添加不同表面活性劑對胞苷發(fā)酵的影響

趙貝貝，方海田*，劉慧燕，馬若霜，王茹，劉予煊，李金娜

1(寧夏食品微生物應(yīng)用技術(shù)與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川，750021) 2(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川，750021)

胞苷(cytidine)又稱胞嘧啶核苷、1-β-D-呋喃核苷胞嘧啶[1-2]，在生物體的生理生化過程中起著非常重要的作用[3-4]。以胞苷為原料的胞苷類似物作為臨床藥物應(yīng)用廣泛[3]，主要用于生產(chǎn)抗腫瘤、抗病毒藥物的中間體，是制造阿糖胞苷(Ara-CR)、環(huán)胞苷(Cyclo C)、三磷酸胞苷(CTP)等藥物的主要原料，也可作為核苷類功能食品配料[5-8]。目前胞苷的生產(chǎn)方法主要是添加前體物發(fā)酵法和直接發(fā)酵法，具有成本低、周期短、產(chǎn)量高等優(yōu)勢，近年來通過發(fā)酵法提高胞苷產(chǎn)量的研究逐漸增多。胞苷的發(fā)酵單位與菌體細(xì)胞膜的滲透性存在密切關(guān)系[9]。發(fā)酵過程中添加表面活性劑能提高細(xì)胞膜的通透性，減少營養(yǎng)物質(zhì)和氧進(jìn)入細(xì)胞的傳遞阻力，從而提高發(fā)酵過程中目的代謝物的產(chǎn)量[10-11]。LIANG等[12]研究發(fā)現(xiàn)添加16 g/L Tween-80改變了根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞膜的精細(xì)結(jié)構(gòu)，增加了細(xì)胞膜通透性，使凝膠多糖的產(chǎn)量明顯提高。SHENG等[13]研究了Tween-80對普魯蘭多糖產(chǎn)生、細(xì)胞生長、葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶活性和脂肪酸組成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tween-80的添加對生物量沒有影響，可顯著提高普魯蘭多糖的產(chǎn)量；GALINDO等[14]發(fā)現(xiàn)添加Triton X-100的發(fā)酵體系中溶氧量明顯高于對照，黃色素的產(chǎn)率提高了1.45倍。研究發(fā)現(xiàn)，Triton X-100可誘導(dǎo)提高竹紅菌素的產(chǎn)量且能明顯縮短了發(fā)酵時間[15-16]；溫琦等[17]添加陽離子型表面活性劑CTAB使透明質(zhì)酸產(chǎn)量提高了20%。目前國內(nèi)外有關(guān)表面活性劑對發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量影響的報道較多，但在表面活性劑對胞苷發(fā)酵影響方面的研究尚未見報道。

本文主要選擇了Tween-80、TritonX-100、十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium broxide,CTAB)和乙胺丁醇二鹽酸鹽(ethambutol dihydrochloride,EMB)4種表面活性劑作為胞苷發(fā)酵的促進(jìn)劑，在搖瓶條件下研究了4種表面活性劑對細(xì)菌生長、耗糖速率和胞苷發(fā)酵單位的影響，為進(jìn)一步提高胞苷發(fā)酵產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株：大腸桿菌EscherichiacoliBG-12為本實驗室保藏。

試劑：蛋白胨、酵母粉、NaCl、瓊脂、Tween-80、CTAB、EMB、Triton X-100等均為市售分析純。

1.2 培養(yǎng)基

斜面活化培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，瓊脂20，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，(NH4)2SO42，NaCl 10，葡萄糖5，pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌15 min。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100，玉米漿40，K2HPO410，KH2PO40.5，F(xiàn)eSO410 mg，MnSO410 mg，MgSO4400 mg，pH 7.0～7.2，苯酚紅(0.1%)20 mL/L，115 ℃滅菌15 min，0.5% CaCO3(單獨滅菌)。

1.3 主要儀器

LRH-150-B型生化培養(yǎng)箱，廣東省醫(yī)療器械廠；BSD-WX2200臥式智能精密型搖床，上海博迅實業(yè)有限公司；UV-752N分光光度計，上海精科實業(yè)有限公司；SBA-40E生物傳感分析儀，山東省科學(xué)院生物研究所；LC-16型島津液相色譜儀，北京島津醫(yī)療器械有限公司。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 菌種活化

取保藏菌種劃線接種于斜面培養(yǎng)基，37 ℃恒溫靜置過夜培養(yǎng)。

1.4.2 種子培養(yǎng)

