基因工程大腸桿菌BL21產(chǎn)β-甘露聚糖酶的代謝流研究

黃 聰，李 嘯，*，許超群，張小龍，葉 晗，程 奔，伍業(yè)旭

（1.三峽大學(xué) 生物與制藥學(xué)院，湖北 宜昌443003；2.安琪酵母股份有限公司，湖北 宜昌443003）

β-甘露聚糖酶是一類能夠水解含β-1,4-D-甘露糖苷鍵的內(nèi)切水解酶[1]，可以水解葡萄甘露聚糖、甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露聚糖等，廣泛存在于自然界中。目前，β-甘露聚糖酶被用于多個領(lǐng)域，包括食品、飼料、醫(yī)藥、造紙、石油開采等領(lǐng)域[2-4]，具有良好的應(yīng)用前景。

代謝通量分析包括基于物料平衡的代謝通量、基于同位素示蹤的代謝通量和基于基因組尺度的代謝通量，是研究代謝工程的一種重要的方法[5]。物料平衡代謝通量分析是基于化學(xué)計量系數(shù)的研究方法，它根據(jù)細胞內(nèi)所有的生化反應(yīng)方程式建立數(shù)學(xué)平衡模型，計算胞內(nèi)外物質(zhì)的代謝通量，基于物料平衡的代謝通量已被廣泛應(yīng)用于多項研究[6-9]，然而關(guān)于β-甘露聚糖酶的代謝流的研究卻鮮有報道[10]。本研究建立并驗證了基因工程大腸桿菌（Escherichia coli）BL21產(chǎn)β-甘露聚糖酶的代謝流模型，分析菌體比生長速率和β-甘露聚糖酶合成通量最大時的極端代謝流分布，并對代謝網(wǎng)絡(luò)節(jié)點（葡糖糖-6-磷酸、丙酮酸）進行分析，為基因工程大腸桿菌BL21產(chǎn)β-甘露聚糖酶的研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

基因工程大腸桿菌BL21（含枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）168來源的β-甘露聚糖酶基因）：由安琪酵母菌種保藏中心提供，具有氨芐抗性。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：酵母蛋白胨10 g，NaCl 10 g，酵母抽提物5 g，瓊脂粉15 g，121 ℃滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基[11]：甘油8.00 g，酵母抽提物17.50 g，酵母蛋白胨7.50 g，NaCl 6.00 g，Na2HPO48.50 g，KH2PO44.25 g，K2HPO44.25 g，MgSO41.00 g，pH 7.0，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20.00 g，酵母抽提物13.32 g，Na2HPO·412H2O 17.10 g，KH2PO43.00 g，NaCl 0.50 g，MgSO40.24 g，微量元素10.00 mL/L，pH 7.0，121 ℃滅菌15 min。

微量元素[12]：FeCl31.23 g，Na2MoO40.06 g，ZnCl20.36 g，CuCl20.043 g，CaCl20.16 g，CoCl20.06 g，MnCl20.10 g，121 ℃滅菌15 min。

1.1.3 試劑

氨芐西林鈉（分析純）：中諾藥業(yè)（石家莊）有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）：上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FUS-50 L（A）型新概念發(fā)酵罐：上海國強生化工程裝備有限公司；PAS7000型生物尾氣分析儀：重慶哈特曼科技有限公司；ZHWY-211D腳踏開門型大容量全溫度恒溫搖床：上海智城生物科技有限公司；SP-754型紫外可見光分光光度計：上海天普分析儀器有限公司；Chromaster高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：日立高新技術(shù)公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

一級種子液：將斜面上的菌種接種至裝液量為25 mL的250 mL三角瓶中，于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

二級種子液：將一級種子液接種至裝液量為500 mL的5 L三角瓶中，接種量4%（V/V），于37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)24 h。

