雞糞-堆肥中重金屬殘留、抗生素耐藥基因及細(xì)菌群落變化研究

鄧雯文，陳姝娟，何雪萍，晉 蕾，楊盛智，余秀梅，劉書亮，鄒立扣*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，成都611130；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，四川 雅安625014）

近年來，在國家一系列惠農(nóng)政策的支持下，集約化的畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速。集約化養(yǎng)殖在提高生產(chǎn)效率、降低死亡率方面起著重要作用[1-2]，但隨規(guī)模養(yǎng)殖的增加而產(chǎn)生的大量畜禽糞便，已成為我國最主要的農(nóng)業(yè)面源污染源之一[3]。規(guī)?；半u場被認(rèn)為是養(yǎng)禽業(yè)中的污染大戶，按成年蛋雞每日產(chǎn)生0.1～0.16 kg 的糞便計算，僅全國蛋雞每日就可產(chǎn)生14萬t左右的糞便。如此大量的糞便為其處理帶來了難題，如果處理不當(dāng)則可能造成嚴(yán)重的環(huán)境污染[4]。

由于一些重金屬能夠防治疾病，促進(jìn)畜禽生長，如Cu、Mn 和Zn 在集約化養(yǎng)殖中得到了廣泛使用，然而這些微量元素使用存在超量添加的現(xiàn)象[5]。同時，由于國內(nèi)礦產(chǎn)資源多屬伴生礦，也引入了對動物和環(huán)境有害的Cd、Pb等重金屬。研究表明，重金屬不能被畜禽完全吸收且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可隨糞便排出體外，若將糞便直接施用到農(nóng)田土壤環(huán)境中，可能造成土壤中重金屬污染[6-8]。此外，抗生素在畜禽養(yǎng)殖中的廣泛和長期使用導(dǎo)致耐藥細(xì)菌在腸道中積累，并伴隨糞便排泄出體外，使糞便成為抗生素耐藥菌和耐藥基因的重要儲存庫。Yang 等[9]研究發(fā)現(xiàn)雞糞中存在大量耐藥細(xì)菌，其中Sphingobacterium，Myroides 和Coma?monas 為主要的多重耐藥細(xì)菌。由于耐藥基因具有水平轉(zhuǎn)移特性，即便攜帶耐藥基因的細(xì)菌死亡或裂解，耐藥基因仍然可以在不同環(huán)境中傳播[10]。而重金屬對抗生素耐藥基因有長期選擇壓力，加劇了耐藥基因的污染[11]。

通過微生物堆肥發(fā)酵技術(shù)將雞糞制成優(yōu)質(zhì)的生物肥料，并將其施用到農(nóng)田中是一種廣泛應(yīng)用的處理方式，也是實現(xiàn)雞糞減量化、無害化和資源化的有效方法之一[12]。雞糞中含有豐富的有機(jī)質(zhì)及大量農(nóng)作物生長所必需的氮、磷、鉀等元素，堆肥后將其施用到農(nóng)田中，可保持土壤肥力，促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展[3]。堆肥是利用微生物在一定條件下將復(fù)雜有機(jī)物分解為腐殖質(zhì)，并且在分解過程中產(chǎn)生高溫殺死病原微生物、寄生蟲等，同時消減抗生素耐藥基因，最終達(dá)到無害化和資源化的目的[11,13]。堆肥過程中的微生物菌系復(fù)雜，由于可培養(yǎng)技術(shù)的局限性，難以完全認(rèn)識其中微生物群落組成及豐度情況。近年來，微生物多樣性高通量測序技術(shù)極大地推動了微生物群落的研究，因此，利用高通量測序技術(shù)研究雞糞堆肥發(fā)酵中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性變化，可深入了解不同堆肥發(fā)酵階段細(xì)菌菌群的組成及其演替過程。

