遵義地區(qū)3種野生食用菌的分離與鑒定

孟慶峰, 張 旭, 祝倫偉, 付少彬

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院,貴州 遵義 563100；2.遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院,貴州 遵義 563100)

食用菌是高等真菌中可供人們食用的大型真菌(又稱(chēng)蕈菌)[1]。有研究表明，我國(guó)發(fā)現(xiàn)的野生食用菌已超過(guò)2 000種，其中，馴化栽培的種類(lèi)超過(guò)100種，商品化的種類(lèi)超過(guò)60種，而商品化的野生食用菌中常見(jiàn)的有平菇、香菇、金針菇、杏鮑菇、木耳等[2-4]，僅占食用菌的3%?？梢?jiàn)，目前我國(guó)野生食用菌具有很大開(kāi)發(fā)潛力。貴州生態(tài)環(huán)境良好、氣候條件適宜，野生食用菌資源是全國(guó)最豐富的地區(qū)之一。在食用菌的鑒定中，常依據(jù)食用菌的形態(tài)進(jìn)行確定，即通過(guò)觀察子實(shí)體或培養(yǎng)后觀察菌落形態(tài)及個(gè)體顯微特征，將標(biāo)本及菌種鑒定到門(mén)、綱、目、科、屬、種。但隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，有些食用菌會(huì)隨著生長(zhǎng)環(huán)境的不同而表現(xiàn)出不同的形態(tài)學(xué)特征。筆者等對(duì)采于遵義地區(qū)的3種野生食用菌進(jìn)行傳統(tǒng)的形態(tài)描述鑒定，并進(jìn)行了組織分離和分子生物學(xué)鑒定，以準(zhǔn)確判斷其品種和系統(tǒng)地位，為開(kāi)發(fā)和利用該野生食用菌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 食用菌 3種野生食用菌采自貴州省遵義匯川區(qū)團(tuán)澤鎮(zhèn)雞公山,編號(hào)分別為X-01，X-02，X-03。

1.1.2 培養(yǎng)基 1) 配制麥芽汁:取50 g麥芽，磨碎，在45℃水浴中0.5 h，然后升溫到70℃,保持1 h，向其加水至400 mL。2) 培養(yǎng)基配制：20%馬鈴薯汁500 mL，麥芽汁100 mL，葡萄糖15 g，維生素B 150 mg，瓊脂20 g，蒸餾水加至1000 mL，pH 5.5左右。

1.1.3 試劑與儀器設(shè)備 試驗(yàn)所用的試劑及儀器設(shè)備見(jiàn)表1和表2。

表1 主要試劑

表2 主要儀器設(shè)備

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 借助體視顯微鏡對(duì)食用菌子實(shí)體進(jìn)行外部形態(tài)學(xué)觀察，光學(xué)顯微鏡對(duì)食用菌的孢子、菌絲特征進(jìn)行觀察并描述。

1.2.2 菌種的分離與培養(yǎng) 組織分離法：在無(wú)菌條件下，先用酒精棉球?qū)襟w進(jìn)行表面消毒，然后手持菌柄，將菌撕成兩半，取手術(shù)刀經(jīng)火焰滅菌、冷卻后，在菌蓋、菌柄交界處挑取一小塊菌肉，移植到PDA培養(yǎng)基上于25℃培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)出，挑取菌絲純化，再置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

孢子釋放法：在無(wú)菌條件下，先用酒精棉球?qū)襟w進(jìn)行表面消毒，然后除去菌柄，將菇直立，菌蓋朝上放于無(wú)菌培養(yǎng)皿中過(guò)夜，待孢子長(zhǎng)出，對(duì)其進(jìn)行分離、純化，再將其放入25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定 從子實(shí)體組織和菌絲中提取DNA，按照真菌基因組DNA提取試劑盒操作，PCR擴(kuò)增體系見(jiàn)表3，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將成功獲得的PCR產(chǎn)物送北京博友順生物技術(shù)有限公司測(cè)序；將上述獲得的序列通過(guò)NCBI、BLAST，找出與之同源性最大的序列并運(yùn)用MEGA7建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性 94℃ 3 min；變性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 1 min，20 個(gè)循環(huán)；延伸72℃ 10 min，4℃ 保存。