分批發(fā)酵：將二級種子液按4%（V/V）的接種量接入新概念發(fā)酵罐中，裝液量為30 L，轉(zhuǎn)速為200 r/min，通氣量1.67 vvm，0.035 MPa條件下發(fā)酵培養(yǎng)12 h，第2小時末加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG（過濾滅菌）誘導(dǎo)β-甘露聚糖酶表達。

1.3.2 分析方法

葡萄糖含量：采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法進行測定[13]；菌體濃度：采用分光光度計法測定[14]，細胞干質(zhì)量由干質(zhì)量（y）與菌體濃度（x）的回歸方程（y=0.441 86x-0.006 34）計算得到；乙酸含量：采用HPLC法測定[15]；β-甘露聚糖酶活力：參考文獻[16]。CO2釋放速率：由Biostar 1.5在線分析控制系統(tǒng)計算。

t時刻的葡萄糖攝取通量[mmol（/g·h）]、乙酸分泌通量[mmol/（g·h）]、菌體合成通量（h-1）及CO2釋放通量[mmol/（g·h）]的計算公式分別見（1）、（2）、（3）、（4）。

1.3.3 模型的構(gòu)建與運算

?ZKAN P等[17]已報道了重組大腸桿菌BL21表達外源蛋白質(zhì)的模型，本研究在其基礎(chǔ)上簡化合并了部分代謝通路，并將β-甘露聚糖酶的代謝途徑加入到簡化的代謝網(wǎng)絡(luò)中，構(gòu)建了重組大腸桿菌BL21產(chǎn)β-甘露聚糖酶的代謝網(wǎng)絡(luò)見圖1。該代謝網(wǎng)絡(luò)包括糖酵解（embden-meyerhof-parnas，EMP）途徑、戊糖磷酸途徑（hexose monophosphate pathway，HMP）、檸檬酸循環(huán)（citric acid cycle，TCA）、氨基酸和乙酸合成途徑、回補反應(yīng)、磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（phosphoenolpyruvate：carbohydrate phosphotransferase system，PTS）、菌體合成以及β-甘露聚糖酶的合成途徑8個部分，共41個反應(yīng)（表1），也即41個未知反應(yīng)通量。

表1 代謝模型的反應(yīng)式Table 1 Reaction formulas of metabolic model

采用CellNetAnalyzer 2018.1[18]計算代謝通量，將41個反應(yīng)式輸入CellNetAnalyzer，軟件顯示代謝網(wǎng)絡(luò)的自由度為3，即需要3個反應(yīng)通量即可求出所有41個未知通量。在本研究中，選擇葡萄糖攝取通量、乙酸分泌通量和菌體合成通量3個外部可測通量，求解整個代謝通量的分布。

2 結(jié)果與分析

2.1 模型的驗證

為了驗證模型的準確性，將葡萄糖攝取通量（r1）、乙酸分泌通量（r25）和菌體合成通量（r41）輸入至CellNetAnalyzer，從而獲得整個代謝網(wǎng)絡(luò)每步反應(yīng)（r1～r41）的代謝通量。通過比較計算獲得的CO2釋放通量（r35）和實驗測定獲得的CO2釋放通量，驗證模型的可靠性。每小時重組菌E.coli BL21分批發(fā)酵產(chǎn)生的葡萄糖、乙酸、菌體干質(zhì)量和CO2釋放速率及其代謝通量的測定結(jié)果見表2。

表2 部分物質(zhì)的含量及代謝通量測定結(jié)果Table 2 Determined results of concentrations and metabolic fluxes of some substances

由表2可知，重組大腸桿菌BL21分批發(fā)酵0～12 h過程中，每個時刻計算得到的CO2釋放通量與實驗測定的每個時刻CO2釋放通量無顯著性差異（P＞0.05），即由模型計算得到的CO2釋放通量可以準確反映實際CO2釋放通量，說明重組大腸桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶的模型是可靠的，可以被用于大腸桿菌BL21產(chǎn)β-甘露聚糖酶的代謝流分析。

