干擾COX2基因?qū)α_氏沼蝦生長(zhǎng)及能量代謝酶活性和基因表達(dá)的影響

賈垂攀 戴習(xí)林 尹丹慧 黎蘭詩(shī) 梁震宇 成良峰 陳昕

摘要：【目的】從能量代謝的角度探索羅氏沼蝦生長(zhǎng)緩慢的原因，為分析和解決羅氏沼蝦生長(zhǎng)緩慢問題提供參考?！痉椒ā坷煤线m濃度的siRNA抑制羅氏沼蝦肝胰腺和肌肉中COX2基因的表達(dá)，分析肝胰腺和肌肉中線粒體呼吸鏈相關(guān)基因表達(dá)量和酶活性以及ATP含量的變化;通過持續(xù)抑制羅氏沼蝦COX2基因的表達(dá)，分析其對(duì)羅氏沼蝦生長(zhǎng)的影響?！窘Y(jié)果】siRNA對(duì)羅氏沼蝦線粒體編碼的COX2基因表達(dá)有抑制作用，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著siRNA濃度的增加抑制的作用越明顯，超過一定的濃度范圍的siRNA抑制作用不明顯，濃度為2.0 μg/g的siRNA與0.8、1.5、3.0 μg/g的siRNA的抑制作用相比效果最好。羅氏沼蝦注射siRNA后，肝胰腺和肌肉中的COX2基因表達(dá)量下調(diào)，ND1和ATP6基因表達(dá)量隨之下調(diào)，COX、ATP合酶、CCR和ND的酶活性顯著下降（P<0.05，下同），ATP含量降低。連續(xù)注射siRNA能持續(xù)抑制羅氏沼蝦肝胰腺和肌肉中COX2基因的表達(dá)，隨著siRNA注射次數(shù)的增加，抑制COX2基因表達(dá)的作用時(shí)間也增加，在注射4次2.0 μg/g siRNA蝦的肝胰腺和肌肉中，COX2、ND1和ATP6的基因表達(dá)量持續(xù)下調(diào)的時(shí)間最長(zhǎng)，COX、ATP合酶、CCR和ND的酶活性能長(zhǎng)期保持在顯著低于對(duì)照組的水平，ATP含量也顯著低于對(duì)照組。隨著肝胰腺和肌肉中COX2基因表達(dá)被抑制時(shí)間的增加，羅氏沼蝦的體長(zhǎng)與體重增加量越小，養(yǎng)殖28 d后，注射1次siRNA和注射4次siRNA的蝦的體重凈增長(zhǎng)分別為0.59和0.34 g。【結(jié)論】當(dāng)參與ATP合成的酶的基因表達(dá)量和酶活性長(zhǎng)時(shí)間受到抑制時(shí)，會(huì)抑制羅氏沼蝦的生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞： 羅氏沼蝦;細(xì)胞色素C氧化酶;siRNA干擾;能量代謝;生長(zhǎng)

中圖分類號(hào)： S917.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）12-3274-12

Effects of interference with COX2 gene on growth and energy metabolism enzyme activity and gene expression of Macrobrachium rosenbergii

JIA Chui-pan， DAI Xi-lin*， YIN Dan-hui， LI Lan-shi， LIANG Zhen-yu，

CHENG Liang-feng， CHEN Xin

（National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education（Shanghai Ocean University）/Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources（Shanghai Ocean University）/Shanghai Collaborative Innovation of Aquatic Animal Genetics and Breeding（Shanghai Ocean University），

