響應(yīng)面法優(yōu)化紫外線處理后雙孢菇中維生素D2皂化工藝

張?jiān)?，沈雅萍，李利利，王鳳玲，關(guān)文強(qiáng)

(天津商業(yè)大學(xué) 生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300134)

食用菌，俗稱“蘑菇”，是一類可供食用的大型真菌。我國對食用菌的認(rèn)識(shí)利用可以追溯到公元前4000年到公元前3000年的仰韶文化時(shí)期[1-2]。食用菌味道鮮美、風(fēng)味獨(dú)特，富含蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸等多種營養(yǎng)成分，具有一定的抗腫瘤、降血壓等藥學(xué)功效[3-4]。雙孢菇為世界范圍內(nèi)栽培量較大的食用菌之一，因其菇體潔白、風(fēng)味獨(dú)特受到消費(fèi)者的廣泛歡迎。

近年來，大量實(shí)驗(yàn)研究表明，雙孢菇中大量的麥角甾醇在紫外線的作用下會(huì)轉(zhuǎn)化為VD2[5-11]，對人類健康具有重要價(jià)值。VD2為VD家族的重要一員，在人體內(nèi)主要起調(diào)節(jié)鈣磷代謝平衡的作用。VD的缺乏會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、軟骨病等病癥，且與高血壓、中風(fēng)、糖尿病等有重要關(guān)系[12-13]。VD主要來自動(dòng)物性食物，食用菌是極其稀少的天然植物性食物來源[14]，可以預(yù)計(jì)，未來食用菌中的VD2將成為VD的一個(gè)主要來源。因此，食用菌中的VD2調(diào)控、分析及應(yīng)用將擁有廣闊的前景。

VD2的提取方法主要分為皂化法[15-19]和非皂化法[20-22]。非皂化法雖然提取時(shí)間較短，但提取過程要加入二甲基亞砜等易致毒試劑作為破壁劑，危險(xiǎn)系數(shù)較大，故未能得到廣泛使用。皂化法即將樣品加入堿和醇進(jìn)行皂化反應(yīng)，使脂類轉(zhuǎn)變成水溶性的皂化產(chǎn)物，釋放出其包裹的VD2[23]，然后用有機(jī)溶劑提取，反應(yīng)條件溫和，操作簡單，成為VD2的主要提取方法。VD2的皂化工藝影響著食用菌中VD2的準(zhǔn)確定量，因而建立可靠可行的皂化工藝尤為重要。

響應(yīng)面法是一種最為常用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，利用有限次試驗(yàn)得到數(shù)據(jù)來建立因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)模型，由部分推斷整體，從而獲得最佳工藝條件[24-26]。目前為止，尚未有利用響應(yīng)面法優(yōu)化食用菌中VD2皂化工藝的研究報(bào)道。本文以紫外線處理后的雙孢菇為實(shí)驗(yàn)材料，通過單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化VD2的皂化工藝，為食用菌中VD2的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

VD2(50-14-6)，美國ChemService公司；雙孢菇，天津市閩中食用菌種植基地；甲醇(色譜純)天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；無水乙醇、正己烷，分析純天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水為超純水。

LC-10ATVP高效液相色譜儀，日本島津；Milli-Q水純化系統(tǒng)，美國Millipore公司；短波紫外照射裝置，天津天商冰源科技發(fā)展有限公司；短波紫外燈管天津瑞森特紫外線設(shè)備有限公司；UVX-25 紫外照度計(jì)，美國UVP公司；FD-2真空冷凍干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙孢菇紫外線處理

選擇品質(zhì)較好、大小均一的雙孢菇均勻置于紫外燈(波長254 nm)下，先將菌蓋垂直向上，照射200 s，然后手動(dòng)翻轉(zhuǎn)，菌柄照射相同時(shí)間，照射距離20 cm，照射強(qiáng)度1 000 μW/cm2，計(jì)算得照射劑量為每面2.0 kJ/m2。照射完成后，將雙孢菇置于-80 ℃冰箱冷凍48 h后放入真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)，真空度約為10 Pa，冷阱溫度為-80 ℃，干燥時(shí)間為60 h。將干燥后的雙孢菇研磨成粉，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存待用。

1.2.2 VD2皂化提取工藝

準(zhǔn)確稱取雙孢菇粉末1.00 g，加入4 mL抗壞血酸鈉溶液(1 mol/L)作為保護(hù)劑，無水乙醇和氫氧化鉀(50%)作為皂化堿液，混合物水浴皂化后冷卻至室溫。將上清液加入15 mL去離子水、15 mL乙醇，用25 mL正己烷提取3次，合并有機(jī)相。去離子水洗至中性。有機(jī)相旋蒸至干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，過0.45 μm尼龍膜，使用高效液相色譜測定VD2含量。