2.2 極端代謝流分布

2.2.1 菌體合成通量最大時的極端代謝流分布

在代謝網(wǎng)絡(luò)中，由于代謝流的外溢造成底物浪費，降低了底物轉(zhuǎn)化率，所以為了獲得最大的菌體合成通量代謝流分布，將r25假設(shè)為0，即將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙酸的代謝通量假設(shè)為0。同時，令r40=0，也即β-甘露聚糖酶的通量為0，此時，計算得到的通量分布即為菌體合成通量最大時菌體代謝通量的分布。以葡萄糖通量為對照，標準化乙酸分泌和菌體合成通量。計算得到的41個反應(yīng)的代謝通量，結(jié)果如表3所示。

表3 兩種極端代謝流分布Table 3 Distributions of two kind of extreme metabolic fluxes

由表3可知，當(dāng)乙酸分泌通量和β-甘露聚糖酶合成通量均為0時，理論最大菌體合成通量r41為9.39 h-1。此時，流經(jīng)HMP途徑的通量r2為8.62 mmol（/g·h），流經(jīng)EMP途徑的通量r4為91.38 mmol（/g·h），也即8.62%的底物分配到HMP途徑，91.38%的底物分配到EMP途徑。此外進入TCA循環(huán)的流量r11為103.75 mmol（/g·h），但是考慮到葡萄糖經(jīng)EMP途徑進入TCA循環(huán)途徑時，一分子的葡萄糖會變?yōu)闉閮煞肿拥谋幔哉鎸嵎峙涞絋CA循環(huán)途徑的底物占初始底物的51.88%。

在生化網(wǎng)絡(luò)中，EMP途徑和TCA循環(huán)主要為細胞提供能量和部分前體物質(zhì)，而HMP途徑的生物學(xué)意義主要在于提供給細胞還原力和核酸合成前體[19]。根據(jù)代謝流分布結(jié)果可知，大量的底物被分配到EMP途徑和TCA循環(huán)進行有氧呼吸，用來產(chǎn)生大量的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），這說明菌體生長需要大量的ATP供應(yīng)。只有＜9%的底物被分配到HMP途徑，用來產(chǎn)生菌體增殖所必須的還原力和核酸。另外，由于丙酮酸是多種氨基酸生物合成的前體，所以丙酮酸流向TCA循環(huán)的流量被分流到氨基酸合成，導(dǎo)致TCA循環(huán)途徑流量變小。

2.2.2 β-甘露聚糖酶合成通量最大時的極端代謝流分布

為了獲得最大β-甘露聚糖酶合成通量，令r25=0且r41=0，也即乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為乙酸的代謝通量和菌體合成通量均為0。以葡萄糖通量為對照，標準化乙酸分泌和菌體合成通量。計算得到的41個反應(yīng)的代謝通量，結(jié)果如表3所示。

由表3可知，當(dāng)乙酸分泌和菌體合成通量均為0時，理論最大β-甘露聚糖酶合成通量r41為0.18 mmol（/g·h）。此時，流經(jīng)HMP途徑的通量r2為17.87 mmol（/g·h），流經(jīng)EMP途徑的通量r4為82.13 mmol（/g·h），也即17.87%的底物分配到HMP途徑，82.13%的底物分配到EMP途徑。

根據(jù)HMP途徑和EMP途徑流量分配結(jié)果來看，在菌體表達外源蛋白β-甘露聚糖酶時，仍然有大量的底物被分解代謝產(chǎn)生能量供菌體合成β-甘露聚糖酶使用，同時，當(dāng)β-甘露聚糖酶合成通量最大時，有17.87%的底物分配到HMP途徑，與表3A中的HMP途徑的通量相比，表3中HMP途徑的通量增加了107.31%。說明當(dāng)菌體進行外源蛋白β-甘露聚糖酶表達時，菌體對HMP途徑產(chǎn)生還原力的需求更旺盛。

