銅綠假單胞菌吸附劑對水中菲-銅復合污染的吸附研究

張艷平，張 棟，劉興元，趙紅挺*

（1.杭州電子科技大學材料與環(huán)境工程學院，杭州310018；2.廣東大眾農(nóng)業(yè)科技股份有限公司，廣東 東莞523169）

疏水性有機物（Hydrophobic organic compounds，HOCs）和重金屬是環(huán)境中普遍共存的典型有毒有害污染物，其共存會產(chǎn)生復合效應[1-2]。復合污染效應常常難以用單一污染的作用和機理來解釋，過去依賴單一效應制定的有關(guān)評價標準也無法真實評價環(huán)境質(zhì)量，因此，復合污染的研究已成為環(huán)境科學發(fā)展的重要趨勢[3]。目前，單一重金屬的微生物吸附或低分子量HOCs的微生物吸附降解已有較廣泛的研究[4-19]，Chen 等[4]研究了活的和滅活的白腐真菌對不同疏水性PAHs 的吸附降解；Zhang 等[5-6]研究了克雷伯氏菌株在五種表面活性劑存在下對芘的增效吸附降解行為、微生物吸附降解界面行為，并綜述[7]了有機污染土壤的緩解及修復技術(shù)等；Reddy 等[8]研究了化學修飾生物材料對水溶液中Pb2+的生物吸附；Ge 等[11]研究了營養(yǎng)單胞菌同步Cr6+還原和Zn2+生物吸附及其相關(guān)基因構(gòu)成和表達。而有關(guān)HOCs 和重金屬復合污染的微生物修復及機理的研究不多見[20-21]，鄧軍等[20]研究了氧化節(jié)桿菌（Arthrobacter oxydans）對水體中苯并[a]芘-鎘復合污染物交互作用機理；Chen 等[22]利用微生物-植物組合在溫室下對PAH-金屬共污染土壤進行有效修復的研究。目前，對重金屬-HOCs 復合污染的研究主要集中于復合污染效應，其機理和環(huán)境過程的探討還很不夠，制約了復合污染的修復和機制研究。

為此，本文以菲、銅分別為HOCs 和重金屬的代表，以具有PAHs 高效降解能力和對重金屬有強耐受性的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）為實驗菌株，研究了P.aeruginosa 吸附劑對菲和銅復合污染的吸附作用，并初步探討了復合體系下相互影響的機制。利用掃描電鏡（SEM）觀察菲、銅單一及復合污染條件下吸附劑表面形態(tài)，并通過紅外光譜（FTIR）分析細菌吸附劑表面與吸附相關(guān)的主要基團，以期為微生物修復有機物和重金屬復合污染的機制研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

菲（純度97%，購自阿拉丁試劑有限公司，中國上海）；CuCl2、NaH2PO4、KH2PO4、K2HPO4、NH4Cl、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、CaCl2·2H2O 均購自廣州化學試劑廠，為AR 級；三乙醇胺、4-（2-吡啶偶氮）-間苯二酚、四硼酸鈉、乙醇、甲醇均購自上海阿拉丁試劑廠，AR 級，甲醇為HPLC級。

1.2 P.aeruginosa吸附劑制備

無機鹽培養(yǎng)基于121 ℃條件下滅菌20 min，接種PAHs高效降解能力和重金屬強耐受能力的銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）于培養(yǎng)基中，于（30±1）℃、150 r·min-1恒溫培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)，取菌液按1%體積比接種于新鮮培養(yǎng)基中。收獲對數(shù)生長末期的銅綠假單胞菌，于4000 r·min-1條件下離心5 min，生理鹽水清洗后收集菌體，于烘箱70 ℃下干燥，用瑪瑙研缽研磨成均勻粉末狀，得到失活菌體吸附劑，放置于真空干燥器中保存。

1.3 實驗設(shè)計

1.3.1 共存污染物對吸附劑吸附菲、銅的影響

在22 mL 樣品瓶中投加適量吸附劑（濃度為0.5 g·L-1），加入20 mL 菲-銅復合污染溶液（pH=5.0），溶液每組設(shè)置不同銅濃度（0～5 mg·L-1）和不同菲濃度（0～1 mg·L-1），在25 ℃下，150 r·min-1振蕩4 h 后，于離心機中4000 r·min-1離心5 min，取上清液測定菲和銅濃度。

