紅曲茶黃酒多酚色譜分析及其對(duì)小鼠抗氧化酶活力影響

梁璋成，何志剛*，林曉婕，林曉姿，李維新

（1.福建省農(nóng)科院 農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所，福建 福州350003；2.福建省農(nóng)產(chǎn)品（食品）加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350003）

紅曲黃酒是福建特產(chǎn)，含有多種生物活性物質(zhì)[1-3]，如γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、谷胱甘肽、多酚類物質(zhì)與低聚糖等，具有降膽固醇、降血糖、降血壓和防癌等功能以及通血脈、厚腸胃、潤(rùn)皮膚、散濕氣、養(yǎng)脾氣、扶肝、除風(fēng)、下氣等醫(yī)療保健功效[4]，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。傳統(tǒng)工藝釀造的紅曲黃酒具有溫?zé)釋傩裕梢曰钛詈?、通?jīng)活絡(luò)，能有效抵御寒冷，預(yù)防感冒，作為低度佐餐飲料酒，在冬季飲服深受消費(fèi)者的歡迎，但若在夏季飲用，對(duì)熱性敏感體質(zhì)人群，存在著易“上火”的體質(zhì)表征等缺陷，也使紅曲黃酒的消費(fèi)受到地域性和時(shí)間性的制約，不利于黃酒市場(chǎng)占有率的擴(kuò)大，成為紅曲黃酒市場(chǎng)拓展的主要瓶頸之一[5]。為此，課題組研究了影響紅曲黃酒寒熱性的相關(guān)因子[6]，通過(guò)綠茶共發(fā)酵技術(shù)，研制出了溫和清爽型的紅曲茶黃酒，可顯著降低傳統(tǒng)紅曲黃酒的熱度，使黃酒熱性指數(shù)下降超過(guò)40%[7]。綠茶中含有豐富的茶多酚、茶多糖、生物堿、維生素等功能活性物質(zhì)，發(fā)酵過(guò)程中水溶性及醇溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溶于酒中，使紅曲黃酒的物質(zhì)組成及其營(yíng)養(yǎng)功效發(fā)生改變，使總酚含量提高30%以上[8]。已有研究表明，酚類物質(zhì)的組分及含量對(duì)黃酒的抗氧化能力具有顯著的影響[9-11]。但引入綠茶共發(fā)酵對(duì)紅曲黃酒酚類物質(zhì)組成與成分及其抗氧化能力的影響尚不明確。

血清內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是體內(nèi)抗氧化的第一道防線，可將超氧陰離子自由基快速歧化為過(guò)氧化氫和分子氧[12]。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）具有清除氧自由基、保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷的作用，可將過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)化為水和分子氧[13]。一般說(shuō)來(lái)，體內(nèi)SOD和GSH-Px酶活力越高，表明機(jī)體清除氧自由基的能力越強(qiáng)。氧自由基在體內(nèi)的水平可以通過(guò)多種方式進(jìn)行檢測(cè)，其中丙二醛（malondialdehyde，MDA）的含量被認(rèn)為是極為重要的指標(biāo)[14]，血清中MDA水平代表了機(jī)體的膜脂質(zhì)過(guò)氧化水平。因此，可選擇血清SOD 和GSH-Px酶活力和MDA含量作為評(píng)價(jià)小鼠抗氧化能力的核心指標(biāo)。本研究采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法檢測(cè)紅曲黃酒酚類物質(zhì)含量，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒法檢測(cè)小鼠血清的抗氧化酶活力及丙二醛（MDA）含量，以傳統(tǒng)工藝紅曲黃酒為對(duì)照，考察添加綠茶共發(fā)酵對(duì)紅曲黃酒酚類物質(zhì)及小鼠體內(nèi)抗氧化酶活力的影響，以期為紅曲茶黃酒新產(chǎn)品的深入開(kāi)發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