從活化斜面上取一環(huán)生長狀況良好的菌種轉(zhuǎn)接到裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶裝液量，9層紗布封口，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上(200 r/min)振蕩培養(yǎng)12 h。

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)

吸取5.0 mL培養(yǎng)好的種子發(fā)酵液至裝有45 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL擋板三角瓶中，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)40 h。

1.4.4 表面活性劑溶液的配制

將Tween-80配制為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.0%的溶液待用；將TritonX-100、CTAB、EMB配制為10 mg/mL的母液，在無菌條件下，以不同添加濃度，吸取相應(yīng)的表面活性劑母液于10 h時添加到發(fā)酵液中。表面活性劑的添加量如表1所示。

表1 不同種類表面活性劑的添加量Table 1 The addition of different kinds of surfactants

1.5 分析方法

1.5.1 菌體量測定方法

分別取不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液，用蒸餾水稀釋20倍，采用752型分光光度計于600 nm處測其吸光值。

1.5.2 葡萄糖質(zhì)量濃度的測定

取不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液，稀釋發(fā)酵液到其中葡萄糖質(zhì)量濃度為0～1 g/L，采用SBA-40C生物傳感分析儀測定。

1.5.3 胞苷產(chǎn)量測定

取不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液13 000 r/min離心5 min，取上清液采用高效液相色譜儀測定發(fā)酵液中胞苷產(chǎn)量。色譜條件為：色譜柱Agilent C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流動相V(乙腈)∶V(水)=4∶96，流速為1.0 mL/min，檢測波長為270 nm，柱溫30 ℃，檢測器為紫外檢測器。

2 結(jié)果與討論

2.1 添加Tween-80對胞苷發(fā)酵的影響

在發(fā)酵過程中，添加不同質(zhì)量濃度的Tween-80對胞苷產(chǎn)量、菌體生長及耗糖速度的變化進(jìn)行了分析。結(jié)果如圖所示。由圖1可以看出不同質(zhì)量濃度的Tween-80質(zhì)量對菌體的生長影響不大。當(dāng)Tween-80濃度為5 g/L時，菌株生長最快，3 g/L時生長最慢，說明較高質(zhì)量濃度的Tween-80沒有抑制菌株的生長。

圖1 不同質(zhì)量濃度Tween-80下的菌株生長曲線Fig.1 Growth curve of strain Tween-80 with different concentration

由圖2可以看出，菌株的耗糖速率是呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在0～20 h由于菌株進(jìn)入對數(shù)生長期，生長迅速耗糖速率不斷增加，20 h后可能由于菌株的生長不以葡萄糖為直接的營養(yǎng)物質(zhì)，消耗葡萄糖逐漸減慢，在38 h后葡萄糖的消耗又逐漸增多，由于發(fā)酵液中其他營養(yǎng)物質(zhì)的消耗或其他物質(zhì)又轉(zhuǎn)化為葡萄糖為菌株代謝所用。對比發(fā)現(xiàn)不添加Tween-80的發(fā)酵液葡萄糖的消耗速率整體最快，在20 h為0.875 g/(L·h)，為添加5 g/L Tween-80的1.86倍，而添加5 g/L Tween-80的耗糖速率整體最慢，可能是高濃度的Tween-80可以促進(jìn)其他營養(yǎng)物質(zhì)的消耗，減少對葡萄糖的消耗速率。總體來說，Tween-80的添加可以降低菌株對葡萄糖的消耗速率。而菌體密度與耗糖速率呈現(xiàn)相反的變化趨勢，說明添加Tween-80菌株的生長與葡萄糖的消耗不是線性關(guān)系，在發(fā)酵液中菌株的生長不以葡萄糖為最主要的營養(yǎng)物質(zhì)。

圖2 不同質(zhì)量濃度Tween-80下的菌株耗糖速率曲線Fig.2 Curve of sugar consumption rate of strain Tween-80 with different concentration

由圖3可知，發(fā)酵40 h過程中胞苷的產(chǎn)量隨時間呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢。在發(fā)酵20 h后胞苷產(chǎn)生速度加快開始大量積累，當(dāng)Tween-80添加量為1～4 g/L時，都有助于胞苷的產(chǎn)生積累，添加量為3 g/L時，胞苷的積累遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對照組。添加量為5 g/L時，則胞苷的產(chǎn)量明顯低于其他實驗組。

圖3 不同質(zhì)量濃度Tween-80對胞苷發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of different concentrations of Tween-80 on cytidine fermentation