1.3.2 吸附劑對菲-銅復合污染物的等溫吸附

在22 mL 樣品瓶中投加適量吸附劑（濃度為0.5 g·L-1），加入20 mL 菲-銅復合污染溶液（pH=5.0），其中一組銅濃度為5 mg·L-1時，菲濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1；另一組菲濃度為1.0 mg·L-1時，銅濃度為0、1、2、3、4、5 mg·L-1。分別在15、20、25、30 ℃和35 ℃下，150 r·min-1振蕩4 h 后，于離心機中4000 r·min-1離心5 min，取上清液測定菲和銅濃度。

1.3.3 投菌量對吸附劑吸附菲-銅復合污染物的影響

在22 mL 樣品瓶中投加不同的吸附劑濃度（0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0 g·L-1），加入20 mL 菲-銅復合污染溶液（pH =5.0），菲濃度為1.0 mg·L-1、銅濃度為5 mg·L-1，在25 ℃下，150 r·min-1振蕩4 h 后，于離心機中4000 r·min-1離心5 min，取上清液測定菲和銅濃度。

1.3.4 pH對吸附劑吸附菲-銅復合污染物的影響

在22 mL 樣品瓶中投加適量吸附劑（濃度為0.5 g·L-1），加入20 mL 不同pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）的菲-銅復合污染溶液，菲濃度為1.0 mg·L-1、銅濃度為5 mg·L-1，在25 ℃下，150 r·min-1振蕩4 h后，于離心機中4000 r·min-1離心5 min，取上清液測定菲和銅濃度。

1.3.5 吸附時間對吸附劑吸附菲-銅復合污染的影響

在22 mL 樣品瓶中投加適量吸附劑（濃度為0.5 g·L-1），加入20 mL 菲-銅復合污染溶液（pH=5.0），菲濃度為1.0 mg·L-1、銅濃度為5 mg·L-1，在25 ℃下，150 r·min-1振蕩不同時間（0、30、60、90、100、120、240、360、480 min）取樣，于離心機中4000 r·min-1離心5 min，取上清液測定菲和銅濃度。

1.4 分析方法

1.4.1 菲分析方法

采用高效液相色譜儀（Agilent 1260 Infinity）測定，分析條件：色譜柱為PAHs專用色譜柱（5 μm，4.6×250 mm）；熒光檢測器λex=244 nm，λem=360 nm；流動相為甲醇/水（95∶5，體積比），流速1.0 mL·min-1；柱溫40 ℃；進樣量0.2 μL。

1.4.2 銅分析方法

用4-（2-吡啶偶氮）-間苯二酚光度法對銅進行分析[23]。

1.4.3 菌體表面形態(tài)觀察

分別將吸附前以及吸附單一菲、銅和菲-銅復合污染體系的細胞經(jīng)清洗、戊二醛固定、乙醇梯度脫水、干燥、噴金等操作后于掃描電鏡（SEM）下觀察[24]。

1.4.4 菌體紅外光譜分析

分別將吸附前和吸附單一菲、銅和菲-銅復合污染體系的細胞加少量KBr 粉末混合并研磨、壓片后用傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR）測定紅外光譜[24]。

2 結(jié)果與討論

2.1 共存污染物對細菌吸附菲、銅的影響

由圖1 可以看出，在復合體系中，共存的菲或銅會顯著影響P. aeruginosa 吸附劑對銅或菲的吸附效果（表1），影響程度隨共存污染物濃度增大而增大。銅共存下（5 mg·L-1），吸附劑對菲的去除率最大提高了14.14%；而菲共存時（1.0 mg·L-1），吸附劑對銅的去除率下降了7.76%。共存污染物時，影響了吸附劑對銅和菲的吸附。

表1 實驗因子對吸附效果影響的顯著性分析Table 1 Significance analysis of the effects of experimental factors on adsorption effect

研究了25 ℃下，共存污染物時細菌吸附劑對菲和銅的等溫吸附，如圖2 所示。將吸附劑對菲和銅的吸附數(shù)據(jù)分別用線性模型（式1）和Langmuir 模型（式2）進行擬合，吸附參數(shù)列于表2。

式中：Kd表示菲的吸附系數(shù)，L·g-1；Ce表示平衡濃度，mg·L-1；KL表示銅的吸附系數(shù)，L·mg-1；Qe和Qm分別是平衡吸附量和飽和吸附量，mg·g-1；

