野百合堿肺動(dòng)脈高壓大鼠SIRT3和Warburg效應(yīng)關(guān)鍵酶的變化

肺動(dòng)脈高壓(PAH)是多種心肺血管疾病的重要病理基礎(chǔ)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，Warburg效應(yīng)通過(guò)促進(jìn)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)異常增殖在PAH發(fā)生發(fā)展中起重要作用，阻斷Warburg效應(yīng)可改善PAH[1-3]。沉默信息調(diào)節(jié)因子3(SIRT3)是主要的線粒體去乙?；?，通過(guò)去乙?；{(diào)節(jié)線粒體中多種糖代謝酶的活性，促進(jìn)葡萄糖氧化磷酸化，在調(diào)節(jié)葡萄糖代謝中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)或活性下調(diào)可導(dǎo)致葡萄糖代謝途徑的改變[4]。本研究擬探討野百合堿(MCT)誘導(dǎo)PAH大鼠(MCT-PAH大鼠)模型SIRT3表達(dá)的變化及是否存在Warburg效應(yīng)，為研究Warburg效應(yīng)在PAH中的作用及可能的觸發(fā)機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器

健康清潔級(jí)2月齡SD雄性大鼠16只購(gòu)自南華大學(xué)動(dòng)物部[許可證號(hào)為SCXK(湘)2015-0002]。MCT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳試劑盒和BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物研究所；二甲氨基偶氮苯(DAB)免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自北京康為生物世紀(jì)公司。SIRT3兔源單克隆抗體、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(Glut1)鼠源多克隆抗體、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4(Glut4)鼠源多克隆抗體、乳酸脫氫酶(LDH)兔源單克隆抗體和丙酮酸脫氫酶(PDH)兔源單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；β-actin鼠源單克隆抗體、單羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(MCT4)兔源多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze Biotechnology公司。5810R型低溫高速離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司、VE180型Western blot全套設(shè)備購(gòu)自上海天能科技有限公司；PHILIPS EPIQ7C(S12-4探頭)超聲儀器購(gòu)自荷蘭飛利浦公司；Nikon Eclipse E100 顯微鏡購(gòu)自日本Nikon公司。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

16只2月齡SD大鼠體質(zhì)量180～230 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和MCT組，每組8只，建模第1天MCT組大鼠腹腔注射1%MCT溶液(60 mg/kg)，對(duì)照組注射等體積生理鹽水。

1.3 超聲檢測(cè)

建模第28天，稱重，10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥固定，肢體連接電極記錄心電圖，大鼠胸部用脫毛膏脫毛，涂預(yù)熱超聲耦合劑，經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖檢測(cè)右心功能的各項(xiàng)指標(biāo)，包括肺動(dòng)脈血流加速時(shí)間(PAAT)、三尖瓣收縮期位移(TAPSE)、右心室內(nèi)徑(RVID)。

1.4 右心室收縮壓測(cè)定和右心室肥厚的檢測(cè)

采用右心導(dǎo)管法測(cè)量右心室收縮壓(RVSP)，引導(dǎo)器引導(dǎo)下從右頸總靜脈將PE50導(dǎo)管插入肺動(dòng)脈，觀察BL-420S生物機(jī)能系統(tǒng)記錄界面的壓力波，波形穩(wěn)定1 min后記錄RVSP。記錄結(jié)束后分離肺組織和心臟組織，分別稱量右心室(RV)、左心室(LV)+室間隔(S)的質(zhì)量，計(jì)算RV/(LV+S)的比值。

1.5 Western blot法檢測(cè)

取20 mg新鮮或冷凍肺組織，勻漿后4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，取上清，測(cè)定蛋白含量。蛋白煮沸變性后，SDS-PAGE 電泳1.5 h，電轉(zhuǎn)2 h，封閉2 h。分別按照1∶400、1∶500、1∶200、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000的濃度加入Glut1、Glut4、MCT4、PDH、LDH、SIRT3、β-actin一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。按照說(shuō)明書(shū)的比例室溫孵育二抗45 min。采用Western blot熒光檢測(cè)試劑盒顯影，AlphaImager 2200圖像處理系統(tǒng)進(jìn)行圖片灰度掃描并分析目的蛋白條帶的相對(duì)灰度值。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

大鼠肺組織石蠟包埋，5 μm組織切片，采用生物素-鏈霉親和素-HRP法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，Glut1、Glut4、MCT4、PDH、LDH、SIRT3單克隆抗體濃度分別為1∶100、1∶100、1∶100、1∶200、1∶200、1∶200，陰性對(duì)照使用非特異血清代替一抗，顯微鏡下觀察染色結(jié)果，細(xì)胞漿呈棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.7 肺動(dòng)脈重構(gòu)的病理檢測(cè)