1.2.3 液相色譜分析條件

色譜柱：SinoChrom OD-BP(4.6×200 mm 5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水；流動(dòng)相比例：V(甲醇)∶V(水)=90∶10；流速： 1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：264 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

避光條件下準(zhǔn)確稱取VD2標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，甲醇溶液溶解并定容于棕色容量瓶100 mL，該儲(chǔ)備液濃度為100 μg/mL，-20 ℃下避光密封保存。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.10、0.50、1.00、2.00、4.00 mL于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混勻。配制成濃度為1、5、10、20、40 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，上液相色譜測定，得到峰面積(y)和濃度(x)的線性回歸方程。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.5.1 醇堿體積比

避光稱取雙孢菇粉末1.00 g，設(shè)置無水乙醇和氫氧化鉀(50%)的體積比為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1，液固比12∶1(mL∶g)，皂化時(shí)間60 min，皂化溫度70 ℃的條件下進(jìn)行VD2的提取，考察醇堿體積比對雙孢菇中VD2提取量的影響。每個(gè)處理設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.2 液固比

避光稱取雙孢菇粉末1.00 g，設(shè)置液固比(mL∶g)為3∶1、6∶1、12∶1、18∶1、24∶1，在醇堿體積比為2∶1，皂化時(shí)間60 min，皂化溫度70 ℃的條件下進(jìn)行VD2的提取，考察皂化堿液體積對雙孢菇中VD2提取量的影響。每個(gè)處理設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.3 皂化溫度

避光稱取雙孢菇粉末1.00 g，設(shè)置皂化溫度為50、60、70、80、90 ℃，在醇堿體積比為2∶1，液固比為12∶1(mL∶g)，皂化時(shí)間為60 min的條件下進(jìn)行VD2的提取，考察皂化溫度對雙孢菇中VD2提取量的影響。每個(gè)處理設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.5.4 皂化時(shí)間

避光稱取雙孢菇粉末1.00 g，設(shè)置皂化時(shí)間為20、40、60、80、100 min，在醇堿體積比為2∶1，液固比為12∶1(mL∶g)，皂化溫度為70 ℃的條件下進(jìn)行VD2的提取，考察皂化時(shí)間對雙孢菇中VD2提取量的影響。每個(gè)處理設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，固定醇堿體積比為2∶1，選擇液固比(X1)、皂化溫度(X2)、皂化時(shí)間(X3)為考察因素，以VD2的提取量為響應(yīng)值(Y，μg/g)，利用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，如表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 VD2標(biāo)準(zhǔn)曲線與色譜圖

VD2標(biāo)準(zhǔn)品及雙孢菇樣品色譜圖如圖1、圖2所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間定性，峰面積定量。VD2質(zhì)量濃度(x)和峰面積(y)之間的線性回歸方程為y=30 702x-1 809.2，R2>0.999，線性范圍1.0～40.0 μg/mL，VD2濃度和峰面積之間有良好的線性關(guān)系。

圖1 VD2標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of VD2

圖2 雙孢菇樣品色譜圖Fig.2 Chromatogram of white button mushroom sample

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 醇堿體積比

如圖3所示，當(dāng)醇堿體積比從1∶1增加到2∶1后，VD2提取量有大幅度的增加，無水乙醇的增加使物料與皂化液混合更均勻。繼續(xù)增加醇堿體積比，VD2提取量略有減少并趨于穩(wěn)定，過量無水乙醇的加入降低了KOH溶液的濃度，減少了VD2提取量，并增加了成本，故醇堿的體積比選擇2∶1。

圖3 醇堿體積比對VD2提取量的影響Fig.3 Effect of alcohol-alkali ratio on the extraction of VD2注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

2.2.2 液固比

由圖4可以看出，液固比(mL∶g)在3∶1～12∶1，VD2提取量隨液固比的增加出現(xiàn)較大幅度的增加，液固比為12∶1(mL∶g)時(shí)，VD2提取量達(dá)到最大值，之后再增加液固比，對VD2提取量影響不大，曲線保持平穩(wěn)趨勢。

圖4 液固比對VD2提取量的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the extraction of VD2