Shanghai? 201306， China）

Abstract：【Objective】Explored the reasons for the slow growth of Macrobrachium? rosenbergii from the perspective of energy metabolism，and provide a reference for analyzing and solving the problem of slow growth of M.rosenbergii. 【Method】siRNA was used to inhibit the expression of COX2 gene in hepatopancreas and muscle of M. rosenbergii， and the changes of gene expression and enzyme activity of mitochondrial respiratory chain and ATP content in hepatopancreas and muscle of M. rosenbergii were analyzed. The effect on growth of M. rosenbergii? was analyzed by consistently inhibi-ting gene expression of COX2. 【Result】siRNA could inhibit the expression of COX2 gene of M. rosenbergii. Within a certain range of concentration， the inhibition became more obvious with the increase of siRNA concentration， and the inhibition was not obvious beyond a certain range of concentration. siRNA at 2.0 μg/g showed the best inhibitory effect compared with 0.8， 1.5 and 3.0 μg/g siRNA. After siRNA injection， COX2 gene expression was down-regulated in hepatopancreas and muscle of M. rosenbergii， as well as the expression of ND1 and ATP6 genes， COX， ATP synthase， CCR and ND enzyme activities were significantly decreased （P<0.05， the same below）， and content of ATP was decreased in hepatopancreas and muscle. Continuous injection of siRNA could continuously inhibit the expression of COX2 gene in hepatopanax and muscle of M. rosenbergii. With the increase of the number of siRNA injection， the inhibition time of COX2 gene expression also increased. In the hepatopancreas and muscle of shrimps injected 2.0 μg/g siRNA for 4 times，the expression of COX2、ND1 and ATP6 genes were continuously down-regulated for the longest time， and the activities of COX， ATP synthase， CCR and ND enzymes were significantly lower than control groups for a long time， and the content of ATP was also significantly lower than control groups. The body length and weight gain of M. rosenbergii decreased with the increase of inhibition time of COX2 gene expression in hepatopancreas and muscle. After 28 d of culture， the net weight gain of shrimp injected with siRNA one time and four times was 0.59 and 0.34 g. 【Conclusion】When the gene expression and enzyme activity of enzymes involve in ATP synthesis are inhibited for a long time，it will inhibit the growth of M. rosenbergii.

Key words： Macrobrachium rosenbergii; cytochrome C oxidase; siRNA interference; energy metabolism; growth

Foundation item： Shanghai Shrimp Industrial Technology System Construction Project（Hunongkechan〔2014〕5）