目前，國內(nèi)外開展大量研究主要針對畜禽糞便處理中微生物群落結(jié)構(gòu)組成情況、養(yǎng)分、重金屬或抗生素耐藥基因等單一因素進(jìn)行考察，缺乏對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、養(yǎng)分、重金屬及抗生素耐藥基因在畜禽糞便-生物處理全過程中的階段性變化進(jìn)行考察。此外，大多數(shù)堆肥研究主要通過堆肥試驗進(jìn)行，而針對實際生產(chǎn)中規(guī)?；逊侍幚懋a(chǎn)業(yè)中的樣品研究較少。綜上，本研究以某規(guī)?；u糞處理廠中鮮雞糞、堆肥發(fā)酵雞糞為研究對象，一方面研究養(yǎng)分、重金屬及抗生素耐藥基因在雞糞堆肥過程中變化規(guī)律，另一方面利用高通量測序技術(shù)研究雞糞堆肥過程中細(xì)菌群落的演替規(guī)律，分析細(xì)菌菌群與養(yǎng)分、重金屬及抗生素耐藥基因的相關(guān)性，為實際生產(chǎn)過程中雞糞的安全高效使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及前處理

新鮮雞糞及堆肥處理的雞糞樣品取自某規(guī)?；半u養(yǎng)殖場及其堆肥場（養(yǎng)殖規(guī)模＞20 萬只）。將新鮮雞糞（不含墊料）與麥麩、蔗渣按質(zhì)量比5∶3∶2 混勻后進(jìn)行發(fā)酵，其中麥麩的含水量為11.3%，粗纖維含量為16.5%，總灰分為31.8 g·kg-1，蔗渣的pH 值為5，含水量為23.1%，粗纖維含量為46.5%，總碳含量為421 g·kg-1。發(fā)酵過程分為一次發(fā)酵和二次發(fā)酵，其中一次發(fā)酵采用好氧發(fā)酵，發(fā)酵14 d，發(fā)酵槽寬度約為6 m，高度約為1.5 m，長度為80 m，每日翻堆一次。經(jīng)一次發(fā)酵后，樣品采用堆儲發(fā)酵的方式進(jìn)行二次發(fā)酵，發(fā)酵約1個月，錐形堆體直徑和高約2～3 m。分別采集新鮮雞糞（FM）、一次發(fā)酵樣品（FC）及二次發(fā)酵樣品（SC），每一份樣品平行采集3 次，充分混合均勻后得到FM 樣品3個、FC樣品4個、SC樣品5個。采集的樣品一份室溫風(fēng)干后粉碎過2 mm 篩，用于理化指標(biāo)檢測[14]。一份于105 ℃烘干后粉碎過0.15 mm篩，用于測定重金屬[15-16]。一份放置于-80 ℃冰箱，用于DNA提取。

1.2 養(yǎng)分測定

pH 值、全量氮磷鉀測定方法參照魯如坤的方法[17]。pH 值采用電位法測定（水樣比2.5∶1）。樣品經(jīng)96%H2SO4和30%H2O2消煮后，全氮采用凱氏定氮法測定，全磷采用分光光度計法測定，全鉀采用火焰光度計法測定。有機(jī)質(zhì)依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)NY525—2012[18]，采用重鉻酸鉀容量法測定。

1.3 重金屬測定

全量重金屬As、Cd、Cu、Mn、Pb 及Zn 的測定參照Sastrel 等[19]和H?lzel 等[16]的方法。取3 g 樣品放入250 mL 消化管中，加入28 mL 37%HCl 與70%HNO3（VHCl∶VHNO3=3∶1），搖勻后于室溫下靜置16 h，隨后將懸濁液于130 ℃消煮2 h。消煮后的懸濁液通過濾紙（Ashless Whatman 41，UK）過濾后，加入100 mL 0.5 mol·L-1HNO3稀釋待測。采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-OES，Thermo iCAP 6000，UK）測定重金屬含量。

1.4 樣品總DNA的提取

用Mobio Power Fecal DNA Isolation Kit 試劑盒提取樣品中細(xì)菌DNA，具體步驟參照操作說明書。提取后的DNA置于-80 ℃保存。