從圖2 和表2 可以看出，細菌吸附劑對復合體系中菲的吸附符合線性模型，對復合體系中銅的吸附符合Langmuir 模型。隨著銅濃度的增加（0～5 mg·L-1），菲吸附系數(shù)與銅濃度呈正相關(guān)，Kd值從2.54 L·g-1增加到4.73 L·g-1（表2）。隨著菲濃度的增加（0～1 mg·L-1），銅的吸附系數(shù)KL從4.88 L·mg-1增加到5.06 L·mg-1。表明共存污染物會影響彼此的吸附系數(shù)改變細菌吸附性能。

溫度是影響吸附的主要原因之一，本文研究了吸附劑對復合污染體系在15～35 ℃對菲和銅的等溫吸附，如圖3 所示。對不同溫度下的菲、銅的吸附用模型擬合（圖3A，圖3B），并計算了不同溫度下的Kd、KL（表3）。在25 ℃，共存銅（5 mg·L-1）較單一體系，吸附劑對菲的吸附系數(shù)增大了1.86 倍（無銅時Kd為2.54 L·g-1）。銅的存在極大提高了吸附劑對菲的吸附能力，這與文獻報道相一致。25 ℃時，吸附劑對銅的吸附，共存菲（1.0 mg·L-1）時銅的吸附系數(shù)（KL）達到5.06 L·mg-1，飽和吸附量達到5.30 mg·g-1，單一體系KL為4.89 L·mg-1，單一體系Qm為5.51 mg·g-1，與文獻報道相當。

圖2 共存污染物對細菌吸附菲（A）和銅（B）的影響Figure 2 Influence of co-existing pollutants on biosorption of phenanthrene（A）and copper（B）

表2 共存污染物對細菌吸附菲（Kd）和銅（KL）的影響Table 2 Influence of co-existing pollutants on biosorption of phenanthrene（Kd）and copper（KL）

進一步研究了溫度對吸附系數(shù)的影響（圖4），可以看出隨溫度升高，吸附劑對菲和銅的吸附系數(shù)均顯著下降。如在共存銅下，相比于15 ℃，細菌對菲在35 ℃時的分配系數(shù)下降了52.63%。復合體系中，15 ℃下，細菌吸附劑對銅的吸附系數(shù)是35 ℃時的6.64倍。

表3 銅和菲復合體系等溫吸附模型擬合及各參數(shù)Table 3 Adsorption model fitting parameters for isotherm of copper and phenanthrene

圖3 復合體系中吸附劑對菲（A）和銅（B）的等溫吸附Figure 3 Adsorption isotherms of biosorbent on phenanthrene（A）and copper（B）in the combined pollutants system

圖4 溫度對菲Kd、銅KL的影響Figure 4 Influence of temperature on adsorption coefficient of phenanthrene（Kd）and copper（KL）

圖5 投菌量對菲、銅污染物去除率的影響Figure 5 Influence of the amount of bacteria on the removal rate of phenanthrene and copper pollutants

2.2 投菌量對吸附劑吸附菲-銅復合污染物的影響

吸附劑濃度是影響吸附的關(guān)鍵因素，實驗進一步探究了投菌量對吸附復合體系中菲、銅的影響。由圖5 可以看出，在單一體系和復合體系中，銅、菲的去除率隨投菌量的增加均呈現(xiàn)先增加后趨于平穩(wěn)的趨勢。復合體系中菲、銅的平衡狀態(tài)時去除率分別達77.37%、64.34%。吸附劑濃度在0.4～1.0 g·L-1時，復合體系中菲、銅均能達到較高去除率。

2.3 pH對吸附劑吸附菲-銅復合污染物的影響

pH是影響銅的去除的重要因素，研究結(jié)果（圖6）發(fā)現(xiàn)，單一、復合體系中隨pH 增大（3.0～5.5），銅的去除率顯著提高，從3.42%增大到30.01%，pH 為5 時銅的單一體系和復合體系去除率分別為46.03%和44.21%，有研究表明質(zhì)子化程度較高時，H+會占據(jù)大量吸附活性位點，隨著pH 的增加，質(zhì)子化程度降低，銅去除率有所增加。而細菌吸附菲對pH 不敏感，在pH=3.0～5.5 范圍時，菲的去除率在70%左右，沒有顯著性差異（表1）。

2.4 吸附劑吸附菲-銅復合污染物動力學

菲、銅吸附率隨時間的變化有相似趨勢（圖7），兩者在30 min 已達到吸附平衡，該菌對菲、銅的吸附行為用準二階動力學模型（式3）擬合（圖8），單一、復合體系中菲、銅準二級吸附動力學數(shù)率常數(shù)為0.208 0、0.046 8 g·mg-1·min-1和0.075 2、0.072 2 g·mg-1·min-1。