0 引言

【研究意義】羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)蝦類之一，在江浙滬地區(qū)大范圍養(yǎng)殖，具有生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)。隨著羅氏沼蝦產(chǎn)量及養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)規(guī)模發(fā)展的不斷提高，近年來鐵殼蝦的出現(xiàn)使羅氏沼蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)受到重創(chuàng)。鐵殼蝦通常出現(xiàn)性早熟的現(xiàn)象，且性腺發(fā)育需要大量能量支持。因此，從能量代謝方面探究羅氏沼蝦生長(zhǎng)緩慢的原因，對(duì)解決羅氏沼蝦生長(zhǎng)阻滯問題具有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前影響羅氏沼蝦生長(zhǎng)的主要原因還沒有確切的定論。史建華等（2001）認(rèn)為種質(zhì)退化影響了羅氏沼蝦的生長(zhǎng)。Chen和Chen（2003）的試驗(yàn)表明羅氏沼蝦養(yǎng)殖用水pH范圍應(yīng)在6.8～8.2，pH低于6.2則羅氏沼蝦生長(zhǎng)、蛻殼次數(shù)和存活率顯著降低。黎東（2013）認(rèn)為水中重金屬離子會(huì)阻礙羅氏沼蝦的生長(zhǎng)。Chand等（2015）發(fā)現(xiàn)羅氏沼蝦在鹽度為10的養(yǎng)殖水中生長(zhǎng)最佳，體質(zhì)量比在淡水中增長(zhǎng)的多。Mente等（2016）研究得出腸道菌群對(duì)羅氏沼蝦的蛻殼有顯著影響。戴習(xí)林等（2016）認(rèn)為養(yǎng)殖密度會(huì)對(duì)羅氏沼蝦的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。孫海峰（2017）發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)欠佳的羅氏沼蝦眼柄中甲基法尼脂、20-羥基蛻皮酮、蛻皮激素受體和維甲酸受體的表達(dá)水平顯著低于生長(zhǎng)正常的蝦，而蛻皮抑制激素表達(dá)水平顯著高于生長(zhǎng)正常的蝦，推測(cè)這些基因表達(dá)的變化抑制了蝦蛻殼。周俊名等（2017）發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)正常的羅氏沼蝦池塘中肝腸胞蟲病毒（EHP）、傳染性皮下及造血組織壞死（IHHNV）和白斑病毒（WSSV）病毒的陽(yáng)性檢出率顯著低于生長(zhǎng)欠佳的池塘，推測(cè)特定病原感染可能會(huì)導(dǎo)致羅氏沼蝦生長(zhǎng)緩慢。此外，國(guó)內(nèi)外學(xué)者還在抗生素、水質(zhì)、養(yǎng)殖水體的金屬離子（王亞斌等，2008;Tavabe et al.，2013;孫龍生等，2015）等方面探究了對(duì)羅氏沼蝦生長(zhǎng)的影響。張俊功等（2020）發(fā)現(xiàn)雌雄蝦比例為1∶1時(shí)，特定生長(zhǎng)率高于比例為1∶2和1∶3時(shí)，同時(shí)水溫26 ℃時(shí)，蝦的絕對(duì)生長(zhǎng)能最高。另外，接近性成熟的蝦會(huì)優(yōu)先將能量分配到性腺發(fā)育中，使生長(zhǎng)受到一定影響（袁銳等，2017）。管政兵等（2012）切除克氏原螯蝦的眼柄之后發(fā)現(xiàn)，其卵巢后期的NADH脫氫酶（NADH dehydrogenase，ND）、細(xì)胞色素C氧化酶（Cytochrome C oxidase，COX）和ATP合酶亞基6（ATP synthase subunit 6，ATP6）基因表達(dá)量上升，其中原因是卵巢后期要合成大量的卵黃蛋白，細(xì)胞需要大量能量。張海恩等（2021）發(fā)現(xiàn)中國(guó)對(duì)蝦的養(yǎng)殖密度越高，蝦體內(nèi)三羧酸循環(huán)活性降低，有氧代謝受到抑制。相關(guān)研究表明，400尾/m3養(yǎng)殖密度下蝦的體重增加量顯著低于200尾/m3養(yǎng)殖密度，但其三羧酸循環(huán)活性低于200尾/m3養(yǎng)殖密度，說明密度脅迫對(duì)有氧呼吸產(chǎn)生影響，有氧呼吸能量代謝強(qiáng)度與中國(guó)對(duì)蝦的生長(zhǎng)有一定聯(lián)系。飼料中添加高水平的磷和銅會(huì)使蝦蟹肝胰腺中ATP含量和參與ATP合成酶的基因及酶活性升高，使蝦蟹生長(zhǎng)速度加快（Shi et al.，2021;Zhao et al.，2021）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】關(guān)于羅氏沼蝦生長(zhǎng)緩慢的原因，國(guó)內(nèi)學(xué)者多從病害、營(yíng)養(yǎng)、水質(zhì)及養(yǎng)殖管理等方面進(jìn)行研究;在羅氏沼蝦能量代謝的研究中，也僅從能量收支角度探究了羅氏沼蝦能量分配的問題（朱其建等，2019;張俊功等，2020）。而羅氏沼蝦生長(zhǎng)及參與能量合成的酶之間的關(guān)系目前仍鮮有報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】探究細(xì)胞色素C氧化酶亞基2（Cytochrome C oxidase subu-nit 2，COX2）基因表達(dá)下調(diào)對(duì)線粒體能量代謝相關(guān)基因表達(dá)量和酶活性的影響，以及參與ATP合成的酶活性對(duì)羅氏沼蝦生長(zhǎng)的影響，為進(jìn)一步分析和解決羅氏沼蝦生長(zhǎng)緩慢問題提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用蝦為在上海申漕特種水產(chǎn)開發(fā)公司培育的羅氏沼蝦生長(zhǎng)快速品系的子九代蝦。挑選體長(zhǎng)8～10 cm、體重16～22 g、四肢健全、無病無外傷的子八代作為親本，在上海市金山區(qū)申漕特種水產(chǎn)有限公司的育苗車間孵化子九代無節(jié)幼體。將同一批變態(tài)的仔蝦放到水泥池（3.0 m×7.0 m×1.5 m）中養(yǎng)至體重1.5 g左右，挑選合適規(guī)格的蝦備用。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 引物和siRNA設(shè)計(jì)及制備 在www.ncbi.nlm.nih.gov上檢索羅氏沼蝦NADH脫氫酶亞基1（NADH dehydrogenase subunit 1，ND1）（YP_214007.1）、COX2（KU745278.1）、ATP6（YP_213999.1）的編碼序列，并用Blast設(shè)計(jì)熒光定量PCR的引物，選擇羅氏沼蝦的18S DNA作為內(nèi)參引物。由生工生物工程（上海）股份有限公司根據(jù)羅氏沼蝦COX2的完整mRNA序列設(shè)計(jì)一條siRNA和一條無意義的siRNA（NgsiRNA），引物和siRNA均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成并驗(yàn)證（表1）。

