Triton X-100與SDS對SD大鼠皮下移植豬主動脈瓣巨噬細胞表型極化的作用比較

去細胞處理的豬主動脈瓣是構建組織工程瓣膜的重要材料。去細胞處理能有效降低豬主動脈瓣的免疫性，增強瓣膜的體內生物相容性，提高瓣膜的耐久性[1-2]。聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)與十二烷基硫酸鈉(SDS)是豬主動脈瓣去細胞處理最常用的試劑。SDS作為一種離子型去污劑，在低濃度下即可完全去除豬主動脈瓣中的細胞[3-4]，而Triton X-100屬于非離子型去污劑，可以有效去除細胞的質膜和內膜系統(tǒng)，使抗體及大分子物質能夠進入胞漿。

近年來，巨噬細胞極化在組織移植領域受到關注。研究證實，極化的巨噬細胞能夠影響局部免疫反應，調控組織修復過程[5]。但在對去細胞豬主動脈瓣支架材料的研究中，有關化學處理方法對巨噬細胞極化影響的研究較少。本研究分別采用SDS 和Triton X-100對豬主動脈瓣進行去細胞處理，并通過體內實驗分析兩種去細胞方法對巨噬細胞極化的影響，以期為心臟瓣膜組織工程研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

Triton X-100購自美國Sigma公司；SDS、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購自國藥化學試劑有限公司；CD163抗體購自美國Adcam公司；CCR7抗體購自巴傲得生物科技有限公司；S-P超敏試劑盒購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司；二甲氨基偶氮苯(DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。Triton X-100緩沖液的配制方法：配制10 mmol/mL的Tris緩沖液，加入1% Triton X-100試劑，調節(jié)pH值為7.6。SDS緩沖液的配制方法：配制10 mmol/mL的Tris緩沖液，加入1% SDS試劑，調節(jié)pH值為7.6。Triton X-100和SDS緩沖液中均加入青鏈霉素雙抗。

1.2 豬主動脈瓣的獲取

于上海五豐上食食品有限公司購買新鮮宰殺豬的心臟，清潔條件下在30 min內取出心臟瓣膜。將瓣膜置入4 ℃無菌PBS中，運送回實驗室，在無菌操作臺中用PBS反復清洗干凈。

1.3 去細胞瓣膜的制備

將新鮮完整的豬主動脈瓣(n=36)隨機分為3組。未處理組(n=12)：置于無菌的Tris緩沖液中，40 ℃搖床振蕩48 h，每8 h換液1次。Triton X-100處理組(n=12)：置于Triton X-100緩沖液中，40 ℃搖床振蕩48 h，每8 h換液1次，然后在含有雙抗的蒸餾水中4 ℃浸泡12 h。SDS處理組(n=12)：置于SDS緩沖液中，40 ℃搖床振蕩48 h，每8 h換液1次。3組完成上述操作后，換含有雙抗的PBS，4 ℃浸泡72 h，每8 h換液1次。

1.4 建立SD大鼠皮下移植豬主動脈瓣模型

18只4周齡雌性SD大鼠購于第二軍醫(yī)大學實驗動物中心，將其隨機平均分配給未處理組、Triton X-100處理組和SDS處理組以備皮下植入瓣膜。大鼠經(jīng)異氟烷吸入麻醉后仰臥位固定于操作臺，于大鼠胸部左右兩側各做長約2 cm的切口，每側埋入1片經(jīng)上述方法處理后的瓣膜，隨后縫合切口并于動物中心正常飼養(yǎng)。分別于瓣膜組織植入皮下后第3、14、28 天時將各組中2只SD大鼠皮下移植的瓣膜組織取出，以便進一步分析。

1.5 免疫組織化學染色

將瓣膜標本置于10%福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，二甲苯脫蠟入水，梯度酒精脫水，檸檬酸鈉緩沖液抗原修復。過氧化物酶阻斷劑室溫孵育10 min，PBS沖洗后非免疫性動物血清室溫孵育10 min。加入CCR7一抗(1∶200)、CD163一抗( 1∶500)，4 ℃孵育過夜，加入生物素標記的二抗，室溫孵育10 min。加入鏈霉菌-過氧化物酶溶液室溫孵育后，DAB顯色，蘇木素復染細胞核，1%鹽酸乙醇分化，碳酸鋰返藍，無水乙醇脫水，中性樹膠封片觀察。免疫組織化學染色結果判定方法：CD163、CCR7主要定位于細胞膜和(或)細胞漿，以胞膜和(或)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。隨機選定10個高倍鏡視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)，取平均值。

1.6 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學分析采用 GraphPad軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本的t檢驗或Wilcoxon檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 瓣膜移植物中CCR7免疫組織化學染色結果

CCR7免疫組織化學染色結果見圖1、表1。經(jīng)處理的豬主動脈瓣膜于皮下移植3 d、14 d和28 d后，未處理組、Triton X-100處理組與SDS處理組瓣膜中均可見CCR7表達，其中SDS處理組CCR7+細胞數(shù)顯著少于Triton X-100處理組與未處理組(P均<0.05)。但Triton X-100處理組與未處理組的差異無統(tǒng)計學意義。