發(fā)酵40 h結(jié)束后，添加不同濃度的Tween-80的胞苷產(chǎn)量如圖4所示。

圖4 不同質(zhì)量濃度Tween-80對胞苷發(fā)酵40 h產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of Tween-80 on 40 h production by cytidine fermentation

可知，適量Tween-80的添加有助于胞苷產(chǎn)量的提高。其中，Tween-80最適添加量為3 g/L，其產(chǎn)量為1.696 g/L是對照組的2.42倍，高濃度的Tween-80則抑制了胞苷的產(chǎn)量。另外，添加Tween-80時葡萄糖的消耗速率越快則胞苷的產(chǎn)量越多，因此可以用葡萄糖的消耗速率衡量胞苷產(chǎn)量的高低。

非離子表面活性劑Tween-80對菌體的生長影響較小，對菌體的傷害不明顯。有文獻(xiàn)報道添加0.1～10 g/L的表面活性劑對微生物生長的抑制作用較小[18-19]，本實驗也得到相同的結(jié)果。另外，營養(yǎng)培養(yǎng)基中存在Tween-80不影響細(xì)胞生長，Tween-80不是屎腸球菌ATCC 31749的營養(yǎng)物[20]，這與本實驗的結(jié)果一致。添加Tween-80可以微弱降低對葡萄糖的消耗速率，可能原因是Tween-80改變了細(xì)胞膜的通透性，從而使發(fā)酵培養(yǎng)基中其他營養(yǎng)物質(zhì)的吸收增加，改變了菌株對培養(yǎng)基中物質(zhì)的吸收分解代謝通路的變化。當(dāng)Tween-80的質(zhì)量濃度高于4 g/L時，胞苷的產(chǎn)量就會迅速降低，可能與葡萄糖的消耗速率較低和菌株本身的性質(zhì)有關(guān)，在大于4 g/L濃度時不利于該菌株向合成代謝物胞苷的方向移動。

2.2 TritonX-100對胞苷發(fā)酵的影響

選擇TritonX-100的質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 g/L。TritonX-100對菌體生長、葡萄糖耗糖速率、胞苷產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖5～圖8所示。

由圖5可知，不同濃度TritonX-100對菌株生長有一定的影響。在適宜的濃度范圍內(nèi)，TritonX-100可以促進(jìn)菌株的生長。在TritonX-100質(zhì)量濃度大于0.8 g/L時菌株的生長將受到抑制，且濃度越大抑制作用越強。

圖5 不同質(zhì)量濃度TritonX-100下的菌株生長曲線Fig.5 Growth curve of strain TritonX-100 with different concentration

由圖5、圖6可知，不同濃度TritonX-100對菌株耗糖速率和菌體生長呈相同的變化趨勢，在一定的濃度范圍內(nèi)，低濃度促進(jìn)高濃度則抑制。在20 h時，各菌株的耗糖速率均達(dá)到最大，當(dāng)TritonX-100為0.8 g/L，20 h的耗糖速率為0.915 g/(L·h)，為對照組的1.05倍。

圖6 不同質(zhì)量濃度TritonX-100下的菌株耗糖速率曲線Fig.6 Curve of sugar consumption rate of strain TritonX-100 at different concentrations

由圖7、圖8可見，添加0.4～2.0 g/L的TritonX-100均抑制胞苷的產(chǎn)生。胞苷產(chǎn)量隨發(fā)酵時間逐漸增多，在發(fā)酵25 h后胞苷的積累速度加快。當(dāng)TritonX-100添加濃度為1.6 g/L時，其胞苷產(chǎn)量較大，發(fā)酵40 h胞苷產(chǎn)量最高為0.362 g/L，是對照組的0.52倍，而該濃度的菌體生長和耗糖速率均較低，即1.6 g/L的TritonX-100對菌株的生長有影響，但對胞苷的胞外分泌量的抑制作用最弱。

圖7 不同質(zhì)量濃度TritonX-100對胞苷發(fā)酵的影響Fig.7 Effect of different concentrations of TritonX-100 on cytidine fermentation

圖8 不同質(zhì)量濃度TritonX-100對胞苷發(fā)酵40 h產(chǎn)量的影響Fig.8 Effects of different concentrations of TritonX-100 on 40 h production by cytidine fermentation