1. 2. 2 siRNA劑量的篩選試驗(yàn) 試驗(yàn)組分別注射4個(gè)不同劑量的siRNA，為0.8、1.5、2.0和3.0 μg/g;對(duì)照組分別注射與試驗(yàn)組相同體積的NgsiRNA和DEPC水。每組30只蝦（1.5±0.25 g），水溫（26±1）℃，pH 7.8±0.5。養(yǎng)殖用水為加海水晶的深井水，鹽度0.7～0.8，每組蝦在容積90 L的藍(lán)色塑料箱中暫養(yǎng)1個(gè)星期后，開始注射試驗(yàn)。注射部位為頭胸甲基部腹膜，注射后每隔1 d從每組中隨機(jī)取5只蝦提取肝胰腺和肌肉組織，置于-80 ℃冰箱中保存，用于測(cè)定基因表達(dá)量和酶活性。

1. 2. 3 能量代謝酶基因表達(dá)量和酶活性測(cè)定 最適注射劑量確定后，測(cè)定最適劑量組肝胰腺和肌肉中ND1、ATP6的基因表達(dá)量和COX、ND、ATP合酶、細(xì)胞色素C還原酶（Cytochrome c reductase，CCR）4種酶的活性及ATP含量變化。

1. 2. 4 養(yǎng)殖試驗(yàn) 設(shè)計(jì)4個(gè)試驗(yàn)組、4個(gè)陰性對(duì)照組及1個(gè)空白對(duì)照組。試驗(yàn)組的蝦分別注射1次、2次、3次和4次siRNA（2.0 μg/g），陰性對(duì)照組的蝦分別注射1次、2次、3次和4次DEPC水，空白對(duì)照組不進(jìn)行任何注射處理。每次注射間隔7 d。每組3個(gè)平行，每個(gè)平行10只蝦（1.5±0.25 g）。各組從第1次注射開始計(jì)算，共養(yǎng)殖28 d。水溫、鹽度、pH與1.2.2保持一致，每2 d換水1/3。按照總體重的15%投喂新鮮的螺螄肉泥，每天投喂2次（上午10：00和下午18：00），每天晚上集中排污1次。試驗(yàn)開始前測(cè)量蝦的初始體長(zhǎng)和體重，試驗(yàn)結(jié)束后測(cè)量蝦的終末體長(zhǎng)和體重，并收集肝胰腺和肌肉組織，每個(gè)平行取3只蝦混樣保存于-80 ℃冰箱。

1. 2. 5 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測(cè)

取30～50 mg的肝胰腺和肌肉組織，按照TRNzol Universal Reagent[天根生化科技（北京）有限公司]使用說明書，提取總RNA并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的質(zhì)量。使用Fastking RT Kit（with gDNase）[天根生化科技（北京）有限公司]反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄出cDNA的第一條鏈，保存于-20 ℃冰箱備用。使用FastFire qPCR PreMix[天根生化科技（北京）有限公司]熒光定量試劑盒進(jìn)行熒光定量試驗(yàn)。20.0 μL反應(yīng)體系：2×FastFire qPCR PreMix 10.0 μL，上、下游引物各0.6 μL，cDNA 0.8 μL，ddH2o 8.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性5 s，60 ℃ 15 s，進(jìn)行39個(gè)循環(huán)。

1. 2. 6 酶活測(cè)定 （1）線粒體蛋白的提取及濃度測(cè)定。按照線粒體蛋白提取試劑盒（南京建成生物科技有限公司）提取線粒體蛋白，-80 ℃冰箱保存。采用BCA蛋白濃度試劑盒（上海嵐派生物科技有限公司）處理蛋白溶液樣品，用酶標(biāo)儀（KHB ST-360）在560 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白吸光度，計(jì)算樣品蛋白質(zhì)濃度，用于酶活性的計(jì)算。（2）線粒體呼吸鏈酶活力測(cè)定。采用ND、CCR、COX和ATP合酶試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法，上海嵐派生物科技有限公司）處理蛋白液樣品，用酶標(biāo)儀（KHB ST-360）在450 nm處測(cè)量吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品酶活力。

1. 2. 7 生長(zhǎng)指標(biāo)計(jì)算 根據(jù)以下計(jì)算公式計(jì)算：體重凈增長(zhǎng)ΔW（g）、體長(zhǎng)凈增長(zhǎng)ΔL（cm）、體長(zhǎng)增長(zhǎng)率WGR（%）、體重增長(zhǎng)率LGR（%）、特定生長(zhǎng)率（%/d）、體重凈增長(zhǎng)減少比P（%）。