1.5 抗生素耐藥基因測定

采用實時熒光定量PCR（Bio-rad iQ5 real time PCR dectection system，USA）對抗生素耐藥基因進(jìn)行檢測。檢測耐藥基因包括sul1[20]，ermB[21]，blaCTXM[22]，tetM[23]，aac（6′）-Ib-cr（F-5′-CACCGGAAACATCGCTGCA-3′；R-5′-AAGTTCCGCCGCAAGGCT-3′）。檢測主要參照Chen 等[24]和Zhu 等[22]的方法，按以下反應(yīng)體系進(jìn)行：10 μL SYBR Premix Ex Taq?，上、下游引物各0.2 μmol·L-1，1 μL 模板，加ddH2O 補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃變性5 min；95 ℃10 s，退火溫度20 s，72 ℃30 s，共40 個循環(huán)；熒光采集72 ℃；熔點曲線溫度設(shè)定范圍為60～95 ℃。每個DNA樣品重復(fù)3次。

1.6 PCR擴(kuò)增及高通量測序

選 用16S rRNA V4 區(qū) 引 物（520 F-5′ -AYTGGGYDTAAAGNG-3′；802R-5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′）對細(xì)菌DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增體系：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃15 s，50 ℃30 s，72 ℃30 s，共26個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min；12 ℃結(jié)束反應(yīng)，最后采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將檢測合格的DNA送于上海派森諾生物科技有限公司采用Illumina Miseq測序平臺進(jìn)行高通量測序。

1.7 數(shù)據(jù)分析

高通量測序數(shù)據(jù)經(jīng)拼接、過濾、比對處理，得到最終的有效數(shù)據(jù)（Effective tags）[25]。利用Uparse 軟件[26]對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTUs（Operational Taxonomic Units）聚類。用Mothur 方法與SILVA 的SSUrRNA 數(shù)據(jù)庫[27]對OTUs 代表序列進(jìn)行物種注釋分析，獲得對應(yīng)物種信息及在各個分類水平[28]物種豐度情況。對樣品使用Qiime軟件計算Alpha多樣性指數(shù)，進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析。使用R 軟件繪制PCoA 圖，對不同樣品和分組的群落結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行分析。使用LEfSe 軟件繪制LEfSe 圖，默認(rèn)設(shè)置LDA Score 的篩選值為4，分析不同分組間物種差異[29]。使用R 軟件進(jìn)行Spearman 分析，研究細(xì)菌菌群組成與環(huán)境因子（理化指標(biāo)、重金屬和耐藥基因）之間的相關(guān)性。采用SPSS 軟件進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），對各環(huán)境因子在各分組間進(jìn)行差異顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥過程中養(yǎng)分變化情況

如表1 所示，隨堆肥進(jìn)程，pH 值、全磷、全鉀和全氮含量有不同程度增加，有機(jī)質(zhì)含量呈下降趨勢。其中，pH值在堆肥后（組FC和SC）顯著高于在鮮雞糞中（組FM）（P＜0.05），全磷含量在二次發(fā)酵后（組SC）顯著升高（P＜0.05）。全氮含量在組FC 中最高（16.29 g·kg-1），但與其他組全氮含量無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 堆肥過程中重金屬變化情況

共檢測了6 種重金屬的濃度（表2），結(jié)果顯示不同重金屬的濃度差異較大，其中Zn 和Mn 濃度最高，分別為275.67～443.91 mg·kg-1和330.90～389.55 mg·kg-1，Cd 濃度最低，為0.25～0.29 mg·kg-1。同一重金屬在不同組中的濃度呈波動變化，與組FM 相比，As、Cd濃度在組SC 中升高，Cu、Mn、Pb 和Zn 在組SC 中下降，但除Zn以外，其他重金屬濃度的組間差異并不顯著（P＞0.05）。

表1 堆肥過程中養(yǎng)分的變化Table 1 Variation of nutrients during composting

表2 堆肥過程中重金屬濃度變化（mg·kg-1）Table 2 Variation of heavy metals during composting（mg·kg-1）

