)驗(yàn)，相對常用的比色法MTT，CCK-8等，流式細(xì)胞術(shù)最大的優(yōu)勢在于多色，多參數(shù)的檢測，可以實(shí)現(xiàn)增殖和其他指標(biāo)的同時檢測，或混合樣品中特定細(xì)胞群體的增殖檢測。本文介紹的幾種增殖檢測試劑，染色原理不同，使用的激光檢測通道也有所差異，實(shí)驗(yàn)者可根據(jù)流式細(xì)胞儀激光配置及實(shí)驗(yàn)的具體方案進(jìn)行選擇。隨著多色流式檢測技術(shù)的不斷發(fā)展，從同一份樣本獲取更多的生物學(xué)信息是今后的必然趨勢。

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