2.3 代謝節(jié)點分析

葡萄糖-6-磷酸連接著糖酵解途徑和戊糖磷酸途徑；丙酮酸連接著糖酵解途徑、檸檬酸循環(huán)途徑和部分氨基酸合成途徑；這兩個節(jié)點在生化網(wǎng)絡(luò)中是關(guān)鍵性的節(jié)點，所以選擇這兩個節(jié)點進行分析。

2.3.1 葡糖糖-6-磷酸節(jié)點代謝流分析

兩種不同極端代謝流在葡萄糖-6-磷酸節(jié)點的流向如圖2所示，葡萄糖-6-磷酸一部分流向果糖-6-磷酸進入糖酵解途徑，另一部分流向核糖-5-磷酸進入戊糖磷酸途徑。

由圖2可知，在兩種極端代謝流分布情況下，葡萄糖-6-磷酸代謝流進入糖酵解途徑（91.38/82.13mmol（/g·h））都占主導(dǎo)地位，剩余部分進入磷酸戊糖途徑（8.62/17.87mmol（/g·h）），但兩種情況下的代謝流分配仍有差異。進入糖酵解途徑的代謝流在以菌體合成為主時較高，相反，進入戊糖磷酸途徑的代謝流在以β-甘露聚糖酶合成為主時較高。結(jié)果表明，無論是合成菌體還是合成外源蛋白β-甘露聚糖酶，都需要大量的能量供給，并且在合成β-甘露聚糖酶時，菌體對戊糖磷酸途徑的依賴性更高，同時也表明，葡萄糖-6-磷酸節(jié)點是一個受外界調(diào)控的節(jié)點。

圖2 葡糖糖-6-磷酸節(jié)點代謝流分布Fig. 2 Metabolic flux distributions at glucose-6-phosphate node

2.3.2 丙酮酸節(jié)點代謝流分析

丙酮酸節(jié)點代謝流分布如圖3所示，共有5部分構(gòu)成，包括葡萄糖、磷酸烯醇式丙酮酸、草酰乙酸、乙酰輔酶A、氨基酸。

圖3 丙酮酸節(jié)點代謝流分布Fig. 3 Metabolic flux distributions at pyruvate node

由圖3可知，由于兩種極端情況下，葡萄糖-6-磷酸節(jié)點流向糖酵解的通量不同（91.38/82.13 mmol（/g·h）），導(dǎo)致了兩種極端情況下磷酸烯醇式丙酮酸流向丙酮酸通量的差異（74.25/55.87 mmol（/g·h）），也間接導(dǎo)致了丙酮酸流向乙酰輔酶A通量的差異（113.75/98.29 mmol（/g·h））。在兩種極端條件下，丙酮酸流向草酰乙酸的通量是極度保守的（33.41/34.12 mmol（/g·h）），同時流向氨基酸的通量差異也很?。?7.09/23.48 mmol（/g·h）），這些現(xiàn)象證實了丙酮酸節(jié)點是一個剛性節(jié)點，不受外界調(diào)控，與QUIRóS M等[20]的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了基因工程大腸桿菌（Escherichia coli）BL21合成β-甘露聚糖酶的代謝網(wǎng)絡(luò)，建立了基于物料平衡的代謝流模型，并通過分批發(fā)酵驗證模型是可靠的，應(yīng)用該模型計算出最大菌體合成通量為9.39 h-1，最大β-甘露聚糖酶合成通量為0.18 mmol（/g·h）。菌體在合成β-甘露聚糖酶時，流向HMP途徑的碳骨架增加了107.31%，HMP途徑更為活躍。葡萄糖-6-磷酸節(jié)點是一個可調(diào)控的節(jié)點，而丙酮酸節(jié)點受外界環(huán)境調(diào)控較小，為理性改造產(chǎn)β-甘露聚糖酶大腸桿菌提供了理論基礎(chǔ)，同時也為β-甘露聚糖酶的生產(chǎn)指明了調(diào)控方向。