2.3 堆肥過程中抗生素耐藥基因變化情況

檢測了抗生素耐藥基因sul1（磺胺類）、ermB（大環(huán)內(nèi)酯類）、tetM（四環(huán)素類）、blaCTX-M（β-內(nèi)酰胺類）和aac（6′）-Ib-cr（氨基糖苷類）的相對表達(dá)量（按照以10為底的對數(shù)轉(zhuǎn)化后進(jìn)行分析）。如表3 所示，在鮮雞糞中（組FM），耐藥基因的相對豐度值范圍為-5.03～-2.08，各耐藥基因的相對豐度值大小依次為：ermB＞tetM＞blaCTX-M＞sul1＞aac（6′）-Ib-cr。在堆肥過程中，除基因sul1，其他基因的相對豐度均呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢，其中基因tetM、ermB、blaCTX-M從組FM到SC顯著降低了1.08、1.99、2.78個數(shù)量級（P＜0.05）。

2.4 堆肥過程中細(xì)菌的組成

2.4.1 堆肥過程中細(xì)菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)

對12 個混合樣品進(jìn)行高通量測序分析，共獲得552 204 條有效序列。將OTU 按97%相似度聚類后得到3060個OTUs，在不同分組中共有OTU 數(shù)為694，在組FM、FC 和SC 中OTU 數(shù)呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，分別為2365、1974和2373。再通過系統(tǒng)發(fā)育分析得2界39門73綱140目236科501屬。

對各組菌群的Chao 1 指數(shù)和Simpson 指數(shù)及goods_coverage 指數(shù)進(jìn)行計算，根據(jù)表4 可見，Chao1指數(shù)在各組中大小為：FC＞SC＞FM，表明在發(fā)酵后樣品中細(xì)菌豐富度升高。Simpson 指數(shù)在各組中大小為：FM＞SC＞FC。表明發(fā)酵后樣品中細(xì)菌多樣性升高。各組中g(shù)oods_coverage 均超過0.99，說明樣品文庫的覆蓋率較高。對樣品進(jìn)行主坐標(biāo)分析（PcoA，Unweighted），以了解堆肥過程中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的變化。由圖1可得，F(xiàn)M組中樣品與FC組和SC組樣品距離較遠(yuǎn)，而SC 組中有2 個樣品與FC 組距離較近。結(jié)果表明發(fā)酵后的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相較于新鮮雞糞中發(fā)生了明顯改變，而在發(fā)酵過程中（組FC 和SC）的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有部分相似。

2.4.2 細(xì)菌的種類及變化

在門分類水平上，組FM、FC 和SC 中分別檢測到22、26 個和32 個門。物種相對豐度前10 的菌門如圖2 所示。在三個組中，均以厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）3個菌門為主，厚壁菌門呈現(xiàn)上升趨勢、擬桿菌門呈現(xiàn)下降趨勢。厚壁菌門的相對豐度在組FC中相對豐度最 高（49.63%），其 次 為 組SC（48.02%）和FM（28.52%），變形菌門在組FM 中相對豐度最高（29.10%），其次為組SC（25.02%）和FC（20.06%），擬桿菌門在組FM中相對豐度最高（34.89%），其次為FC（24.06%）和SC（12.08%）。

表4 堆肥過程中細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Table 4 Diversity index of bacterial community during composting

表3 堆肥過程中抗生素耐藥基因的變化Table 3 Variation of antibiotic resistance genes during composting

圖1 堆肥過程中細(xì)菌群落多樣性的主坐標(biāo)分析Figure 1 Principal Co-ordinates Analysis（PCoA）of bacterial community diversity during composting

圖2 門水平各組中細(xì)菌相對豐度情況Figure 2 Relative abundance of bacterial at phylum level in each group