傳統(tǒng)工藝紅曲黃酒（酒精度16%vol）：本實(shí)驗(yàn)室自制；大米（永安圓糯米）、紅曲米（寧德市古田平湖紅曲米）：市售；發(fā)酵用水：寧德市蕉城區(qū)洋中天湖鳳尾山泉水；綠茶：寧德市蕉城區(qū)“天山綠”綠茶，色澤翠綠，有清鮮茶香，沖泡后湯色碧綠、清澈明亮，滋味濃厚回甘；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）JH301：由本實(shí)驗(yàn)室自主選育并保存。

1.1.2 動(dòng)物和飼料

清潔級(jí)美國(guó)癌癥研究所（institute ofcancer research，ICR）健康小鼠（雌雄各半，體質(zhì)量（20±2）g），飼料：上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.3 化學(xué)試劑

表沒(méi)食子兒茶素、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、兒茶素沒(méi)食子酸酯、沒(méi)食子酸兒茶素、咖啡因、兒茶素、綠原酸、沒(méi)食子酸、丁香酸、楊梅素、香豆酸、阿魏酸、香草酸、蘆丁、紫丁香酸（純度≥98%）：美國(guó)Sigma 公司；SOD、MDA、GSH-Px專用酶聯(lián)免疫試劑盒：南京建成生物工程研究所；其他試劑均使用國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10型pH計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；1260型高相液相色譜儀：美國(guó)Agilent 公司；UV-1750紫外分光光度計(jì)：島津（蘇州）儀器有限公司；DW-FL362型離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器有限公司；KDM型調(diào)溫電熱套：山東華魯電熱儀器有限公司；酒精計(jì)：浙江余姚比重計(jì)廠；SPX智能型生化培養(yǎng)箱：寧波江南儀器廠；TE601-I電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；YXQ-LS-505II立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海

博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；陶土酒壇：寧德黃家酒業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅曲茶黃酒的制備

糯米經(jīng)浸泡、蒸煮，以米飯∶水按照料液比1∶1（g∶mL）落缸，按總質(zhì)量的5%接種古田紅曲米，按總質(zhì)量的1.0%接種釀酒酵母JH301，按總質(zhì)量的1.0‰加入綠茶，攪拌均勻后控溫（20±1）℃發(fā)酵40 d，壓榨、過(guò)濾，調(diào)整酒精度為（16±0.5）%vol，85 ℃熱滅菌15 min后陳釀（溫度20 ℃）6個(gè)月，備用。在落缸時(shí)不添加綠茶共發(fā)酵的處理即為傳統(tǒng)工藝紅曲黃酒。

1.3.2 動(dòng)物模型試驗(yàn)

將小鼠隨機(jī)分為5組，即正常組、傳統(tǒng)紅曲黃酒組、低劑量紅曲茶黃酒組（0.05 mL/10 g）、中劑量紅曲茶黃酒組（0.10 mL/10 g）、高劑量紅曲茶黃酒組（0.20 mL/10 g）。每組分3個(gè)平行組，每個(gè)平行組20只小鼠，即每組共60只小鼠。各組小鼠正常飼養(yǎng)1周作為適應(yīng)期，之后按表1方案灌胃給藥并繼續(xù)飼養(yǎng)，每日上午1次，每次灌胃劑量為0.05 mL/10 g、0.10 mL/10 g、0.20 mL/10 g，灌胃造模90 d后檢測(cè)小鼠血清生化指標(biāo)，考察添加綠茶發(fā)酵對(duì)紅曲黃酒抗氧化能力的影響。

表1 不同實(shí)驗(yàn)組小鼠給藥方案Table 1 Dosage regimen of each experimental groups

中國(guó)居民膳食指南中推薦每人每日酒精攝入量≤25 g，傳統(tǒng)紅曲黃酒及紅曲茶黃酒樣品酒精度16%vol，折算成其每日攝入量不超過(guò)156.25 mL，以人平均體質(zhì)量60 kg計(jì)，傳統(tǒng)紅曲黃酒及紅曲茶黃酒的人體日推薦量約為≤2.6 mL/kg。以10 倍人體推薦量為基礎(chǔ)來(lái)設(shè)定實(shí)驗(yàn)組劑量，因此高、中、低劑量組分別設(shè)為20.0 mL（/kg·d）、10 mL（/kg·d）及5 mL（/kg·d）。

