不同類型花椰菜硫代葡萄糖苷組分與含量分析

丁云花 宋曙輝 趙學(xué)志 王文琪 何洪巨

（北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，農(nóng)業(yè)部華北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，蔬菜種質(zhì)改良北京市重點實驗室，北京 100097）

花 椰 菜（Brassica oleraceaL. var.botrytisL.）是我國重要的十字花科蕓薹屬甘藍(lán)類蔬菜，至2011年全球花椰菜總收獲面積為120.95萬hm2，其中我國收獲面積達(dá)44.65萬hm2，占36.92%，居世界第一位，成為世界第一大花椰菜生產(chǎn)國和消費(fèi)國（李文萍 等，2014）。十字花科作物中含有一類重要的次生代謝物質(zhì)——硫代葡萄糖苷（Glucosinolates，簡稱硫苷），它的降解產(chǎn)物具有多種生物學(xué)功能，不僅能有效預(yù)防和控制肺癌、大腸癌、乳腺癌、胰腺癌等多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展，對植物防御反應(yīng)、預(yù)防和控制植物病害、調(diào)節(jié)生長素代謝、增強(qiáng)植物抗逆性等都有非常重要的作用（Oginsky et al.，1965；Bradfield & Bjeldanes，1984；Guo et al.，1992；Zhang et al.，1994；Tawfiq et al.，1995；Siemens & Mitchell-Olds，1996；Fahey & Talalay，1999；Hashem & Saleh，1999；Lin et al.，2000；Kliebenstein et al.，2002）。 因 此， 近年來十字花科作物中硫苷的組分、含量成為研究熱點。何洪巨等（2002）對十字花科蕓薹屬中白菜類、芥菜類、甘藍(lán)類蔬菜的硫苷組成與含量進(jìn)行了比較分析，結(jié)果表明甘藍(lán)類蔬菜中硫苷含量最高，白菜類蔬菜最低。孫秀波等（2007）對十字花科白菜類、甘藍(lán)類、芥菜類、蘿卜類蔬菜的硫苷含量進(jìn)行了測定，結(jié)果表明甘藍(lán)類蔬菜中硫苷含量最高，是白菜類和芥菜類蔬菜的10倍，是蘿卜類蔬菜的15倍。

目前關(guān)于甘藍(lán)、青花菜等甘藍(lán)類蔬菜硫苷種類、含量及生物活性等相關(guān)研究的報道很多（Zhang et al.，1992；Fahey et al.，1997；Famham et al.，2000；Vallejo et al.，2002；季宇彬 等，2007；鄒翔 等，2007；弓志青 等，2011；姚雪琴 等，2011；董莉 等，2012），但有關(guān)花椰菜硫苷方面的研究報道卻很少見。然而，由于引進(jìn)歷史的長短和消費(fèi)習(xí)慣的不同，我國花椰菜的栽培面積和消費(fèi)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過青花菜，僅次于甘藍(lán)；而且近些年隨著松花菜消費(fèi)需求的猛增（顧宏輝 等，2012），我國花椰菜的生產(chǎn)面積和消費(fèi)量逐年遞增。因此，研究不同類型花椰菜中硫苷的組分和含量對于其品種和資源評價，靶向性選育富含某種硫苷的品種，開發(fā)保健型蔬菜具有十分重要的意義。

以往的研究表明，由于長期以來新品種選育大多沿著提高產(chǎn)量和改良味道的方向進(jìn)行選擇，導(dǎo)致甘藍(lán)類蔬菜種內(nèi)硫苷含量和種類也存在較大的差異。Gland等分析的367個B. oleracea材料中，不僅硫苷總量的變異范圍非常大（1～200 μmol·g-1），而且硫苷的種類也不相同，有的是黑芥子硫苷酸鉀型，有的卻有著非常高的甲狀腺素比例（傅廷棟，1982）。由此可以推斷，花椰菜的硫苷種類和含量在不同品種之間也會存在一定的差異。本試驗針對目前種植最廣泛、消費(fèi)最流行的3類花椰菜：松花菜、緊花菜和紫花菜品種的硫苷組分和含量進(jìn)行比較分析，旨在為花椰菜品種和資源的營養(yǎng)評價及開發(fā)保健型新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的15個花椰菜品種均由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供，其中5個松花菜品種分別為慶農(nóng)90、慶農(nóng)80、京松85、京松75、京松65；5個緊花菜品種分別為津品70、京研60、雪寶、城場120、改良雪球；5個紫花菜品種分別為紫花1 號、紫花2號、紫花3號、紫花4號、紫花5號。