ΔW=WT-W0

ΔL=LT-L0

LGR（%）=（LT-L0）/LT×100

WGR（%）=（WT-W0）/WT×100

SGR（%）=（lnWT-lnW0）/t×100

P（%）=（ΔWDEPC-ΔWsiRNA）/ΔWDEPC×100

式中，LT是試驗(yàn)結(jié)束后蝦的長(zhǎng)度，L0是試驗(yàn)開始時(shí)蝦的長(zhǎng)度，WT是試驗(yàn)結(jié)束后蝦的重量（濕重），W0是試驗(yàn)開始時(shí)蝦的重量（濕重），t是養(yǎng)殖天數(shù)，ΔWDEPC是對(duì)照組的體重凈增長(zhǎng)值，ΔWsiRNA是試驗(yàn)組的體重凈增長(zhǎng)值。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

使用WPS 2019處理試驗(yàn)數(shù)據(jù);利用2-ΔΔCt方法計(jì)算相對(duì)基因表達(dá)量;采用SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）、Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 肝胰腺和肌肉中COX2基因表達(dá)干擾結(jié)果分析

由圖1和圖2可知，siRNA（0.8 μg/g）、siRNA（1.5 μg/g）、siRNA（2.0 μg/g）、siRNA（3.0 μg/g）在肝胰腺有顯著的抑制作用（P<0.05，下同）;siRNA（0.8 μg/g）、siRNA（1.5 μg/g）、siRNA（2.0 μg/g）在肌肉中有顯著的抑制作用，siRNA（3.0 μg/g）在肌肉中無顯著抑制作用，與對(duì)照組無顯著差異（P>0.05，下同）。綜上，siRNA（2.0 μg/g）干擾的效果最佳。從注射siRNA（2.0 μg/g）后的第1～7 d，肝胰腺和肌肉中COX2表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，且隨時(shí)間增加表達(dá)量逐漸降低，至第7 d時(shí)達(dá)最低;第7 d時(shí)siRNA（2.0 μg/g）組肝胰腺中COX2表達(dá)量為NgsiRNA的37%，肌肉中COX2表達(dá)量為NgsiRNA的45%，有效干擾時(shí)間為7 d。故選2.0 μg/g的劑量作為養(yǎng)殖試驗(yàn)的最適注射劑量。

2. 2 肝胰腺和肌肉中ND1和ATP6基因表達(dá)量的變化

由圖3-A和圖3-C可知，在注射siRNA（2.0 μg/g）的蝦的肝胰腺中，ND1和ATP6基因表達(dá)量隨時(shí)間的增加而下調(diào)，從注射后第3 d開始ND1和ATP6基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，2個(gè)基因的表達(dá)量在第7 d時(shí)達(dá)最低值。由圖3-B和圖3-D可知，肌肉中的ND1和ATP6基因表達(dá)量隨時(shí)間的增加而下調(diào)，ATP6在注射后第5 d其表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，ND1在第3 d時(shí)的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組，2個(gè)基因表達(dá)量在第7 d時(shí)達(dá)最低值。2組對(duì)照組的ND1和ATP6基因表達(dá)量間無顯著差異?？梢?，COX2基因表達(dá)量下調(diào)，ND1和ATP6基因表達(dá)量也下調(diào)。

2. 3 COX、ND、ATP合酶、CCR酶的活性變化

由圖4-A和圖4-B可知，注射siRNA（2.0 μg/g）的蝦的肝胰腺和肌肉中COX的活性顯著低于對(duì)照組，且隨時(shí)間增加COX活性逐漸降低，說明COX2表達(dá)量下調(diào)，COX活性也隨之降低。由圖4-C、圖4-E和圖4-G可知，在肝胰腺中，CCR活性在注射后第3～7 d顯著低于對(duì)照組，ND和ATP合酶的活性在注射后第5～7 d顯著低于對(duì)照組。由圖4-D、圖4-F和圖4-H可知，在肌肉中，ATP合酶和CCR的活性在第1～7 d顯著低于對(duì)照組，ND的活性從第3～7 d顯著低于對(duì)照組，且隨時(shí)間增加上述3種酶活性逐漸下降。綜上所述，肝胰腺中COX活性下降后CCR活性最先下降，而肌肉中，當(dāng)COX的活性下降后，CCR和ATP合酶的活性最先下降，ND活性下降需要的時(shí)間比CCR和ATP合酶長(zhǎng)。不同酶的活性變化時(shí)間點(diǎn)不同，推測(cè)有可能是這些酶在電子傳遞過程中與COX聯(lián)系的緊密程度存在差異，與COX聯(lián)系最緊密的酶最先受到影響。