表3 PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果與分析

2.1 子實(shí)體特征

3種食用菌的子實(shí)體見(jiàn)圖1。X-01：子實(shí)體呈傘狀。菌蓋呈鐘形至平展，直徑約7 cm，中部稍微凸起，灰褐色，表面干燥，有的邊緣平滑，有的龜裂。菌肉為白色，受傷后變?yōu)榛野咨?；菌褶灰白色，稍密，彎生，不等長(zhǎng)。菌柄為圓柱形，長(zhǎng)約5 cm，粗約1.2 cm，表面光滑，白色，受傷后變?yōu)榛液稚?，?nèi)部松軟至中空，基部稍膨大。基物為土壤。X-02：子實(shí)體呈耳狀。菌蓋呈漏斗形，直徑約為4 cm，中部下凹，邊緣上翹，表皮顏色為黃褐色，表面干燥、有些許鱗片；菌肉為白色，受傷后變?yōu)榛疑?；菌褶為黃白色，致密，長(zhǎng)約2 cm，延生，不等長(zhǎng)。菌柄較短，約2.5 cm，圓柱形，灰白色，叢生，內(nèi)部較為中空，基部略微膨大?；餅槔鏄?shù)。X-03：子實(shí)體呈圓筒形。菌蓋近圓錐形，長(zhǎng)約7 cm，寬約5 cm，表面有許多凹坑，似羊肚狀，凹坑近圓形或不規(guī)則形，顏色淡黃色或黃褐色，交織成網(wǎng)狀；菌柄長(zhǎng)約6 cm，粗約5 cm，中空，基部膨大，基物為土壤。

圖1 3種食用菌的子實(shí)體

Fig.1 The fruiting bodies of three wild edible fungi

2.2 菌絲及孢子特征

經(jīng)過(guò)反復(fù)的分離、純化得到3種野生食用菌菌絲，在培養(yǎng)基上，X-01號(hào)菌菌絲為白色、帶有玫紅色，濃密、呈絨毛狀，產(chǎn)生玫紅色的色素，爬壁能力較強(qiáng)，一般7 d菌絲長(zhǎng)滿；X-02號(hào)菌菌絲為白色、綿毛狀、較為稀疏，不產(chǎn)生色素，爬壁能力弱，一般13 d菌絲爬滿；X-03號(hào)菌菌絲為黃色、絨毛狀、濃密，產(chǎn)生黃褐色色素，后期有菌核生成，爬壁能力強(qiáng)，一般4 d菌絲長(zhǎng)滿。

由圖2和圖3看出，X-01號(hào)食用菌孢子為單個(gè)、淺綠色、近球形，大小約為9 μm×9 μm；菌絲粗細(xì)較均勻，有分叉，鎖狀聯(lián)合。X-02號(hào)食用菌孢子為單個(gè)、淡綠色、橢圓形，大小約為7 μm×2 μm；菌絲粗細(xì)不勻，有分叉，鎖狀聯(lián)合。X-03號(hào)食用菌子囊近柱形，有8個(gè)孢子、單行排列，孢子無(wú)色、為橢圓形，每個(gè)大小約為5 μm×8.5 μm；菌絲粗細(xì)均勻，有隔，無(wú)鎖狀聯(lián)合。

圖2 3種食用菌的孢子形態(tài)特征

Fig.2 Morphological characteristics of spore of three edible fungi spores

圖3 3種食用菌的菌絲形態(tài)特征

Fig.3 Morphological characteristics of hyphae of three edible fungi spores

2.3 PCR擴(kuò)增

從圖4看出， 6條條帶的片段大小均為500～800 bp。

注：從左至右，條帶依次為3條子實(shí)體和3條菌絲體。

Note: The band in the following order: Tree fruiting bodies; tree myceliums.

圖43種野生食用菌子實(shí)體及其菌絲的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

Fig.4 Agarose gel electrophoresis of three species of wild edible fungi and their mycelium

2.4 分子鑒定結(jié)果

將測(cè)序結(jié)果與GeneBank比較，X-01號(hào)菌子實(shí)體測(cè)序結(jié)果與晶蓋粉褶蕈[Entolomaclypeatum(L)Quel]的同源性為98%；菌絲與南海海洋真菌(Fusariumsp)的同源性為99%,子實(shí)體的序列結(jié)果與表性特征一致，最終以子實(shí)體的結(jié)果為準(zhǔn)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖5。X-02號(hào)菌子實(shí)體和菌絲分子鑒定結(jié)果均與漏斗大孔菌[Favolusarcularius(Batsch : Fr.) Ames]的同源性為99%，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖6。X-03號(hào)菌子實(shí)體結(jié)果與柳毒蛾(Leucomacandida)的同源性為77%；菌絲與冠狀蟲(chóng)霉(Conidioboluscoronatus)的同源性為95%，子實(shí)體和菌絲的序列與表型均不符合，所分離的菌株可能是附著在表面的雜菌，而子實(shí)體序列可能是PCR產(chǎn)物直接測(cè)序其目的片段，最終以表型特征為主進(jìn)行鑒定。