所有品種均于2015年1月5日播種，3月25日定植于本中心農(nóng)場，采用露地平畦栽培，株距50 cm，行距50 cm，隨機(jī)排列，3次重復(fù)，每重復(fù)30株。6月8日采收商品球，進(jìn)行硫苷含量測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 硫苷的提取 硫苷提取參考何洪巨等（2002）的方法，并做適當(dāng)修改。取新鮮花球，分割成小塊，真空冷凍干燥。稱取冷凍干樣0.2 g于15 mL離心管中，加入0.25 mL內(nèi)標(biāo)苯甲基硫苷和5 mL 預(yù)熱的 100% 甲醇，80 ℃水浴 20 min，每隔 4～5 min 渦旋 1 次。3 000 r·min-1離心 10 min，取上清液，倒入另1個15 mL離心管中，冰浴保存；沉淀物繼續(xù)用70%甲醇重復(fù)離心2次，合并上清液。取2 mL上清液，過DEAE離子交換柱（規(guī)格：A-25），然后用 0.02 mol·L-1醋酸鈉溶液 2 mL 沖洗柱子。把柱子轉(zhuǎn)移至另1個玻璃試管中，加入75 μL硫酸醋酶溶液，封口過夜。將過夜的柱子用0.5 mL雙蒸水洗滌3次，洗出液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，冷凍保存，待測。

1.2.2 硫苷的分析 采用HPLC分析法，分析條件：SHIMADZU-LC-20AD高效液相色譜系統(tǒng)，LC-20AD型梯度洗脫泵，SPD-20A型紫外檢測器，檢測波長 229 nm。采用 Waters C18色譜柱（3.9 mm×150 mm，4 μm）， 柱 溫 25 ℃， 進(jìn) 樣 量 10 μL；流動相A為0.05%四甲基氯化銨，流動相B為0.05%四甲基氯化銨（雙蒸水∶乙睛=4V∶1V），按表1進(jìn)行梯度洗脫，在31 min內(nèi)可使硫苷全部分離；流動相流速為1.0 mL·min-1。

表1 脫硫硫代葡萄糖苷的HPLC梯度洗脫條件

以苯甲基硫苷為內(nèi)標(biāo)，根據(jù)保留時間和峰面積對花椰菜硫苷組分進(jìn)行定量測定。利用內(nèi)標(biāo)和響應(yīng)因子計算硫苷含量，單位為 μmol·g-1（FW）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同花椰菜品種的硫苷組分及含量

從表2可以看出，15個花椰菜品種中均檢測到9種硫苷，分別為：3-甲基硫氧烯丙基硫苷（Glucoiberin，IBE）、2-羥基-3-丁烯基硫苷（Progoitrin，PRO）、2-丙 烯 基 硫 苷（Sinigrin，SIN）、4-甲基硫氧丁基硫苷（Glucoraphanin，RAA）、3-丁烯基硫苷（Gluconapin，NAP）、4-羥基吲哚基-3-甲基硫苷（4-Hydroxyglucobrassicin，4OH）、3-甲 基 吲 哚 基 硫 苷（Glucobrassicin，GBC）、4-甲 氧 基 吲 哚 基-3-甲 基 硫 苷（4-Methoxyglucobrassicin，4ME）、1-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷（Neoglucobrassicin，NEO），前5種屬于脂肪族硫苷，后4種屬于吲哚族硫苷〔根據(jù)側(cè)鏈R基團(tuán)的不同，硫苷可以分為脂肪族、吲哚族和芳香族3類（Mithen，2001）〕。