TritonX-100的添加對菌體的生長有一定的影響，呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)高濃度抑制的現(xiàn)象。低質(zhì)量濃度(小于1.2 g/L)的TritonX-100促進(jìn)菌體的生長，當(dāng)TritonX-100質(zhì)量濃度在0.8 g/L時，菌體生長最快，明顯優(yōu)于對照組。TritonX-100的添加對菌株葡萄糖的耗糖速率和菌體生長呈現(xiàn)一致的變化趨勢，說明添加TritonX-100使菌株的生長主要依賴于葡萄糖。當(dāng)添加TritonX-100的質(zhì)量濃度為0.8 g/L時，菌體生長和耗糖速率均較低，而胞苷產(chǎn)量比其他添加組較高，說明添加TritonX-100對產(chǎn)物胞苷的積累有影響，使胞苷的合成不以葡萄糖為主要的營養(yǎng)物質(zhì)。

2.3 添加CTAB對胞苷發(fā)酵的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度分別為0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 mg/L的CTAB，考察其對菌體生長、葡萄糖耗糖速率、胞苷產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖9～圖12所示。

由圖9、圖10可知，CTAB在0.4～2 mg/L時，對菌株的生長和耗糖速率影響不大，且在該濃度范圍內(nèi)，菌株的生長和耗糖速率呈相同的變化趨勢。

圖9 不同質(zhì)量濃度CTAB下的菌株生長曲線Fig.9 Growth curve of strain CTAB with different concentration

圖10 不同質(zhì)量濃度CTAB下的菌株耗糖速率曲線Fig.10 Curve of sugar consumption rate of strain CTAB with different concentration

由圖11、圖12可知，添加0.4～2 mg/L的CTAB，與對照組相比，均抑制了胞苷的產(chǎn)生。在該濃度范圍內(nèi)菌株生長和耗糖速率均與對照組相差不大，而胞苷產(chǎn)量明顯減少，說明添加CTAB不利于胞苷的積累。有研究也表明添加各種表面活性劑對微生物的毒性不同，一般來說陽離子表面活性劑對生物的毒性較大[21]。本試驗也證明添加CTAB對大腸桿菌BG-12的生長和耗糖速率影響不大，但對發(fā)酵產(chǎn)胞苷是不利的。

圖11 不同質(zhì)量濃度CTAB對胞苷發(fā)酵的影響Fig.11 Effect of different concentrations of CTAB on cytidine fermentation

圖12 不同濃度CTAB對胞苷發(fā)酵40 h產(chǎn)量的影響Fig.12 Effects of different concentrations of CTAB on 40 hour production by cytidine fermentation

由圖11和圖12可知，添加CTAB的質(zhì)量濃度在0.4～2 mg/L，對菌體的生長、葡萄糖消耗速率影響不大且均有一定的促進(jìn)作用，說明添加CTAB時，菌株的生長主要依賴于葡萄糖的消耗。隨著添加CTAB的質(zhì)量濃度的增加，胞苷的發(fā)酵抑制加強幾乎停止。一般來說，陽離子表面活性劑對生物的毒性較大[21-22]。實驗結(jié)果表明，添加質(zhì)量濃度0.4～2 mg/L的CTAB對大腸桿菌BG-12的生長速率、葡萄糖的耗糖速率影響不大，但對代謝產(chǎn)物胞苷的積累產(chǎn)生明顯的抑制作用。

2.4 添加EMB對胞苷發(fā)酵的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20和25 mg/L的EMB，考察其對菌體生長、葡萄糖耗糖速率、胞苷產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖13～圖16所示。

由圖13、圖14可知，添加EMB質(zhì)量濃度為5～25 mg/L，對菌株生長和耗糖速率影響不大。

圖13 不同質(zhì)量濃度EMB下的菌株生長曲線Fig.13 Growth curve of strain EMB with different concentration

圖14 不同質(zhì)量濃度EMB下的菌株耗糖速率曲線Fig.14 Curve of sugar consumption rate of strain EMB with different concentration

由圖15、圖16可以看出，添加EMB均抑制了胞苷的產(chǎn)量。說明添加EMB對胞苷產(chǎn)量的積累是有害的。

圖15 不同質(zhì)量濃度EMB對胞苷發(fā)酵的影響Fig.15 Effect of different concentrations of EMB on cytidine fermentation

圖16 不同濃度EMB對胞苷發(fā)酵40 h產(chǎn)量的影響Fig.16 Effects of different concentrations of EMB on 40 hour production by cytidine fermentation

在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入不同質(zhì)量濃度的EMB，大腸桿菌BG-12發(fā)酵產(chǎn)胞苷均較空白試驗有不同程度的抑制作用；從菌體生長曲線、葡萄糖的耗糖速率可以看出，加入一定質(zhì)量濃度的EMB對菌株生長和耗糖影響不大，菌體的生長還是主要依賴于葡萄糖的消耗。