在屬分類水平上，組FM、FC 和SC 中分別檢測到262、338 個和380 個屬，相對豐度前35 的物種如圖3所示，各組具有不同的優(yōu)勢物種。在組FM、FC 和SC中，分別有15、9 種和11 種物種的相對豐度高于其他組。其中，組FM 中相對豐度前五的物種為擬桿菌屬（Bacteroides）（20.92%）、不動桿菌屬（Acinetobacter）（7.50%）、假單胞菌屬（Pseudomonas）（4.31%）、理研菌屬（Rikenellaceae_RC9_gut_group）（3.35%）和乳桿菌屬（Lactobacillus）（3.15%），組FC 中為普氏菌屬（Pre?votella_6）（12.44%）、依格納季氏菌屬（Ignatzschineria）（10.74%）、Caldicoprobacte（3.72%）、無膽甾原體屬（Acholeplasma）（3.06%）和Paenalcaligenes（2.16%），組SC 中為鹽胞菌屬（Halocella）（8.14%）、假纖細(xì)芽孢桿菌 屬（Pseudogracilibacillus）（5.87%）、特 呂 珀 菌 屬（Truepera）（5.74%）、Caldicoprobacter（5.44%）和極小單胞菌屬（Pusillimonas）（3.12%）。對樣品中潛在病原菌菌屬進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bacteroides、Acineto?bacter 和Pseudomonas 等13 個菌屬在鮮雞糞中有較高的豐度，總相對豐度為50.70%。堆肥發(fā)酵后，病原菌豐度逐漸降低，在組FC和SC中為19.58%和2.97%。

2.4.3 LEfSe分析

對各分組樣品進(jìn)行LEfSe（LDA Effect Size）分析（P＜0.05，LDA＞4），結(jié)果顯示從門水平到屬水平，共有53 個物種具有組間顯著差異（圖4），包括1 門6 綱11目19 科16 屬。其中，在組FC 中顯著富集的物種最少，共9 個，而在組FM 中顯著富集的物種最多，為25個。在門水平上，Deinococcus_Thermus 在組SC 中的相對豐度顯著高于其他組。在屬水平上，共有8 個菌屬的相對豐度在組FM 中顯著較高，除Lactobacillus、Rikenellaceae_RC9_gut_group 和Megamonas 外，還 包括病原菌屬Bacteroides、Acinetobacter、Escherichia_Shi?gella、Enterococcus 和Desulfovibrio。在FC 組 中 菌 屬Prevotella_6、Mobilitalea 及病原菌屬Ignatzschineria 顯著較高。在SC 組中具有顯著差異的菌屬包括Halo?cella、Truepera、Pseudogracilibacillus、Caldicoprobacter和Pusillimonas。結(jié)果表明，大量病原菌屬在組FM 中顯著高于組SC，說明堆肥能顯著降低病原菌的相對豐度。

2.5 細(xì)菌菌群與環(huán)境因子相關(guān)性分析

通過Spearman 相關(guān)分析研究細(xì)菌豐度（屬水平）和環(huán)境因子之間的顯著相關(guān)性（P＜0.05 或＜0.01）。如表5 所示，不同養(yǎng)分指標(biāo)、重金屬和耐藥基因均與部分細(xì)菌豐度有顯著相關(guān)性，在養(yǎng)分指標(biāo)中，與全磷和pH 有顯著相關(guān)性的細(xì)菌數(shù)量較多，其中，全磷和pH與Bacteroides、Escherichia.Shigella、Lactobacillus、En?terococcus、Megamonas 和Desulfovibrio 呈顯著負(fù)相關(guān)，與Ureibacillus呈顯著正相關(guān)。在重金屬中，部分細(xì)菌與Cr、Cu 和Mn 有顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，與Cd 有顯著正相關(guān)，與Pb 和Zn 有顯著負(fù)相關(guān)。其中，Halocella、Caldicoprobacter 和Tepidimicrobium 與Cu、Mn 和Zn 均呈顯著負(fù)相關(guān)，Cellvibrio與Cu和Mn均呈顯著正相關(guān)。在耐藥基因中，基因sul1、ermB、tetM 和blaCTX-M 與大部分細(xì)菌有顯著正相關(guān)或負(fù)相關(guān)。其中，Bacteroi?des、Rikenellaceae_RC9_gut_group、Lactobacillus、En?terococcus、Megamonas 和Desulfovibrio 與ermB、tetM 和blaCTX-M 均呈顯著正相關(guān)，而與sul1呈顯著正相關(guān)。此外，基因aac（6′）-Ib-cr只與Psychrobacter有顯著正相關(guān)性。對病原菌屬與環(huán)境因子之間的顯著相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，病原菌屬與重金屬Cd和Cr、pH和TP、耐藥基因sul1 呈顯著負(fù)相關(guān)，與耐藥基因ermB、tetM 和blaCTX-M呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