15個花椰菜品種的吲哚族硫苷總含量均比脂肪族硫苷總含量高，分別占總硫苷含量的84.49%和15.51%。其中，NEO含量最高，占總硫苷含量的42.61%；其次是GBC，占總硫苷含量的35.02%；RAA和4OH含量較低，僅占總硫苷含量的0.14%和0.05%。說明花椰菜中所含的硫苷以吲哚族為主，其中NEO和GBC是最主要的2種硫苷組分。

表2 不同花椰菜品種的硫苷組分及含量 μmol·g-1（FW）

2.2 不同花椰菜品種的總硫苷含量

圖1顯示，15個花椰菜品種的總硫苷含量存在較大差異，含量最高的是紫花1號，為4.872 8 μmol·g-1（FW）；最低的是城場 120，僅為 0.332 3 μmol·g-1（FW）；前者是后者的14.7倍?？偭蜍蘸枯^高的品種還有紫花4號、紫花2號、京松75、京松 85，分別為 2.533 2、2.422 1、1.968 7、 1.966 7 μmol·g-1（FW）；總硫苷含量較低的品種有慶農(nóng) 80〔0.488 9 μmol·g-1（FW）〕和津品 70 〔0.561 5 μmol·g-1（FW）〕。

圖1 不同花椰菜品種的總硫苷含量

按松花菜、緊花菜和紫花菜3個類型進(jìn)行分析，紫花菜的總硫苷含量最高，松花菜其次，緊花菜相對偏低，總硫苷含量范圍分別為0.947 1～ 4.872 8 μmol·g-1（FW）、0.488 9～1.968 7 μmol·g-1（FW）和0.332 3～0.688 7 μmol·g-1（FW）。

2.3 不同花椰菜品種的脂肪族硫苷含量

圖2顯示，15個花椰菜品種的脂肪族硫苷總含量存在較大差異，變異范圍在0.077 0～0.637 2 μmol·g-1（FW）之間。其中含量較高的是紫花菜類型的紫花1號、紫花3號、紫花4號，以及松花菜類型的京松 85，分別為 0.637 2、0.421 0、0.345 0、 0.312 0 μmol·g-1（FW）；含量較低的是緊花菜類型的改良雪球、城場120、津品70，分別為0.077 0、0.078 0、0.096 0 μmol·g-1（FW）。

圖2 不同花椰菜品種的脂肪族硫苷含量

在5種脂肪族硫苷中，IBE含量明顯高于其他4種，占脂肪族硫苷總含量的58.20%；RAA含量最低，僅占脂肪族硫苷總含量的0.93%（表2）。

2.4 不同花椰菜品種的吲哚族硫苷含量

圖3顯示，15個花椰菜品種的吲哚族硫苷總含量也存在較大差異，變異范圍在0.254 3～4.235 6 μmol·g-1（FW）之間。其中含量較高的是紫花菜類型的紫花1號、紫花4號、紫花2號，以及松花菜類型的京松 75、京松 85，分別為 4.236 5、2.188 2、 2.147 1、1.773 7、1.654 7 μmol·g-1（FW）； 含 量較低的是緊花菜類型的城場120和松花菜類型的慶農(nóng) 80，分別為 0.254 3、0.376 9 μmol·g-1（FW）。