X-01號(hào)食用菌分類(lèi)地位：真菌界(Eumycota)，擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina) ，層菌綱(Hymenomycetes) ，傘菌目(Agadcales) ，粉褶菌科(Rhodophyllaceae)，粉褶菌屬(Rhodophyllus)，晶蓋粉褶蕈[Entolomaclypeatum(L)Quel]。

X-02號(hào)食用菌分類(lèi)地位：真菌界(Eumycota)，擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina)，無(wú)隔擔(dān)子菌亞綱(Holobasidiomycetidae)，非褶菌目(Aphyllophorales)，多孔菌科(Polyporaceae)，多孔菌屬(Polyporus)，漏斗大孔菌[Favolusarcularius(Batsch:Fr.) Ames]。

X-03號(hào)食用菌經(jīng)過(guò)表型特征鑒定為羊肚菌屬，分類(lèi)地位：真菌界 (Eumycota)，子囊菌亞門(mén)(Ascomycotina)，盤(pán)菌綱(Discomycetes)，盤(pán)菌目(Pezizales)，羊肚菌科(Morohellaceae)，羊肚菌屬(Morchella)。

圖5 X-01號(hào)菌子實(shí)體系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

Fig.5 The phylogenetic tree of the mycelium system X-01

圖6 X-02號(hào)菌子實(shí)體系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

Fig.6 The phylogenetic tree of the mycelium system X-02

3 結(jié)論與討論

采用孢子釋放法和組織分離法分離野生食用菌，通過(guò)顯微鏡對(duì)3種野生食用菌的子實(shí)體、菌絲和孢子形態(tài)特征進(jìn)行觀察，分子生物學(xué)方法對(duì)其子實(shí)體和菌絲進(jìn)行基因組DNA提取、ITS區(qū)測(cè)序，綜合形態(tài)學(xué)特征和ITS基因序列，鑒定X-01號(hào)為真菌界(Eumycota)，擔(dān)子菌亞門(mén)(Basidiomycotina)，層菌綱(Hymenomycetes)，傘菌目(Agadcales)，粉褶菌科(Rhodophyllaceae)，粉褶菌屬(Rhodophyllus)，晶蓋粉褶蕈[Entolomaclypeatum(L)Quel]；X-02號(hào)為真菌界，擔(dān)子菌亞門(mén)，無(wú)隔擔(dān)子菌亞綱(Holobasidiomycetidae)，非褶菌目(Aphyllophorales)，多孔菌科(Polyporaceae)，多孔菌屬(Polyporus)，漏斗大孔菌[Favolusarcularius(Batsch : Fr.) Ames]；X-03號(hào)為真菌界，子囊菌亞門(mén)(Ascomycotina)，盤(pán)菌綱(Discomycetes)，盤(pán)菌目(Pezizales)，羊肚菌科(Morohellaceae)，羊肚菌屬(Morchella)。

孢子釋放法比組織分離法的效率高，但是與時(shí)間、孢子成熟程度關(guān)系較大。采用傳統(tǒng)的形態(tài)特征對(duì)其進(jìn)行鑒定，方法雖然簡(jiǎn)便、快速、直觀，但仍存在很多不足，有些食用菌的形態(tài)特征會(huì)隨著生長(zhǎng)環(huán)境的變化而變化，進(jìn)而不能完全準(zhǔn)確地對(duì)食用菌進(jìn)行分類(lèi)。因此，分子生物學(xué)手段廣泛地應(yīng)用于未知真菌的鑒定，在食用菌分類(lèi)上取得了成功，如田慧敏等[5]成功確定了赤峰5種未知真菌的分類(lèi)學(xué)地位。然而，雖然結(jié)合分子學(xué)方法能更快速地確定食用菌的分類(lèi)學(xué)地位，但也有試驗(yàn)表明，單從分子生物學(xué)的結(jié)果并不能準(zhǔn)確地確定食用菌的類(lèi)別，如劉曉婷等[6]對(duì)1株白樁菇進(jìn)行鑒定時(shí)，在形態(tài)學(xué)和分子學(xué)的結(jié)果上出現(xiàn)了很大的差異，綜合考慮后從形態(tài)學(xué)的角度確定其為白樁菇屬。試驗(yàn)中X-01、X-03號(hào)食用菌的分離鑒定中也出現(xiàn)了此現(xiàn)象。