三種修復劑對稻米甲基汞富集的影響研究

趙家印，王永杰，鐘 寰*

（1.污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學環(huán)境學院，南京210023；2.華東師范大學地理科學學院，上海200241）

近年來，稻田土壤汞（Hg）污染越來越受到人們的關注[1-2]。其重要原因是：（1）稻米極易富集甲基汞（MeHg）[2]；（2）全球40%以上人口以稻米作為主食，尤其在東亞及東南亞地區(qū)。根據原環(huán)境保護部和國土資源部調查顯示，中國土壤Hg 污染點位超標率達1.6%[3]。由于土壤資源緊缺，很多Hg 污染地區(qū)（如汞礦區(qū)）仍然進行水稻栽種，導致Hg污染區(qū)居民因攝食稻米而MeHg 暴露風險大幅增加[4]，由此造成了局部地區(qū)較為嚴重的稻米食品安全問題。另外，即使在非汞礦區(qū)，中輕度Hg 污染稻田也可能在一定程度上導致稻米總Hg 含量超過國家食品安全標準（20 μg·kg-1）。此外，大量研究表明稻米中Hg 絕大部分以MeHg 形態(tài)存在[2，5]。因此，降低稻米MeHg 累積對于減輕稻米MeHg人體暴露風險具有十分重要的意義。

目前，應用于土壤Hg 污染修復的方法主要包括物理法、物理化學法以及植物修復法等[6]，但對稻田土壤Hg 污染修復仍缺乏有效可行的修復技術，而且已有的修復方法研究大多缺少實際田間試驗應用。如已有的盆栽及田間試驗表明，土壤中施加一定的硒肥可以顯著降低土壤中MeHg 濃度，從而降低稻米MeHg 富集[7-9]。另有研究表明，施用有機肥可對重金屬的生物可利用性及其在植物體內的累積產生重要影響[10]；甲殼素因其本身含有大量羥基、氨基及乙酰氨基等基團可與重金屬絡合而被廣泛用于修復重金屬污染水體[11]。但是應用有機肥和甲殼素于土壤汞污染修復的研究鮮有報道。

本研究以南京市某地Hg 污染稻田為研究對象，研究對比在實際大田環(huán)境中3 種低成本修復劑硒肥、秸稈堆肥和甲殼素對土壤MeHg 和稻米MeHg 累積的影響及其可能的作用機理，以期為降低稻田Hg 風險和保證稻米食品安全提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗田及修復材料

修復試驗田位于江蘇省南京市某地，該地土壤總Hg 及MeHg 濃度分別為（877±117）μg·kg-1及（1.8±0.3）μg·kg-1，是由人為污染導致的中輕度Hg 污染土壤。該地區(qū)農業(yè)種植情況為一年兩季，稻麥輪作，土壤有機碳含量為（3.9±0.5）%，pH為5.7±0.3。

試驗用硒肥（亞硒酸鈉）購于河南博特爾化工產品有限公司，甲殼素購于上海生物科技發(fā)展有限公司。小麥堆肥秸稈為收集田間小麥秸稈處理所得。具體方法：將收集后的小麥秸稈用去離子水清洗干凈，風干粉碎（1～2 cm），然后將其放于黑色塑料容器中，加水密封，避光置于恒溫培養(yǎng)箱中（14 d，30 ℃）烘干備用。水稻品種為南粳46。