堿液的增加使物料皂化更充分，但后續(xù)過程需要大量的水洗去殘留堿液，對VD2造成一定的損失，綜合考慮，液固比選擇12∶1(mL∶g)。

2.2.3 皂化溫度

如圖5所示，隨著溫度的升高，VD2提取量先增加后減少。皂化反應(yīng)為吸熱反應(yīng)，溫度的升高加快了反應(yīng)速率，增加了VD2提取量，但當(dāng)溫度超過70 ℃時(shí)，由于高溫破壞了VD2結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取量減少，故皂化溫度選擇70 ℃。

圖5 皂化溫度對VD2提取量的影響Fig.5 Effect of saponification temperature on the extraction of VD2

2.2.4 皂化時(shí)間

由圖6可知，皂化時(shí)間在20～60 min，皂化時(shí)間對VD2提取量影響程度較大，皂化時(shí)間的延長使皂化反應(yīng)更加完全，當(dāng)皂化時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)，VD2的提取量達(dá)到最大值。繼續(xù)延長皂化時(shí)間，VD2提取量趨于穩(wěn)定，故皂化時(shí)間選擇60 min。

圖6 皂化時(shí)間對VD2提取量的影響Fig.6 Effect of saponification time on the extraction of VD2

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以液固比(X1)、皂化溫度(X2)、皂化時(shí)間(X3)為自變量，VD2提取量(Y)為響應(yīng)值，對雙孢菇中VD2皂化反應(yīng)工藝進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果見表2。

2.3.1 模擬方程的建立及顯著性檢驗(yàn)

利用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert軟件對表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到3個(gè)自變量與提取量之間的二次多項(xiàng)回歸方程：

表2 皂化反應(yīng)工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental results of response surface analysis for optimizing the saponification of VD2

對回歸模型進(jìn)行方差分析以檢驗(yàn)其顯著性，如表3所示。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

注：*表示差異顯著，P<0.05,**表示差異極顯著，P<0.01。

各因素的顯著性檢驗(yàn)結(jié)果表明所選擇的3個(gè)因素對VD2皂化反應(yīng)的影響程度：皂化溫度(X2)>液固比(X1)>皂化時(shí)間(X3)。3個(gè)因素的二次項(xiàng)對VD2皂化反應(yīng)的影響均為顯著，X1X2對VD2皂化反應(yīng)影響效果較顯著，X1X3、X2X3對VD2皂化反應(yīng)影響效果不顯著。

2.3.2 響應(yīng)面分析影響因素的交互作用

3因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖如圖7所示，由圖7可以直觀地看出因素間兩兩交互作用對響應(yīng)值的影響。液固比和皂化溫度的交互作用對VD2的提取量影響較顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)面坡度較陡、等高線橢圓明顯。液固比和皂化時(shí)間的交互作用對VD2的提取量影響程度次之，皂化溫度和皂化時(shí)間的交互作用對VD2提取量的影響不顯著，表現(xiàn)為響應(yīng)面曲面較為平滑。

圖7 各因素交互作用對VD2提取量影響的響應(yīng)面和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots for the effect of various factors on the extraction of VD2

通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)分析得到的VD2最佳皂化工藝參數(shù)為液固比為12.36∶1(mL∶g)、皂化溫度為74.7 ℃、皂化時(shí)間為62.6 min，此條件下，VD2的理論提取量為8.25 μg/g。 為檢驗(yàn)該模型所得最佳工藝參數(shù)的可行性，采用上述工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作，調(diào)整最佳工藝為液固比為12∶1(mL∶g)、皂化溫度為75 ℃、皂化時(shí)間為63 min，3組平行實(shí)驗(yàn)得到VD2的平均提取量為8.13 μg/g，與理論值誤差較小，證明響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)所得皂化工藝條件可信可行。

3 結(jié)論

由季節(jié)、地理、飲食習(xí)慣等原因?qū)е碌腣D缺乏情況在世界范圍內(nèi)較為普遍[14]，不同人群的VD的每日參考攝入量范圍為15～20 μg[16，27]，以本文的量來計(jì)算，大約25 g紫外線處理后的新鮮食用菌即可滿足需求。

以紫外線處理后的雙孢菇為實(shí)驗(yàn)材料，結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對VD2的皂化工藝進(jìn)行了響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)為液固比為12∶1(mL∶g)、皂化溫度為75 ℃、皂化時(shí)間為63 min，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到VD2的平均提取量為8.13 μg/g，與理論值偏差較小，說明響應(yīng)面法分析得到的最佳工藝參數(shù)合理可行，為食用菌中VD2的精準(zhǔn)分析提供參考，從而最終為富含VD2的食用菌產(chǎn)品開發(fā)利用提供參考。