圖1 免疫組織化學染色法檢測瓣膜移植物中CCR7表達情況(×400)

表1 高倍鏡視野下各組瓣膜CCR7+細胞數(shù)比較/個

2.2 瓣膜移植物中CD163免疫組織化學染色結果

CD163免疫組織化學染色結果見圖2、表2。經(jīng)處理的豬主動脈瓣膜于皮下移植3 d、14 d后，未處理組、Triton X-100處理組和SDS處理組瓣膜中均可觀察到CD163表達，其中SDS處理組CD163+細胞數(shù)顯著少于未處理組及Triton X-100處理組(P均<0.05)。Triton X-100處理組與未處理的差異無統(tǒng)計學意義。皮下移植28 d后，上述3組瓣膜CD163+細胞數(shù)無明顯統(tǒng)計學差異。

2.3 瓣膜移植物中巨噬細胞表型極化分析

CCR7為經(jīng)典活化的M1型巨噬細胞的標志物，CD163為選擇性活化的M2型巨噬細胞的標志物。在本研究中，我們通過計算M2型巨噬細胞與M1型巨噬細胞的比值來分析巨噬細胞表型極化的情況，M2型/M1型巨噬細胞=CD163+細胞數(shù)/CCR7+細胞數(shù)。

未處理組、Triton X-100處理組與SDS處理組SD大鼠皮下移植3 d、14 d和28 d時豬主動脈瓣中M2型/M1型巨噬細胞比值見表3。第3、14、28 天時，空白對照組M2型/M1型巨噬細胞比值<1；SDS處理組與Triton X-100處理組在第14、28天時，M2型/M1型巨噬細胞比值>1。在第14天時，SDS處理組豬主動脈瓣M2型/M1型巨噬細胞比值明顯高于其他兩組(P均<0.05)。

圖2 免疫組織化學染色法檢測瓣膜移植物中CD163表達情況 (×400 )

表2 高倍鏡視野下各組瓣膜CD163+細胞數(shù)比較/個

表3 各組瓣膜M2型/M1型巨噬細胞比較

3 討論

手術植入人工心臟瓣膜是目前治療心臟瓣膜病的唯一有效方法[6-7]。患者植入機械瓣后需終身抗凝，同源性生物瓣由于倫理學限制，來源較少。豬心臟瓣膜的解剖結構與人類極為相似且來源豐富，因而更具吸引力。去細胞豬主動脈瓣因其適當?shù)目障堵省⒘己玫募毎じ叫院蜋C械性能、天然的構型等優(yōu)點成為心臟瓣膜組織工程較為理想的材料[8-9]。目前已成功建立了多種去細胞方法，但不同方法處理的瓣膜在體內組織修復過程中的作用還需進一步探索。

移植材料被植入宿主體內后常常伴隨著炎性反應和組織修復，巨噬細胞是調控兩者平衡的主要細胞。在不同條件下，巨噬細胞會出現(xiàn)形態(tài)和功能變化，發(fā)生極化。根據(jù)免疫表型和細胞功能不同，巨噬細胞可分為經(jīng)典活化的M1型巨噬細胞和選擇性活化的M2型巨噬細胞。在本研究中，我們建立了SD大鼠皮下移植模型，以CCR7+細胞為M1型巨噬細胞，CD163+細胞為M2型巨噬細胞。瓣膜在小鼠皮下包埋28 d后，未處理瓣膜中M2型/M1型巨噬細胞比值<1，提示巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化，M1型巨噬細胞主要功能為分泌促炎性因子，在炎性反應時期發(fā)揮重要作用，因此未去細胞豬瓣膜在宿主體內可能促進巨噬細胞介導的炎性反應。SDS、Triton X-100處理的瓣膜在小鼠皮下包埋14 d后，M2型/M1型巨噬細胞比值>1，提示巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化，M2型巨噬細胞激活后可發(fā)揮促進組織修復的作用，因此去細胞能促進異種瓣膜在宿主體內的組織修復過程。豬主動脈瓣在SD大鼠皮下移植第14天時，SDS促進瓣膜組織修復的作用較Triton X-100更為明顯，提示SDS去細胞處理方法是促進豬心臟瓣膜組織體內修復更為有效的方法。

本研究探索不同去細胞方法制備的豬心臟瓣膜對巨噬細胞向M1型或M2型巨噬細胞表型極化的調控作用，證實去細胞能促進巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化，SDS去細胞方法在促進巨噬細胞極化時優(yōu)于Triton X-100去細胞方法。由于人造瓣膜仍有較多缺陷，利用組織工程技術制造瓣膜成為研究的熱點[10]。組織工程瓣膜能很好地解決抗凝、抗感染、耐久性差等問題，有良好的應用前景[11-12]。該研究可為組織工程瓣膜支架的構建提供新的研究依據(jù)。