圖7 P.aeruginosa對菲、銅污染物吸附動力學Figure 7 Adsorption kinetics for phenanthrene and copper

圖8 準二級動力學擬合曲線Figure 8 Pseudo-second-order model fitting curves

準二級動力學模型公式

式中：t 表示吸附時間，min；Qe表示平衡吸附量，Qt表示時間為t時的吸附量，Ks表示二級吸附速率常數(shù)，g·mg-1·min-1

2.5 表征

為了初步探明復合體系中菲、銅對吸附劑影響的機制，采用掃描電鏡（SEM）和傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜法（FTIR）考察了吸附劑吸附污染物前后的細菌表面外觀形貌和官能團變化，如圖9 和圖10 所示。從圖9 的SEM圖像也可以看出，細菌吸附單一菲后菌表面樣貌并沒有發(fā)生顯著變化（如圖9a 和圖9b）；而吸附銅離子后，細菌表面呈現(xiàn)均勻的凹凸（如圖9c），圖9d對復合污染的吸附也可以看出細菌表面呈現(xiàn)均勻的凹凸，也說明細菌吸附菲、銅存在不同的表面吸附行為。

從圖10 可以看出，細菌吸附污染物之前，細菌表面官能團豐富，為吸附污染物提供了大量吸附位點。主要特征峰有3272～3289 cm-1處的吸收峰，來自細胞壁上蛋白質(zhì)不飽和碳的C-H、N-H 和O-H 的伸縮振動；2923～2934 cm-1處的吸收峰，為蛋白質(zhì)上飽和碳的C-H 鍵伸縮振動帶；2100～2400 cm-1是叁鍵和累積雙鍵區(qū)吸收峰，1627 cm-1的吸收峰，為酰胺Ⅰ帶，是C=O的伸縮振動；1538 cm-1的吸收峰，為酰胺Ⅱ帶，是N-H 的彎曲振動與C-N 伸縮振動的疊加，這兩個峰是蛋白質(zhì)的特征譜帶。1393、1455 cm-1的吸收峰，分別屬于蛋白質(zhì)分子中-CH3的對稱和反對稱彎曲振動；1227 cm-1附近的吸收峰是O-H 面內(nèi)彎曲振動，可能還有P=O 的伸縮振動；1053～1056 cm-1處的吸收峰主要來自糖環(huán)C-O-H 的伸縮振動，以及脂類C-O-C鍵的伸縮振動，可能也有-的伸縮振動。

圖9 細菌吸附污染物前后SEM圖（×10 000倍）Figure 9 SEM images before and after adsorption of bacteria（×10 000 times）

圖10 細菌吸附污染物前后的FTIR圖譜（A）和局部放大圖（B）Figure 10 FTIR spectra of bacteria before and after adsorption（A）and partial enlarged drawing（B）

菌體吸附菲前后并沒有顯著的官能團變化，兩者的紅外光譜極為相似，這與細菌吸附菲主要是分配作用而沒有改變/占用細菌表面官能團是一致的。

細菌對銅離子的吸附則主要表現(xiàn)為表面官能團絡(luò)合行為，導致細菌表面部分官能團被掩蔽，如圖10局部放大圖（B），細菌吸附單一銅、菲-銅復合污染物后，在2350 cm-1處的吸收峰變?nèi)酰砻骶w吸附過程同細胞的叁鍵和累積雙鍵官能團伸縮振動有關(guān)。同時，銅離子與細胞的叁鍵和累積雙鍵絡(luò)合后，影響了細菌吸附劑對復合污染的吸附。

3 結(jié)論

（1）復合體系中，溫度顯著影響P. aeruginosa 吸附劑對菲、銅的吸附。35 ℃時菲吸附系數(shù)（3.55 L·g-1）較15 ℃（7.49 L·g-1）下降了52.63%；銅的吸附系數(shù)從21.64 L·mg-1下降至3.84 L·mg-1。菲的等溫吸附用線性擬合，且吸附常數(shù)隨溫度升高而減小，銅的等溫吸附用Langmuir模型擬合，細菌吸附劑對其吸附能力隨著溫度增加而下降。pH 顯著影響銅的去除，對菲的吸附則影響不顯著。

（2）復合體系中，細菌吸附菲后細胞表面及表面官能團沒有改變/占用細菌表面官能團，吸附菲表現(xiàn)為分配作用，吸附銅離子后，細菌表面呈均勻凹凸，銅離子與細菌表面叁鍵和累積雙鍵官能團絡(luò)合后影響了復合污染的吸附。