大鼠肺組織石蠟包埋，5 μm組織切片，蘇木素伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺血管病理改變，應(yīng)用Leica Q550CW圖像處理與分析系統(tǒng)測(cè)量肺動(dòng)脈的相對(duì)中膜厚度(RMT)及相對(duì)中膜面積(RMA)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn)，結(jié)果顯示數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，兩組數(shù)據(jù)的總體方差齊。兩組間比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功建立PAH模型大鼠

SD大鼠腹腔注射28 d后進(jìn)行超聲檢測(cè)，與對(duì)照組相比，MCT組的PAAT明顯下降，RVID明顯增大，TAPSE明顯縮短(P均<0.05)，見(jiàn)圖1；右心導(dǎo)管法檢測(cè)顯示，MCT組RVSP較對(duì)照組明顯增加(P< 0.01)；對(duì)心室組織進(jìn)行稱量，MCT組RV/(LV+S)較對(duì)照組明顯增加(P<0.01)。見(jiàn)表1。

注：PAAT為肺動(dòng)脈血流加速時(shí)間；RVID為右心室內(nèi)徑；TAPSE為三尖瓣收縮期位移；RV為右心室；RA為右心房；LV為左心室；LA為左心房

表1 各組大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較

2.2 大鼠肺動(dòng)脈結(jié)構(gòu)改變

HE染色結(jié)果顯示，MCT組大鼠肺小動(dòng)脈管腔狹窄，血管周?chē)仔约?xì)胞浸潤(rùn)；與對(duì)照組相比，MCT組肺小動(dòng)脈血管壁明顯增厚[(378.47±129.97) μm對(duì)(105.16±61.17) μm,P<0.05]，見(jiàn)圖2。

注：A為對(duì)照組；B為MCT組

2.3 肺組織中Warburg效應(yīng)關(guān)鍵酶和SIRT3的表達(dá)

Western blot法檢測(cè)肺組織中Warburg效應(yīng)關(guān)鍵酶和SIRT3的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，MCT組大鼠肺組織中Glut1、Glut4、LDH、MCT4蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯升高，PDH和 SIRT3蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(P均<0.05)，見(jiàn)圖3、表3。

圖 3 各組大鼠肺組織Warburg效應(yīng)關(guān)鍵酶和SIRT3蛋白表達(dá)水平

表3 各組大鼠肺組織Warburg效應(yīng)關(guān)鍵酶和SIRT3蛋白表達(dá)水平比較

2.4 肺動(dòng)脈血管中Warburg效應(yīng)關(guān)鍵酶和SIRT3的表達(dá)

免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)肺血管中Warburg效應(yīng)關(guān)鍵酶，與對(duì)照組相比，MCT組大鼠肺小動(dòng)脈中膜Glut1、Glut4、LDH、MCT4的蛋白表達(dá)水平明顯升高，PDH和SIRT3的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P均<0.05)，見(jiàn)圖4、表4。

3 討論

Warburg效應(yīng)又稱有氧糖酵解，1956年，Warburg發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞在有氧條件下糖酵解途徑明顯增強(qiáng)，伴隨葡萄糖攝取增加，乳酸生成增加，該現(xiàn)象此后被稱為Warburg效應(yīng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，PAH動(dòng)物模型和患者中存在與Warburg效應(yīng)相關(guān)的線粒體代謝方式改變[6]，為進(jìn)一步明確PAH時(shí)血管局部是否存在Warburg效應(yīng)，本研究采用Western blot和免疫組織化學(xué)染色法分別檢測(cè)了MCT-PAH大鼠肺組織和肺小動(dòng)脈，結(jié)果顯示MCT-PAH大鼠肺組織和肺小動(dòng)脈Warburg效應(yīng)關(guān)鍵酶Glut1、Glut4、LDH、MCT4表達(dá)上調(diào)，且以上表達(dá)變化主要位于MCT-PAH大鼠肺小動(dòng)脈中膜，表明肺動(dòng)脈局部存在Warburg效應(yīng)。