1.2 試驗過程

試驗共設置4 個處理組，每組3 個平行。處理組分別為：對照（不加修復劑）組和硒肥、秸稈堆肥、甲殼素添加組。在試驗田將PVC 板插入土中深約20 cm，分隔出12個相互獨立的1 m2小區(qū)，編號1～12，每個小區(qū)間隔3 m，以避免小區(qū)之間可能的交叉污染。此外，土壤上覆水中的總Hg 及MeHg 濃度極低（分別小于0.05 μg·L-1及0.05 ng·L-1），因此，灌排水對土壤總Hg及MeHg的影響極小，可忽略不計。充分考慮實際生產活動，硒肥的施用量為1 g·m-2亞硒酸鈉，以硒計為1.5 mg·kg-1[12]，成本約為6960 元·hm-2。堆肥秸稈和甲殼素的施用量均為1 kg·m-2，施肥約為0.20%（質量比）[13]，修復成本分別約為1500 元·hm-2及15 000元·hm-2。計算肥土比均按20 cm深度土層計算，土壤密度假設為2.2 g·cm-3。施加方法：將亞硒酸鈉溶于一定體積的水中，均勻噴灑在試驗區(qū)（硒肥），堆肥秸稈和甲殼素均勻撒在試驗區(qū)。施加修復劑后，對土壤耕作層（0～20 cm）進行翻耕，淹水平衡7 d后，插秧。

水稻生長周期內，土壤均處于淹水狀態(tài)，其他田間管理參照當地農民的種植習慣。分別在0 d（插秧當日）、10 d（分蘗拔節(jié)期）、40 d（分蘗拔節(jié)期）、80 d（抽穗揚花期）、100 d（灌漿成熟期）和130 d（成熟期），采集土壤表層5～15 cm 處土樣，樣品采集后立即置于50 mL 聚丙烯離心管中，密封保存，并置于冰袋中轉移至實驗室。在實驗室中，將離心管轉移到厭氧包中（厭氧包充滿氮氣），分別取出適量的樣品于15 mL 離心管中，用于分析土壤MeHg 濃度和土壤MeHg的萃取效率（植物可利用性）[14]。在厭氧條件下處理樣品，以盡量接近實際稻田土壤厭氧條件，并避免氧化對MeHg 萃取效率影響[14]，在水稻成熟期，每個小區(qū)隨機收集3 株水稻的稻米和秸稈（莖和葉）樣品，用去離子水清洗干凈，烘干（40 ℃），稱質量測定水稻地上部生物量。最后樣品粉碎、過篩（100 目）用于測定MeHg濃度。

1.3 分析方法

采用美國Brooks Rand MERX 全自動甲基汞分析儀測定土壤及植物樣品中MeHg。參照美國環(huán)境保護署方法1630（USEPA method 1630），該方法已廣泛應用于土壤及植物中MeHg 濃度的測定[15-16]，方法檢出限為0.002 μg·kg-1。具體如下：取適量樣品于15 mL離心管中，加入2 mL 氫氧化鉀-甲醇溶液（25%，質量比），超聲15 min，渦旋混勻后放于恒溫振蕩箱中消解約4.5 h（250 r·min-1，60 ℃），冷卻定容后，離心（20 min，4000 r·min-1，25 ℃）過濾上清液。濾液經乙基化反應后上機測試。

MeHg 萃取方法：參考已有研究報道方法[14]，使用硫代硫酸銨[（NH4）2S2O3]萃取法萃取土壤中的MeHg，具體為：將約1 g 新鮮土壤和2.5 mL 的硫代硫酸銨溶液（2 g·L-1）混勻于15 mL 離心管中，置于恒溫振蕩器振蕩大于12 h（280 r·min-1，25 ℃），離心，過濾（0.45 μm）后取上清液。上清液及萃取后殘態(tài)土壤使用上述氫氧化鉀-甲醇溶液消解后，上機測試。同時，測定土壤有機質等參數[16]。

1.4 質量控制與統(tǒng)計分析

采用沉積物標準物質（ERM-CC580）為質控樣品，與樣品采用相同消解方法，回收率為83%～109%。土壤MeHg 萃取方法使用加標回收的方式質控，加標回收率為88%～110%。硫代硫酸銨萃取MeHg與殘態(tài)MeHg 加和值與直接測定的土壤MeHg 濃度比值為85%～97%。