2. 4 肝胰腺和肌肉中ATP含量變化

由圖5-A可知，注射siRNA（2.0 μg/g）的蝦肝胰腺中ATP含量在第5 d時(shí)顯著低于對(duì)照組，而第1～3 d時(shí)其ATP含量與對(duì)照組無顯著差異。由圖5-B可知，肌肉中的ATP含量在第1 d與對(duì)照組無顯著差異，從第3 d開始顯著低于對(duì)照組，并隨時(shí)間的增加ATP含量逐漸降低?？梢?，當(dāng)ATP合酶、CCR、COX和ND的活性下降時(shí)，ATP含量也下降，說明參與ATP合成的酶的活性影響ATP合成。

2. 5 注射不同次數(shù)siRNA蝦的ATP6、ND1和COX2基因表達(dá)量分析

由圖6-A、圖6-C和圖6-E可知，只有注射4次siRNA的蝦肝胰腺中ATP6、ND1和COX2的基因表達(dá)量顯著低于DEPC組，其余3組中ATP6、ND1和COX2的基因表達(dá)量與DEPC組無顯著差異。由圖6-B、圖6-D和圖6-F可知，注射3次和4次siRNA的蝦肌肉中ATP6、ND1和COX2的基因表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組，約為對(duì)照組的50%，其余2組恢復(fù)至DEPC組的85%以上。綜上所述，siRNA作用時(shí)間較短，當(dāng)siRNA失去作用后，基因表達(dá)量會(huì)逐漸恢復(fù)至原來的水平，通過持續(xù)間隔注射siRNA能延長(zhǎng)干擾效果，且干擾效果在肝胰腺和肌肉中有所差別，肌肉中有效干擾時(shí)間長(zhǎng)于肝胰腺。

2. 6 注射不同次數(shù)siRNA蝦的COX、ATP合酶、CCR和ND的酶活性

由圖7-A、圖7-C、圖7-E和圖7-G可知，注射4次siRNA的蝦的肝胰腺中COX、ATP合酶、CCR和ND活性仍顯著低于DEPC組，但注射1、2和3次的蝦ATP合酶、ND和CCR的活性均恢復(fù)至DEPC組的水平，注射3次siRNA蝦的肝胰腺中，COX活性仍顯著低于對(duì)照組。由圖7-B、圖7-D、圖7-F和圖7-H可知，注射3次和4次siRNA蝦的肌肉中ATP合酶、CCR、ND和COX的活性均顯著低于對(duì)照組，且注射次數(shù)越多，上述酶的活性越低，由此說明，對(duì)COX2基因表達(dá)持續(xù)干擾的時(shí)間越長(zhǎng)，酶活性處于低于正常水平的時(shí)間也越長(zhǎng)。

2. 7 注射不同次數(shù)蝦ATP含量的差異分析

由圖8-A和8-B可知，注射3次和4次siRNA蝦的肝胰腺和肌肉中ATP含量顯著低于注射1次和2次的，且顯著低于對(duì)照組。注射4次siRNA蝦的肝胰腺和肌肉中ATP含量最低。結(jié)果表明，COX2基因表達(dá)干擾的時(shí)間越長(zhǎng)，酶活性的降低時(shí)間也越長(zhǎng)，ATP產(chǎn)量也越低。進(jìn)一步說明COX2基因表達(dá)量的下降會(huì)導(dǎo)致呼吸鏈酶活性下降，對(duì)ATP合成造成影響。