綜合比較認(rèn)為，添加Tween-80的效果較好，可將胞苷產(chǎn)量最多提高2.42倍。

2.5 表面活性劑對胞苷產(chǎn)量的影響

利用SPSS分析軟件對添加不同種類和含量的4種表面活性劑的胞苷產(chǎn)量進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2。

表2 添加不同種類表面活性劑對胞苷產(chǎn)量的組統(tǒng)計量Table 2 Group statistics of cytidine production with different surfactants

從表2可以看出，Tween-80、CTAB和EMB的P值均小于0.05，表示有統(tǒng)計學(xué)差異，說明添加不同濃度的表面活性劑可以影響菌株BG-12的胞苷產(chǎn)量，有效影響菌株BG-12胞苷的生物合成量，為添加表面活性劑對胞苷合成奠定了基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

非離子表面活性劑Tween-80可在一定添加量范圍內(nèi)有利于胞苷發(fā)酵單位的提高。Tween-80添加量在1～5 g/L時，對菌體的生長影響不大；對葡萄糖的耗糖速率均有所下降，發(fā)酵20 h時耗糖速率均達(dá)到最大，且添加量為5 g/L時耗糖速率僅為對照組的0.54倍；添加量在1～4 g/L時，均有促進(jìn)胞苷發(fā)酵單位的提高，其中，Tween-80最適添加量在3 g/L，發(fā)酵40 h時其產(chǎn)量為1.696 g/L，是對照組的2.42倍。

TritonX-100對菌株生長和耗糖速率均有一定的影響，當(dāng)添加量大于0.8 g/L會抑制菌株的生長和耗糖速率，濃度越大抑制作用越強，在20 h時，添加2.0 g/L TritonX-100，耗糖速率僅為對照組的0.59倍；當(dāng)TritonX-100添加質(zhì)量濃度為1.6 g/L時，胞苷產(chǎn)量為0.362 g/L，是對照組的0.52倍。添加0.4～2 mg/L 質(zhì)量濃度的CTAB和5～25 mg/L的EMB，對菌株生長和耗糖速率影響不大，在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均抑制胞苷的積累，可見CTAB和EMB對胞苷發(fā)酵是不利的。

不同類型的表面活性劑性質(zhì)不同，對微生物的生長及代謝產(chǎn)物的積累亦不同。非離子表面活性劑Tween-80對菌體生長的影響較弱，但對胞苷的積累有較大的影響，當(dāng)添加3 g/L發(fā)酵40 h時其產(chǎn)量達(dá)到最大。可能原因是添加表面活性劑Tween-80可以增加細(xì)胞膜的通透性，減少氧及營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的傳遞阻力，改善發(fā)酵體系的供氧能力。非離子表面活性劑TritonX-100，該菌種對其比較敏感，加入劑量在0.4～2 g/L均抑制胞苷的積累。對于添加表面活性劑TritonX-100、CTAB和EMB均抑制胞苷的積累，可能是由于在加入表面活性劑后，在菌體表面進(jìn)行了沉積和結(jié)合，改變了細(xì)胞的通透性降低氧傳遞，從而減弱發(fā)酵體系的供氧能力同時增加了代謝產(chǎn)物的副反饋作用，使代謝產(chǎn)物胞苷的積累大大減少。綜合分析造成以上結(jié)果的原因可能在于，不同的表面活性劑，因其不同的結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)，當(dāng)其干擾大腸桿菌BG-12細(xì)胞膜合成，造成細(xì)胞膜滲漏、缺失等效果，會產(chǎn)生不同的影響效果。本實驗研究表明，添加適合濃度的表面活性劑對于胞苷發(fā)酵單位的提高有一定的促進(jìn)作用，但是濃度過高時產(chǎn)量將受到抑制，這可能是表面活性劑濃度過高，對菌體造成傷害，導(dǎo)致代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量下降。本試驗中在最適的添加濃度下，Tween-80添加后胞苷產(chǎn)量提高2.42倍，且Tween-80對菌體的生長影響不大，表現(xiàn)出添加Tween-80優(yōu)于TritonX-100。Tween-80、TritonX-100同屬非離子型表面活性劑也因其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和濃度的不同，而影響大腸桿菌BG-12的發(fā)酵代謝，其中Tween-80表現(xiàn)出高濃度抑制、低濃度促進(jìn)的現(xiàn)象。在發(fā)酵液中添加Tween-80，減少胞苷在細(xì)胞內(nèi)的沉積，從而促進(jìn)胞苷發(fā)酵單位的提高。