骨關節(jié)炎模型大鼠血清骨保護素及軟骨下骨降鈣素基因相關肽、神經生長因子表達及Mankin評分變化

常琦 阮貞 王憲偉 王茂朋

(1三峽大學附屬仁和醫(yī)院急診科，湖北 宜昌 443001；2宜昌市中心醫(yī)院心內科；3三峽大學附屬仁和醫(yī)院骨科)

前列腺素和甲狀旁腺激素可刺激骨關節(jié)炎(OA)軟骨下骨的成骨細胞合成環(huán)磷酸腺苷的能力下降，而其均在OA中發(fā)揮相應作用，說明成骨細胞功能缺陷與OA軟骨下骨重塑相關〔1〕。研究表明，一系列相關因子對成骨細胞及破骨細胞活性均有調節(jié)作用，已經明確骨保護素(OPG)、核因子κB受體活化因子(RANK)和RANK配體(L)在調節(jié)軟骨下骨的重塑中起著重要的作用〔2〕。交感系統(tǒng)調控著骨代謝，目前已比較明確的在骨組織中發(fā)揮重要調節(jié)作用的物質有降鈣素基因相關肽(CGRP)、P物質(SP)、血管活性腸肽(VIP)、神經肽(NP)Y等，這些神經因子在骨的生長發(fā)育等過程中起著重要的作用，CGRP、神經生長因子(NGF)能促進成骨細胞成熟，加速骨折愈合，另外研究也顯示這些神經因子參與股骨頭壞死疾病的進展〔3，4〕。本實驗觀察OA大鼠造模后不同時期軟骨下骨CGRP、NGF的改變，并測定其相應時期血清OPG濃度的改變，以更好地了解OA軟骨下骨骨代謝調節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物和主要試劑 SPF 級雄性 SD 大鼠(購自三峽大學實驗動物中心) 40 只，5月齡，體重 260～290 g，飼養(yǎng)于三峽大學動物實驗中心，飼養(yǎng)環(huán)境達到動物實驗條件要求。隨機分為4組，分別為對照組，實驗組(2 w組，4 w組，8 w組)，每組10只，對照組為假手術，2 w組、4 w組和8 w組為造模2、4、8 w后處死組。OPG酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒和NGF 兔抗鼠單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；CGRP 兔抗鼠單克隆抗體 (北京博奧森生物技術有限公司)；生物素化羊抗兔二抗試劑盒(天津 TBD 生物工程有限公司)；青霉素粉劑(華北制藥股份有限公司)；其他實驗常用試劑均為國產分析純。

1.2大鼠OA模型的制備 采用大鼠前交叉韌帶切斷方法造模，1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射，麻醉完成后，備皮，常規(guī)右后膝消毒鋪巾后，行膝髕旁內側切口，切開皮膚，仔細分離皮下組織，將髕骨向外側脫位，切開關節(jié)囊，顯露膝關節(jié)，屈曲膝關節(jié)，可見膝關節(jié)前交叉韌帶，以剪刀剪斷，行前抽屜實驗(+)，證明實驗切斷前交叉成功，生理鹽水反復沖洗傷口，以4-0愛惜康帶針線縫合關節(jié)囊及皮膚，活力碘消毒，術后第一天肌注青霉素20萬U，并傷口活力碘消毒。對照組造模方法同前，顯露膝關節(jié)，屈曲見膝關節(jié)前交叉韌帶連續(xù)性完整，前交叉實驗，生理鹽水反復沖洗膝關節(jié)，以4-0愛惜康帶針線縫合關節(jié)囊及皮膚，術后第一天肌注青霉素20萬U，并傷口活力碘消毒。

1.3大鼠血清OPG測定 腹腔麻醉完成后，胸部剪毛備皮，常規(guī)活力碘消毒，鋪無菌巾，沿胸骨左緣切開皮膚，剪斷肋骨，顯露心臟，用靜脈采血針插入左心室，抽取約3 ml血液，放入低溫(4℃)冰箱靜置，30 min后離心機離心(3 000 r/min)，再放入-80℃冰箱保存，待所有血清標本收集后，常溫下復融，按照OPG ELISA試劑盒說明書進行操作，經酶標儀在450 nm光度值下測定其OD值，繪出標準線性方程，根據相應結果測出OPG濃度。

1.4大鼠軟骨下骨CGRP、NGF免疫組化切片制作 大鼠心臟取血完成后，立即沿右后膝原來手術切口切開皮膚，分離皮下筋膜組織，髕骨外翻，切開關節(jié)囊，顯露膝關節(jié)，肉眼觀察膝關節(jié)軟骨退變大體情況，取脛骨內側髁，完整剔除周圍肌肉筋膜等軟組織，置于4%多聚甲醛溶液下，4℃冰箱固定24 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)充分浸洗，沖洗2 h，15%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣4 w，修整組織塊，石蠟包埋處理，作冠狀面不連續(xù)切片，每個標本切9張，間隔100 μm切片，各取3張分別行HE，NGF和CGRP免疫組化染色。肉眼觀察大鼠膝關節(jié)大體情況，顯微鏡下觀察HE染色，并對軟骨進行Mankin評分，采用ImageProPlus5.0.2圖像分析系統(tǒng)軟件分析CGRP、SP免疫組化染色切片，置于40倍物鏡下取軟骨表層至鈣化層為觀察范圍，每個標本隨機選3個視野，測定其灰度值。