SIRT3是沉默信息調(diào)節(jié)因子(SIRT)蛋白家族成員，是主要的線粒體去乙酰化酶[7]，其表達(dá)或功能失調(diào)在惡性腫瘤[8]、PAH[9]、心室重構(gòu)[10]等的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。SIRT3 通過(guò)去乙?；{(diào)節(jié)線粒體中多種糖代謝酶的活性，發(fā)揮調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的作用[4]，主要方式為去乙?；せ钜阴］o酶A 合成酶2[11]、丙酮酸脫氫酶磷酸酶[12]、異檸檬酸脫氫酶[13]、琥珀酸脫氫酶[14]，從而促使葡萄糖通過(guò)氧化磷酸化途徑代謝。Paulin等[9]證實(shí)MCT-PAH大鼠肺動(dòng)脈線粒體SIRT3 表達(dá)下降，并伴隨線粒體蛋白乙?；潭仍龈?，通過(guò)基因治療上調(diào)SIRT3 表達(dá)可逆轉(zhuǎn)PAH[9]。本研究中Western blot結(jié)果顯示MCT-PAH大鼠肺組織中SIRT3表達(dá)下調(diào)，與Paulin等[9]的研究結(jié)果一致，免疫組織化學(xué)染色顯示肺小動(dòng)脈中膜SIRT3表達(dá)下調(diào)明顯，提示SIRT3表達(dá)下調(diào)可能通過(guò)調(diào)節(jié)糖代謝通路在PAH發(fā)病中起重要作用。

圖 4 各組大鼠肺小動(dòng)脈Warburg效應(yīng)關(guān)鍵酶和SIRT3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

表4 各組大鼠肺小動(dòng)脈Warburg效應(yīng)關(guān)鍵酶和SIRT3蛋白表達(dá)水平比較

Warburg 效應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶之一是PDH，正常細(xì)胞在氧供充足時(shí)PDH活化，葡萄糖通過(guò)氧化磷酸化途徑代謝，維持細(xì)胞三磷酸腺苷(ATP)供應(yīng)正常，缺氧條件下PDH活性受抑制，導(dǎo)致葡萄糖氧化磷酸化途徑受抑，進(jìn)而通過(guò)糖酵解途徑代謝，導(dǎo)致ATP 產(chǎn)量下降[12]。本研究證實(shí)，MCT-PAH大鼠模型肺小動(dòng)脈中膜PDH 表達(dá)下降，并伴隨Warburg 效應(yīng)關(guān)鍵酶表達(dá)升高，提示肺小動(dòng)脈局部存在Warburg效應(yīng)，PDH表達(dá)下調(diào)可能為其觸發(fā)原因之一。PDH與丙酮酸脫氫酶磷酸酶1(PDP1)、PDK1組成丙酮酸脫氫酶復(fù)合體并受二者雙重調(diào)節(jié)，PDP1催化PDH去磷酸化活化、PDK1催化PDH磷酸化失活。近期研究顯示，PDH不僅受磷酸化調(diào)節(jié)，同時(shí)還受乙酰化調(diào)節(jié)，PDH乙?；瘯r(shí)活性亦受到抑制。Fan等[12]研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞PDH、PDP1乙?；潭壬?，并伴隨Warburg 效應(yīng)，通過(guò)基因干預(yù)抑制PDH、PDP1乙酰化可逆轉(zhuǎn)Warburg 效應(yīng)并抑制惡性腫瘤生長(zhǎng)。Ozden等[15]發(fā)現(xiàn)乙?；潭壬邔?dǎo)致PDH失活，SIRT3可直接通過(guò)催化惡性腫瘤細(xì)胞PDH去乙?；黾悠浠钚?；心肌細(xì)胞SIRT3功能被抑制或表達(dá)下調(diào)時(shí)，PDH復(fù)合體乙?；潭壬?，PDH 失活，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體氧化磷酸化受抑[16]。以上研究表明，SIRT3 表達(dá)下調(diào)或功能被抑制時(shí)，不僅通過(guò)乙?；种芇DP1，導(dǎo)致PDH磷酸化失活，而且可直接催化PDH乙?；?，抑制其功能，從而促使葡萄糖代謝向Warburg 效應(yīng)轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果證實(shí)，MCT-PAH肺小動(dòng)脈局部SIRT3表達(dá)下調(diào)，推測(cè)其表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致PDH乙?；Щ?，從而進(jìn)一步增強(qiáng)Warburg效應(yīng)，因此SIRT3的表達(dá)下調(diào)引發(fā)的PDH活性下降可能也是MCT-PAH大鼠Warburg效應(yīng)的始動(dòng)因素之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MCT可誘導(dǎo)大鼠PAH形成，MCT-PAH大鼠肺組織存在Warburg效應(yīng)關(guān)鍵酶表達(dá)上調(diào)和SIRT3表達(dá)下調(diào)，該研究為探討Warburg效應(yīng)在PAH中的作用及可能的觸發(fā)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。