2. 8 注射不同次數(shù)siRNA對(duì)羅氏沼蝦蝦生長(zhǎng)的影響

由表2可知，隨著注射次數(shù)的增加，siRNA組體重凈增長(zhǎng)值逐漸降低，注射1次siRNA的蝦體重平均增長(zhǎng)0.59 g，注射2次平均增長(zhǎng)0.54 g，注射3次平均增長(zhǎng)0.46 g，注射4次平均增長(zhǎng)0.34 g。蝦的生長(zhǎng)指標(biāo)（除體重凈增加減少比例外）由高到低依次排序?yàn)閟iRNA（注射1次）>siRNA（注射2次）>siRNA（注射3次）>siRNA（注射4次）。結(jié)果表明，隨著抑制作用時(shí)間的延長(zhǎng)，蝦的生長(zhǎng)速度逐漸變慢。注射1次的siRNA組的蝦體重凈增長(zhǎng)值與注射1次DEPC水的蝦體重凈增長(zhǎng)值無顯著差異，注射3次和4次的siRNA組的蝦體重凈增長(zhǎng)值顯著低于注射相同次數(shù)的DEPC組。由此說明，短暫的呼吸鏈酶活性和ATP水平的降低不會(huì)對(duì)蝦的生長(zhǎng)造成顯著影響，呼吸鏈酶長(zhǎng)期處于低活性狀態(tài)導(dǎo)致ATP也長(zhǎng)期處于低水平狀態(tài)，從而對(duì)蝦的生長(zhǎng)速度產(chǎn)生顯著影響。結(jié)合2.7中空白對(duì)照組的4種酶活性（圖7）顯著高于siRNA組和DEPC組的研究結(jié)果，且生長(zhǎng)速度也顯著高于siRNA組和DEPC組，得出參與ATP合成的酶活性高低對(duì)羅氏沼蝦生長(zhǎng)的快慢有一定影響。

3 討論

3. 1 siRNA的篩選及評(píng)價(jià)

王超等（2019）對(duì)牛腎細(xì)胞轉(zhuǎn)染牛FOXM1的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，作用效果最好的是1.5 μg/g劑量組而不是2 μg/g。Tan等（2020）在敲低羅氏沼蝦胰島素受體（MrIR）的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)0.1 μg/g的siRNA對(duì)基因抑制無顯著效果，0.5 μg/g效果最佳，而1.5和3.0 μg/g無顯著抑制作用。袁偉（2020）在干擾羅氏沼蝦toll樣受體（MrTLR）的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，0.4 μg/g的注射劑量對(duì)MrTLR無明顯抑制效果，而0.8和1.2 μg/g劑量的作用效果十分顯著，且1.2 μg/g劑量的效果達(dá)最佳。本研究表明，4個(gè)siRNA注射劑量中2.0 μg/g劑量的干擾效果最好，說明在一定的范圍內(nèi)，siRNA的注射劑量越高干擾效果越好，2.0 μg/g siRNA的有效干擾時(shí)間也比其他3組時(shí)間長(zhǎng)，與袁偉（2020）的結(jié)果相似，說明在合適的濃度范圍內(nèi)提高siRNA的濃度會(huì)延長(zhǎng)siRNA的干擾時(shí)間。本研究中siRNA（3.0 μg/g）的注射劑量干擾作用在4個(gè)試驗(yàn)組中最差，與王超（2019）、Tan（2020）的試驗(yàn)結(jié)果相似，說明當(dāng)siRNA超過一定劑量時(shí)，干擾作用會(huì)下降或起不到干擾作用。本研究結(jié)果證明，2.0 μg/g siRNA能抑制羅氏沼蝦COX2基因的mRNA表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)了siRNA對(duì)甲殼動(dòng)物線粒體編碼的基因同樣具有負(fù)調(diào)控作用，這可為以后siRNA對(duì)甲殼動(dòng)物中線粒體基因的研究提供參考。

3. 2 COX2基因表達(dá)下調(diào)對(duì)參與ATP合成的酶的影響

本研究利用siRNA對(duì)羅氏沼蝦線粒體編碼的COX2基因表達(dá)進(jìn)行下調(diào)，以探究呼吸鏈中其他參與ATP合成的酶（ND、CCR、COX、ATP合酶）的基因表達(dá)水平和活性的變化。結(jié)果顯示，COX2基因表達(dá)量下調(diào)，COX的活性也會(huì)下降，與Gnipová等（2012）和Jia等（2017）的試驗(yàn)結(jié)果一致。表明COX2表達(dá)量的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致COX活性降低。導(dǎo)致酶活下降的原因可能是COX2表達(dá)量下調(diào)使COX組裝不完整，由于缺失催化中心的核心亞基，其他亞基迅速降解，從而導(dǎo)致酶的活性降低。