試驗結果差異比較均采用單因素方差分析（One-way ANOVA，SPSS16.0）進行統(tǒng)計學檢驗。

2 結果與討論

2.1 不同修復劑對水稻地上部MeHg累積的影響

收獲期，對照、硒肥、秸稈堆肥及甲殼素處理組稻米總Hg 濃度分別為（21.1±1.2）、（10.4±0.8）、（8.3±1.2）μg·kg-1和（21.3±1.5）μg·kg-1。對照組及甲殼素處理組Hg 濃度均超過國家食品安全標準（20 μg·kg-1）[17]。就MeHg 含量而言，如圖1 所示，修復劑對稻米及秸稈（地上部）MeHg 濃度的影響存在顯著差異。相對于對照組，硒肥和秸稈堆肥組均顯著降低了稻米和秸稈中MeHg 濃度（P＜0.05），但兩者沒有顯著差異。硒肥和秸稈堆肥組，稻米MeHg 濃度分別降低35%和52%，秸稈MeHg 濃度分別降低46%和57%。甲殼素組水稻地上部MeHg 濃度與對照組相比，沒有顯著差異，表明甲殼素對水稻MeHg 累積的影響可能是微弱的。

圖1 水稻地上部各組織（稻米和秸稈）中MeHg濃度Figure 1 Concentrations of MeHg in rice gain and straw

表1表明：與對照相比，3種修復劑中秸稈堆肥顯著提高了稻米、秸稈及總地上部生物量（分別增加了45%、28%和38%，P＜0.05），而硒肥和甲殼素施用僅略微增加了水稻地上部生物量。就水稻地上部MeHg累積量而言，各處理組與對照組相比沒有顯著降低，這表明了秸稈堆肥組中“生物量稀釋效應”[13]可能是導致水稻地上部MeHg 濃度降低的原因之一。秸稈堆肥作為一種有機肥，可改善土壤理化性質及提高土壤肥力，促進作物生長[18]，最終導致稻米和秸稈中Me-Hg濃度降低。

2.2 不同修復劑對土壤MeHg及其植物可利用性的影響

3 種修復劑對土壤MeHg 濃度的影響同樣存在顯著差異。如圖2A 所示，水稻生長期間所有處理組土壤MeHg 變化范圍為0.38～2.3 μg·kg-1。在水稻生長前期（10～80 d），硒肥組土壤MeHg 濃度顯著降低55%～69%（P＜0.05）。在40～100 d，秸稈堆肥組土壤MeHg 濃度顯著降低（45%～64%，P＜0.05）。甲殼素施用對土壤MeHg 濃度沒有顯著影響。土壤中MeHg 的硫代硫酸銨萃取效率可以表征土壤中MeHg 的植物可利用性[14]。如圖2B 所示，在10 d 和100 d，秸稈堆肥組的硫代硫酸銨萃取效率顯著降低（P＜0.05），表明秸稈堆肥可能會降低MeHg 的植物可利用性，進而降低水稻各組織中MeHg 累積。與對照組相比，硒肥和甲殼素組中MeHg 的硫代硫酸銨萃取效率沒有顯著變化。上述結果表明，硒肥和秸稈堆肥在影響水稻MeHg累積方面既有相同也有不同，即：秸稈堆肥既降低土壤MeHg 生成，也降低MeHg 植物可利用性，而硒肥只影響土壤MeHg 生成，不影響MeHg 植物可利用性。土壤中MeHg 含量及其植物可利用性變化決定著稻米中MeHg累積變化。