圖3 屬水平各組中細(xì)菌相對豐度情況Figure 3 Relative abundance of bacterial at genus level in each group

3 討論

3.1 堆肥過程中養(yǎng)分、重金屬、耐藥基因的變化情況

本實驗堆肥過程中的pH 值為7.58（FC）和7.91（SC），處于堆肥微生物有較高的活性時所需的pH 值（6.7～9.0）范圍內(nèi)[30]。堆肥后，有機(jī)質(zhì)含量下降，這主要是由微生物降解、利用有機(jī)物，如糖類、脂肪和氨基酸等造成的[12，31]。與鮮雞糞（組FM）相比，全磷、全氮和全鉀的含量在二次發(fā)酵后（組SC）有不同程度的增加，這與劉微等[3]研究結(jié)果相似，主要是由于堆體總質(zhì)量下降，物料的“相對濃縮”作用所導(dǎo)致。從組FM到SC，全氮含量有所下降，這與有機(jī)氮分解釋放出揮發(fā)性氨氣，造成氮素?fù)p失有關(guān)[31]。

圖4 不同分組中差異物種進(jìn)化分支圖（A）和柱狀圖（B）Figure 4 Cladogram（A）and histogram（B）of taxon with statistical difference in different groups

表5 細(xì)菌菌屬的豐度與環(huán)境因子的相關(guān)性Table 5 The correlations between bacterial at genus level and environment factor

由于重金屬在堆肥過程中不可降解，因此將雞糞作為堆肥原料時，雞糞中的重金屬含量是影響有機(jī)肥中重金屬含量的重要因素[8]。各種重金屬含量在堆肥過程中有波動變化，由于堆肥過程中，有機(jī)質(zhì)降解及揮發(fā)性物質(zhì)損失，使堆體中干物質(zhì)總量不斷減少，產(chǎn)生的“濃縮效應(yīng)”使重金屬含量升高。此外，部分重金屬濃度在組FC 中低于組FM，尤其是Zn，這是由于組FM 中堆肥輔料的添加對部分重金屬造成的稀釋作用。根據(jù)2012 年原農(nóng)業(yè)部發(fā)布的有機(jī)肥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY 525—2012）對As、Pb 和Cd 的限量值（15，50 mg·kg-1和3 mg·kg-1）[18]，本研究中經(jīng)二次發(fā)酵后樣品中As、Pb 和Cd 含量均不超標(biāo)，參照德國腐熟堆肥中部分重金屬限量標(biāo)準(zhǔn)（Cu ≤100 mg·kg-1，Zn≤400 mg·kg-1，Cd≤1.5 mg·kg-1，Pb≤150 mg·kg-1）[32]，經(jīng)二次發(fā)酵后樣品中Cu、Zn、Cd 和Pb 濃度均不超標(biāo)。此外，Zn、Mn 和Cu 在雞糞中濃度較高，這與其在飼料中大量添加有關(guān)[8]，同時也說明飼料中重金屬添加量不同導(dǎo)致雞糞中重金屬濃度有較大差異。

本實驗中不同抗生素耐藥基因在鮮雞糞中的相對豐度有差異，研究表明不同抗生素耐藥基因的相對豐度存在很大差異，Cui等[33]發(fā)現(xiàn)在雞糞堆肥發(fā)酵時，磺胺類耐藥基因比四環(huán)素類耐藥基因相對豐度更高，與本實驗結(jié)果不一致，這與不同地區(qū)抗生素的使用類型和使用量相關(guān)[11]。經(jīng)過堆肥發(fā)酵后，除基因sul1，其他基因的相對豐度均呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢。相似地，Wang 等[34]研究發(fā)現(xiàn)在豬糞堆肥發(fā)酵過程中，大部分耐藥基因的相對豐度有所降低，而基因tetA 的相對豐度呈上升趨勢，對抗生素耐藥基因的削減作用與堆肥原料和堆肥方式有關(guān)。此外，研究表明在堆肥發(fā)酵過程中，堆體溫度升高可殺滅部分耐藥基因宿主細(xì)菌，同時抑制耐藥基因在細(xì)菌之間的水平轉(zhuǎn)移，從而降低耐藥基因的豐度[35]。