圖3 不同花椰菜品種的吲哚族硫苷含量

在4種吲哚族硫苷中，NEO和GBC含量較高，分別占吲哚族硫苷總含量的50.44%和41.45%；而4OH含量極低，僅占吲哚族硫苷總含量的 0.06%（表 2）。

3 結(jié)論與討論

松花菜、緊花菜和紫花菜是目前生產(chǎn)和市場上最流行的3類花椰菜，本試驗針對這3類花椰菜進(jìn)行了硫苷組分及含量的測定與分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)花椰菜中檢測到的硫苷種類與甘藍(lán)相同，均為5種脂肪族硫苷IBE、PRO、SIN、RAA、NAP和4種吲哚族硫苷4OH、GBC、4ME、NEO；但主要硫苷組分與甘藍(lán)不完全相同，花椰菜中最主要的2種硫苷成分是NEO和GBC，而甘藍(lán)中的硫苷以IBE、SIN和GBC為主要成分（胡麗萍 等，2015）。同為甘藍(lán)類蔬菜，青花菜中的硫苷以RAA、GBC和NEO為主（丁云花 等，2015），芥藍(lán)中的硫苷以NAP、GBC和NEO為主（司雨 等，2009）。說明在十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的不同變種間，硫苷的主要成分和含量存在差異；但在已報道的不同種類的甘藍(lán)類蔬菜中，GBC都是主要的硫苷成分。GBC是一種有益硫苷，其水解可以產(chǎn)生3-吲哚甲醇，它可以提高生物體苯酮還原酶的水平，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖（Weng et al.，2008）。

在不同類型的花椰菜之間，無論是脂肪族硫苷還是吲哚族硫苷，多數(shù)紫花菜類型的含量明顯高于松花菜和緊花菜這兩類白色花椰菜，說明紫花菜是花椰菜中的高硫苷資源，這在以往的文獻(xiàn)中尚未見報道。在不同品種之間，3類花椰菜的總硫苷含量都存在較大的變異，紫花菜〔0.947 1～ 4.872 8 μmol·g-1（FW）〕 和 松 花 菜〔0.488 9～ 1.968 7 μmol·g-1（FW）〕的變異范圍大于緊花菜〔0.332 3～0.688 7 μmol·g-1（FW）〕，這可能是由于緊花菜栽培歷史長，長期的人工選擇導(dǎo)致其遺傳變異范圍變窄。這個規(guī)律是否存在，還有待于擴(kuò)大群體樣本量后進(jìn)一步研究證實。但從本試驗結(jié)果來看，緊花菜類型的總硫苷含量普遍較低，而松花菜中有相對較高含量的品種，可以初步推斷在松花菜中或許有高硫苷含量的資源，這點值得引起花椰菜育種工作者的注意。

總硫苷含量的高含量對于低含量為顯性。法國學(xué)者M(jìn)olice認(rèn)為春油菜Bronowski的低硫苷含量是受3對隱性基因控制的，對于不同種類的硫苷的分離比例則相當(dāng)復(fù)雜；Kondra和Stefansson認(rèn)為3個位點控制的葡萄糖苷高含量對于低含量為部分顯性，被4個或5個位點控制的蕓薹葡萄糖苷高含量對于低含量為超顯性，被4個位點控制的甲狀腺素高含量對于低含量為部分顯性；控制3種主要硫苷的基因系統(tǒng)不是彼此獨立的（傅廷棟，1982；劉后利，1985）。因此，硫苷含量主要是由加性基因控制的，可以通過遺傳基因重組的育種手段改良某個品種的總硫苷含量或者培育高硫苷含量的品種。由于環(huán)境條件對硫苷含量有一定的影響，因而進(jìn)行遺傳選擇時必須注意環(huán)境條件的一致性。

硫苷雖然具有防癌、抗癌、抗氧化等多種對人類身體健康有益的功能，但其種類多，不是所有硫苷都對人體有益，如PRO是致甲狀腺腫素5-乙烯唑烷 -2- 硫酮的前體（Heaney & Fenwick，1995）。所以，從營養(yǎng)健康角度，希望蔬菜中含有的有益硫苷含量越高越好；從育種角度，應(yīng)該把提高某個品種的有益硫苷含量作為努力目標(biāo)。在蕓薹屬蔬菜中，目前已被證實的有益硫苷有RAA、4OH、GBC、4ME、NEO等，本試驗結(jié)果顯示花椰菜中硫苷的主要成分是兩種有益硫苷NEO和GBC。因此，通過搜集、挖掘、利用花椰菜中富含硫苷的種質(zhì)資源，有望培育出更富抗癌活性物質(zhì)、更具保健價值的花椰菜品種。

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