2.3 不同修復劑降低稻米MeHg累積的可能機理

土壤-水稻體系中“汞-硒拮抗”作用為使用硒降低稻米MeHg提供了科學理論依據[19]。如野外調查研究表明，在萬山汞礦區(qū)，隨土壤中硒含量增加稻米中無機汞和MeHg 含量不斷降低[19]；Wang 等[20]的盆栽試驗表明，施加不同劑量的硒（3.0～6.0 mg·kg-1），稻米中MeHg的濃度降低最大可達72%。本試驗的研究結果進一步證實了土壤施硒可以有效降低稻米中MeHg含量（圖1）。其主要原因可能是硒導致土壤中無機汞的生物可利用性降低，進而降低土壤MeHg 的生成。在水稻生長期，土壤中高價態(tài)的硒（Se6+或Se4+）在還原條件下轉化為低價態(tài)硒（Se0或Se2-），并與無機汞結合生成惰性硒化汞[20]，進而降低土壤MeHg 的生成（圖2A），但是硒的轉化并沒有改變土壤中MeHg的植物可利用性（圖2B）。

多項研究表明，土壤中有機質對Hg 的行為有著十分重要的調控作用。如秸稈直接還田可增加稻米中MeHg 含量[16]，這可能是秸稈腐解產生大量活性有機質可促進土壤中汞的甲基化作用所致；有研究表明，有機質降解轉化所形成的腐殖質通常會抑制汞的甲基化[21-22]。本試驗中，一方面秸稈堆肥中含有的大量腐植酸等大分子有機質[23]可能與無機汞絡合，從而固定土壤無機汞，降低MeHg的生成[21]。另一方面，在水稻生長期，土壤中硫酸鹽還原可能與秸稈堆肥中的腐植酸相互作用生成新還原性有機硫官能團，如巰基等[23-25]，這些還原性有機硫可能顯著降低了土壤中MeHg 的植物可利用性。因此，秸稈堆肥降低水稻組織中MeHg 濃度可能是緣于腐植酸既抑制了土壤MeHg生成，又降低了MeHg的植物可利用性。

此外，生物累積因子（BAF，計算方法：130 d 時水稻組織中MeHg 濃度/130 d 時土壤MeHg 濃度）結果（圖3A）顯示，在硒肥組稻米及秸稈中MeHg的生物累積因子顯著低于對照組，這表明了在硒肥施用條件下土壤中MeHg 難以轉運到水稻秸稈及稻米中。Zhang等[19]研究結果表明，水稻根部形成的硒化汞可能是降低MeHg 或無機汞轉運的主要原因之一。Wang等[20]盆栽試驗結果表明，土壤施硒肥對MeHg 在水稻各組織中的分配有一定的影響，如土壤施硒略微增加MeHg 在水稻根部的分配比例。因此，硒肥施用條件下BAF 的降低可能是水稻根部“汞-硒拮抗”作用的結果。但是，稻米和秸稈MeHg 濃度與土壤中硫代硫酸銨萃取濃度的相關性（圖3B）表明，土壤中MeHg含量及植物可利用性很大程度決定了稻米MeHg 濃度。

3 結論

圖3 水稻地上部各組織（稻米及秸稈）中MeHg的生物累積因子（A）及其MeHg濃度與土壤平均可萃取MeHg濃度（10～130 d）的線性關系（B）Figure 3 The MeHg bioaccumulation factors（BAFs）of rice grain and straw（A）and the relationship（B）between MeHg levels in rice aboveground tissues and the time-averaged MeHg concentrations extracted by（NH4）2S2O3 in soil（days 10～130）

（1）施用一定量的硒肥及秸稈堆肥可顯著降低稻米中MeHg 的累積，而施用甲殼素對水稻中MeHg 累積沒有顯著影響。因此，稻田汞污染修復中可考慮硒肥和秸稈堆肥及兩者的聯(lián)合施用技術，并進一步檢驗這兩種修復劑的長期有效性。

（2）施加硒肥和秸稈堆肥降低稻米中MeHg 累積的主要原因有：一方面，硒和秸稈腐殖質降低土壤中無機汞活性，進而降低MeHg 濃度，最終導致稻米MeHg累積降低。另一方面，秸稈腐殖質降低土壤中MeHg植物可利用性及水稻根部發(fā)生“汞-硒拮抗”作用可能在降低稻米中MeHg的累積方面起到一定作用。