本研究結(jié)果得出，在肝胰腺中，當(dāng)COX活性下降后，CCR活性最先下降，隨后ND和ATP合酶的活性也下降;在肌肉中，當(dāng)COX活性下降后，ATP合酶和CCR活性最先下降，隨后ND活性下降。Gnipová（2012）研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中COX的活性下降后會(huì)導(dǎo)致CCR的活性下降，因?yàn)镃CR是活性氧（ROS）形成的主要部位之一，CCR活性增加和COX轉(zhuǎn)移電子的能力受到損害時(shí)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生更多的ROS，當(dāng)COX功能衰弱，細(xì)胞色素C介導(dǎo)的呼吸作用會(huì)轉(zhuǎn)移到其他末端氧化酶上，以減少ROS造成的氧化損害，因此，CCR活性下降可能是機(jī)體為避免線粒體中ROS升高對(duì)線粒體造成氧化損傷的一種調(diào)節(jié)方式。本研究中，COX活性下降后，CCR活性在肝胰腺和肌肉中最先下降，造成這一結(jié)果的原因可能是線粒體COX功能受損后，通過降低CCR活性以減少ROS帶來的損害。

Furukawa等（2015）發(fā)現(xiàn)干擾COX2表達(dá)會(huì)造成線粒體膜電位下降。Ott等（2007）認(rèn)為當(dāng)電子傳遞鏈?zhǔn)艿綋p害后，細(xì)胞中較高的ROS濃度可引起氧化應(yīng)激造成氧化損傷，這種氧化損傷可能會(huì)改變線粒體蛋白質(zhì)、DNA和脂質(zhì)，導(dǎo)致線粒體功能失效，從而引起線粒體壞死或凋亡（Chuang，2010）。Zhao等（2011）研究認(rèn)為，當(dāng)呼吸鏈復(fù)合物中基因表達(dá)量和酶活下降時(shí)，細(xì)胞中OXPHOS（氧化磷酸化）系統(tǒng)的生化功能會(huì)改變，能量生成系統(tǒng)遭到損害。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)COX2表達(dá)量被干擾后，ND1和ATP6基因表達(dá)量下降，ND、CCR和ATP合酶的活性下降，ATP含量下降。由此推測(cè)，COX2基因表達(dá)量被抑制后，COX功能受損，可能促使細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升，線粒體的OXPHOS系統(tǒng)功能紊亂，參與ATP合成的酶的活性和基因表達(dá)量被抑制，導(dǎo)致線粒體的能量生成系統(tǒng)被破壞，ATP產(chǎn)量下降。

3. 3 參于ATP合成的酶的活性對(duì)羅氏沼蝦生長(zhǎng)的影響

Zhao等（2021）研究發(fā)現(xiàn)，三疣梭子蟹肝胰腺中ATP含量越高，其體重增加越多;蟹肝胰腺中ATP含量含量較低，體重增加量少，且生長(zhǎng)快速的三疣梭子蟹肝胰腺中與線粒體能量代謝相關(guān)的基因的表達(dá)顯著上調(diào)。Shi等（2021）用不同含銅量的飼料投喂南美白對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)快的南美白對(duì)蝦肝胰腺中ATPase（Cu-ATPase，NaK-ATPase，Mg-ATPase）、COX、檸檬酸合酶（CS）的活性和ATP含量均顯著高于生長(zhǎng)相對(duì)較慢的蝦。上述研究表明，生長(zhǎng)較快的蝦和蟹肝胰腺中參與ATP合成的酶的活性和基因表達(dá)量高于生長(zhǎng)較慢的蝦蟹，且生長(zhǎng)快的蝦蟹中ATP含量水平也高（徐文杰等，2020）。本研究結(jié)果得出，蝦的肝胰腺和肌肉中COX、ATP合酶、CCR和ND的活性和基因表達(dá)量以及ATP的含量均較低的蝦的生長(zhǎng)速度較慢，與前人研究結(jié)果相似。說明參于ATP合成的酶的活性速度高低影響著ATP的產(chǎn)生，進(jìn)而影響甲殼動(dòng)物的生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

干擾羅氏沼蝦COX2基因的mRNA表達(dá)量，會(huì)使羅氏沼蝦細(xì)胞色素C氧化酶的活性降低，且會(huì)導(dǎo)致參與ATP合成的酶的表達(dá)量和酶活性下降，導(dǎo)致能量代謝的功能降低，使ATP產(chǎn)量下降，結(jié)合生長(zhǎng)試驗(yàn)得出參與ATP合成的酶的基因表達(dá)量和酶活性降低會(huì)顯著抑制羅氏沼蝦的生長(zhǎng)。

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（責(zé)任編輯 鄧慧靈）