1.3.3 檢測(cè)方法

酚類物質(zhì)的含量：采用高效液相色譜法測(cè)定[8]；總酚含量的測(cè)定：采用GB/T 21733—2008《茶飲料》[15]；咖啡因含量的測(cè)定：采用GB 5009.139—2014《飲料中咖啡因的測(cè)定》[16]。

小鼠SOD、GSH-Px酶活力和MDA含量測(cè)定：從小鼠眼球采取血液，于4 ℃條件下1 500 r/min離心10 min，用移液槍取300 μL血清，裝于1.5 mL離心管中，使用SOD、MDA、GSH-Px專用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)小鼠SOD、GSH-Px酶活力和MDA含量。以每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位（U）；以每0.1 mL血清（漿）在37 ℃條件下反應(yīng)5 min，扣除非酶促反應(yīng)作用，使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1 mol/L為一個(gè)GSH-Px酶活力單位（U）。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用DPS6.01軟件處理，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲茶黃酒的酚類物質(zhì)組分與含量

表2 綠茶對(duì)紅曲黃酒酚類物質(zhì)成分與含量的影響Table 2 Effect of green tea on the phenols composition and content of Hong Qu Huangjiu

由表2可知，傳統(tǒng)紅曲黃酒的酚類物質(zhì)主要為兒茶素、綠原酸、沒(méi)食子酸、丁香酸及楊梅素等。紅曲茶黃酒添加綠茶共發(fā)酵，綠茶中的水溶性及醇溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溶于酒中，可豐富傳統(tǒng)紅曲黃酒酚類物質(zhì)組分，增加綠茶特征酚類物質(zhì)表沒(méi)食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、兒茶素沒(méi)食子酸酯（catechin gallate，ECG）、沒(méi)食子兒茶素（gallocatechin，GC）和咖啡因，還可使傳統(tǒng)紅曲黃酒的主要酚類物質(zhì)如兒茶素、綠原酸和沒(méi)食子酸的含量分別提高27.38%、29.52%和30.77%，使總酚含量提高37.69%。結(jié)果表明，添加綠茶共發(fā)酵不僅可極顯著提高紅曲黃酒酚類物質(zhì)含量（P＜0.01），還可豐富紅曲黃酒的酚類物質(zhì)組成，賦予紅曲黃酒綠茶的特征酚類物質(zhì)。

2.2 紅曲茶黃酒對(duì)小鼠血清的SOD、GSH-Px活力及MDA含量的影響

表3 不同實(shí)驗(yàn)組小鼠血清的SOD、GSH-Px活力及MDA含量Table 3 Activities of SOD and GSH-Px and MDA contents in serum of mice with different treatments

由表3可知，每天灌服0.20 mL/10 g紅曲茶黃酒的高劑量紅曲茶黃酒組小鼠出現(xiàn)了嚴(yán)重的死亡現(xiàn)象，故不統(tǒng)計(jì)其對(duì)小鼠抗氧酶活力的影響。結(jié)果表明，與灌服蒸餾水組小鼠相比，灌服傳統(tǒng)紅曲黃酒可分別使小鼠血清的SOD酶和GSH-Px酶活力顯著提高5.08%和10.16%（P＜0.05），小鼠血清的MDA含量降低2.90%，說(shuō)明傳統(tǒng)紅曲黃酒可提高小鼠的抗氧化水平；灌服低劑量紅曲茶黃酒可分別使小鼠血清的SOD酶和GSH-Px酶活力顯著提高5.49%和11.77%（P＜0.05），小鼠血清的MDA含量顯著降低3.76%（P＜0.05），與灌服傳統(tǒng)紅曲黃酒組差異未達(dá)顯著水平（P＞0.05）；灌服中劑量紅曲茶黃酒可分別使小鼠血清的SOD酶和GSH-Px酶活力分別顯著提高8.29%和23.93%（P＜0.05），小鼠血清的MDA顯著含量降低5.79%（P＜0.05），與灌服蒸餾水組、灌服傳統(tǒng)紅曲黃酒組和灌服低劑量紅曲茶黃酒組的差異均達(dá)顯著水平（P＜0.05）。與傳統(tǒng)紅曲黃酒相比，紅曲茶黃酒可顯著提高小鼠的抗氧化能力，使小鼠血清的超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）酶活力分別提高3.05%和12.50%（P＜0.05），MDA含量顯著降低2.98%（P＜0.05）。灌胃劑量越大，紅曲茶黃酒的抗氧化能力就越強(qiáng)；但當(dāng)灌胃劑量達(dá)0.20 mL/10 g時(shí)，小鼠出現(xiàn)了死亡現(xiàn)象。結(jié)果表明，添加綠茶共發(fā)酵可顯著提高紅曲黃酒的抗氧化能力。