3.2 堆肥過程中細(xì)菌群落演替情況

本研究采用Illumina Miseq 高通量測序技術(shù)對新鮮雞糞及堆肥處理的雞糞中細(xì)菌菌群進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在堆肥發(fā)酵后細(xì)菌多樣性增加，這主要是由于采樣時堆體溫度已下降，堆肥發(fā)酵的環(huán)境、堆肥輔料的添加有利于細(xì)菌生長造成的[36-37]。在三個組中，均以Firmicutes、Proteobacteria 和Bacteroidetes 為 主 要 菌門，并隨發(fā)酵過程的進(jìn)行各菌門相對豐度發(fā)生變化，這與相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果一致。Cui等[33]通過高通量測序技術(shù)研究了三種不同的雞糞堆肥發(fā)酵工藝，發(fā)現(xiàn)在不同的發(fā)酵階段中均以Firmicutes、Proteobacteria和Bacteroidetes 3 個菌門為主，其相對豐度隨發(fā)酵過程發(fā)生變化，所占比例為72.4%～93.46%。Song 等[36]利用DGGE 技術(shù)，檢測到雞糞發(fā)酵過程中，以Firmicutes、Proteobacteria 和Bacteroidetes 3 個菌門為主。在屬水平，各組中的優(yōu)勢菌屬組成不同，表明隨著堆肥發(fā)酵的進(jìn)行，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生演替。這與其他方式的雞糞堆肥發(fā)酵中細(xì)菌群落演替規(guī)律類似[38]。

畜禽糞便是病原微生物的主要載體[39]，本研究發(fā)現(xiàn)雞糞中存在多種病原菌屬。其中，Bacteroides 可引起人、動物腹瀉及動物子宮炎等疾病的發(fā)生[40-41]。Acinetobacter 屬中的A. Baumannii、A. Pittii、A. nosoco?mialis 和A. seifertii 為常見的院內(nèi)感染菌，A. Bauman?nii可引起醫(yī)院感染疾病的爆發(fā)[42]，尤其易導(dǎo)致腦膜炎等疾病的發(fā)生[43-44]。Pseudomonas 使人、動物和植物都可能致病，可引起人尿路、耳道、肺部感染和菌血癥等疾病[45]，同時也導(dǎo)致柑橘屬果樹易患柑桔枯萎病[46]。隨堆肥發(fā)酵進(jìn)行，所有病原菌的相對豐度均有效降低。進(jìn)一步利用LEfSe 分析各組中顯著差異的病原菌，發(fā)現(xiàn)Bacteroides、Acinetobacter、Escherichia-Shigella和Enterococcus在組FM中顯著較高（P＜0.05），也說明通過堆肥發(fā)酵能顯著降低以上病原菌的相對豐度。其他研究結(jié)果也表明堆肥發(fā)酵過程中產(chǎn)生的高溫能有效殺滅病原菌，降低病原菌隨有機(jī)肥進(jìn)入土壤的風(fēng)險[47-48]。