2.3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究已經(jīng)證明，很多疾病如組織器宮老化等都與過(guò)剩的自由基有關(guān)。氧在生物體內(nèi)通過(guò)單電子還原產(chǎn)生化學(xué)性質(zhì)活潑的物質(zhì)稱活性氧，它們包括超氧負(fù)離子自由基、過(guò)氧化氫和羥基自由基等?；钚匝蹩梢耘cDNA、蛋白質(zhì)和多元不飽和脂肪酸作用，造成DNA鏈斷裂和氧化性損傷、蛋白-蛋白交聯(lián)、蛋白-DNA交聯(lián)和脂質(zhì)過(guò)氧化。體內(nèi)也有各種消除活性氧和自由基的防御系統(tǒng)，以免組織遭到傷害，但當(dāng)人體內(nèi)出現(xiàn)各種各樣負(fù)荷狀態(tài)時(shí)，就會(huì)使活性氧和自由基的形成和消除之間平衡喪失，從而誘發(fā)各種組織損傷和疾病，引起如癌癥、衰老、心血管疾病等慢性疾病[17]。茶多酚是一種純天然抗氧劑，它是在茶葉水浸物中與亞鐵離子產(chǎn)生綜合反應(yīng)的酚類化合物的總稱。綠茶中的茶多酚主要為兒茶素類化合物，主要包括表沒(méi)食子兒茶素（EGC）、DL-兒茶素（DL-catechin，DL-C）、表兒茶素（epicatechin，EC）、表兒茶素沒(méi)食子酸酯（ECG）、沒(méi)食子酸酷（EGCG）等，均具有極強(qiáng)的抗氧化能力[18-20]。茶多酚能對(duì)自由基誘發(fā)的生物大分子損傷起到保護(hù)作用，能提高小鼠抗氧化酶（包括SOD、GSH-Px等）活性，有效阻止DNA由雜環(huán)胺引起的氧化損傷，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，復(fù)原因自由基造成的對(duì)細(xì)胞傷害[21]；茶多酚還可抑制自發(fā)性和Fe2+誘導(dǎo)性脂質(zhì)過(guò)氧化，降低脂質(zhì)過(guò)氧化程度和MDA含量[22-23]。因此，添加綠茶共發(fā)酵可顯著提高紅曲黃酒的抗氧化能力。與灌服傳統(tǒng)紅曲黃酒的小鼠相比，灌服紅曲茶黃酒的小鼠的SOD、GSH-Px活力顯著提高、MDA含量顯著下降。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，添加綠茶共發(fā)酵不僅可豐富傳統(tǒng)紅曲黃酒的酚類物質(zhì)組分及含量，與傳統(tǒng)紅曲黃酒相比，小鼠血清的超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）活力分別顯著提高3.05%和12.50%（P＜0.05），MDA含量顯著降低2.98%（P＜0.05）。飲用黃酒需達(dá)一定濃度的才可以增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力、降低氧化損傷[24]，若劑量過(guò)低發(fā)揮的功效并不顯著，但劑量過(guò)高會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡（灌胃劑量達(dá)0.20 mL/10 g時(shí)），適宜范圍仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。此外，紅曲茶黃酒的抗氧化能力與其所含抗氧化酚類物質(zhì)的含量有關(guān)，其確切關(guān)系還需進(jìn)一步深入研究。