3.3 環(huán)境因子與細(xì)菌菌群的關(guān)系

對屬水平細(xì)菌相對豐度與養(yǎng)分、重金屬和耐藥基因間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，大部分優(yōu)勢菌屬與全磷和pH 有顯著相關(guān)性，表明全磷和pH 可能是影響細(xì)菌豐度的重要影響因子。由于大多數(shù)微生物細(xì)胞內(nèi)pH值通常接近中性值，細(xì)胞外的pH 值的變化會對細(xì)菌產(chǎn)生壓力[49]。因此，pH 值也是細(xì)菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)組成的重要影響因子[50]，進(jìn)而對堆肥過程產(chǎn)生影響[51]。重金屬Cd、Cr、Cu 和Mn 與部分優(yōu)勢菌屬有顯著相關(guān)性，其中Truepera、Limnochorda、Simiduia 和Cd，Parapedobacter、Galbibacter 和Cr，以及Cellvibrio 和Cu、Mn均呈顯著正相關(guān)，說明這些菌對重金屬具有吸附性、耐受性或減小毒性損傷的特點。目前，研究表明對重金屬具有吸附或耐受性的細(xì)菌存在于不同環(huán)境中，可以緩解重金屬毒性、修復(fù)重金屬污染[52-53]。Kamika等[54]發(fā)現(xiàn)Pseudomonas putida 和Bacillus lichen?iformis 通過生物吸附和富集作用，可有效治理廢水中重金屬Co、Ni、Mn、Pb、Ti、Cu、Al和Zn 污染。此外，景炬輝等[55]研究發(fā)現(xiàn)在尾礦廢棄地中鞘脂單胞菌科相對豐度與重金屬濃度顯著正相關(guān)，該科細(xì)菌對重金屬具有一定的耐受性，可作為重金屬污染區(qū)域生態(tài)恢復(fù)的理想菌種。

研究發(fā)現(xiàn)部分菌屬與檢測耐藥基因有顯著正相關(guān)性，提示這些菌屬為耐藥基因的宿主菌，與耐藥基因的富集有關(guān)，可導(dǎo)致耐藥基因的廣泛傳播。其中，潛在病原菌屬Bacteroides、Enterococcus 和Desulfovibrio與基因ermB、tetM 和blaCTX-M 均呈顯著正相關(guān)，Aci?netobacter、Escherichia_Shigella 和Arcobacter 與 基 因ermB 和blaCTX-M 均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。若這些具有耐藥性的病原菌不經(jīng)有效堆肥處理，則很有可能隨施肥進(jìn)入食物鏈，進(jìn)而嚴(yán)重威脅人體健康。越來越多研究者發(fā)現(xiàn)畜禽糞便中病原菌和耐藥基因存在一定的正相關(guān)，并出現(xiàn)多重耐藥的趨勢。Fang等[56]發(fā)現(xiàn)雞糞中病原菌攜帶大量耐藥基因，其優(yōu)勢病原菌屬Bacillus anthracis、Bordetella pertussis 和B. Anthracis 與基因sul1 呈顯著正相關(guān)。在豬糞堆肥發(fā)酵過程中，Acinetobacter、Escherichia 與基因tetX 呈顯著正相關(guān)，同時，經(jīng)過堆肥發(fā)酵后，病原菌相對豐度的降低也是使耐藥基因相對豐度降低的原因之一[34]。

4 結(jié)論

（1）雞糞堆肥過程中，不同重金屬的濃度差異較大，其中Zn 和Mn 濃度最高，Cd 濃度最低。參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，堆肥后（組SC）樣品中重金屬濃度均不超標(biāo)。

（2）不同抗生素耐藥基因在鮮雞糞（組FM）中的相對豐度有差異，范圍為-5.03～-2.08。堆肥發(fā)酵過程能有效降低耐藥基因相對豐度，堆肥后（組SC），基因tetM、ermB、blaCTX-M 顯著降低了1.08、1.99、2.78個數(shù)量級（P＜0.05）。

（3）雞糞堆肥過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化顯著，在屬水平各組具有不同的優(yōu)勢物種。堆肥發(fā)酵過程能有效降低病原菌相對豐度，從50.70%（組FM）降低至2.97%（組SC）。

（4）環(huán)境因子對于細(xì)菌菌群豐度具有顯著影響（P＜0.05）。其中，部分細(xì)菌與重金屬呈顯著正相關(guān)性，提示這些細(xì)菌對重金屬具有吸附性或耐受性。部分潛在病原菌與耐藥基因呈顯著正相關(guān)，提示這些病原菌屬為耐藥基因的宿主菌。