1.5統(tǒng)計學處理 應用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1實驗動物一般情況 動物術后均未發(fā)生傷口感染，早期大鼠活動減少，跛行，1 w后基本恢復正?；顒?，未發(fā)生死亡情況。

2.2HE染色細胞形態(tài)學 對照組關節(jié)軟骨的層次結構清晰，軟骨表面無破壞，保持其完整性；2 w組關節(jié)軟骨表層軟骨細胞發(fā)生改變，可見細胞聚集現(xiàn)象，于軟骨表層及中間層交界處，可見不規(guī)則軟骨細胞，軟骨細胞呈巢狀，排列紊亂，軟骨細胞大小、密度不均一；4 w組軟骨細胞數(shù)量變少，排列更加紊亂，可見軟骨表明毛糙；8 w組上述改變更加嚴重，部分區(qū)域軟骨細胞缺損(圖1)。2 w組〔(3.82±0.48)分〕，4 w組〔(5.24±0.92)分〕，8 w組Mankin評分〔(7.14±0.31)分〕明顯高于對照組〔(0.58±0.53)分〕，表明建模成功，各組間比較有統(tǒng)計學差異(F=25.3，P<0.01)。

圖1 各組軟骨細胞HE染色(×40)

2.3血清 OPG 結果 與對照組(290.7±10.4)相比，2 w組(263.6±8.2)及4 w組血清OPG濃度(178.5±7.5)逐漸下降，8 w組(240.9±6.3)又稍回升，各組間比較有統(tǒng)計學差異(F=29.3，P<0.01)。

2.4CGRP、NGF免疫組化染色切片結果 CGRP、NGF免疫組化染色，兩組變化趨勢相一致，對照組骨小梁區(qū)周圍著色區(qū)域多，著色較深；2 w組骨小梁著色區(qū)域變淡；4 w組相應著色更少，8 w組較前顏色稍加深，見圖2、圖3?；叶戎到Y果見表1，CGRP各組間比較存在統(tǒng)計學差異(P<0.01)，NGF各組間比較存在統(tǒng)計學差異(P<0.01)。

圖2 各組CGRP免疫組化切片(×100)

圖3 各組NGF免疫組化切片(×100)

組別CGRPNGF對照組190.2±8.3110.6±4.52 w組171.2±6.892.6±5.14 w組113.5±8.663.0±7.38 w組145.7±6.977.2±4.8F/P值22.8/<0.0125.8/<0.01

3 討 論

OA是最常見的一種關節(jié)疾病，其發(fā)生是由于各種因素導致生物力學特性改變，致使關節(jié)軟骨、軟骨下骨及細胞外基質失衡。長期以來，軟骨退變一直是國內外比較關注的重點，對于軟骨下骨的作用研究較少，近些年來發(fā)現(xiàn)軟骨下骨改變是OA的重要病理變化，盡管對于其是否是OA始發(fā)因素尚存在爭論。許多基礎實驗證明，OA時軟骨下骨重塑所導致的骨質硬化，骨密度增高，使軟骨下骨的生物學性能改變，其對關節(jié)軟骨的保護功能下降，進而引起或者加重關節(jié)軟骨退變〔5〕。

OPG、RANKL、RANK是目前公認的調控骨代謝的重要途徑，其為腫瘤壞死因子家族成員，通過作用于破骨細胞，調控著骨形成及骨吸收。RANK與RANKL結合后，可通過核因子途徑激活破骨細胞分化的信號傳導通路，誘發(fā)相應激酶，發(fā)生一系列酶鏈反應，激活核因子復合體、活化蛋白-1及轉錄因子，核因子再次激活破骨細胞前體細胞的核因子復合體，通過一系列反應，使沒有功能的破骨細胞轉化成有活性的破骨細胞。最近研究發(fā)現(xiàn)，OPG/RANK/RANKL不僅在軟骨下骨中表達，發(fā)揮調節(jié)作用，軟骨本身也能產生OPG、RANK、RANKL，OPG通過相應途徑調控軟骨代謝，在OA疾病進展中發(fā)揮著不可忽略的作用〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)〔7〕，通過實時定量PCR進行分析發(fā)現(xiàn)，OA組和正常組均有上述因子產生，軟骨細胞OPG的含量較RANK與RANKL高，OA患者RANK含量明顯較正常組增高。OA軟骨產生并分泌OPG，在OA軟骨細胞表面，也可以發(fā)現(xiàn)RANK及RANKL，有趣的是，盡管膜性RANKL在所有軟骨細胞均可發(fā)現(xiàn)，膜性RANK僅在軟骨細胞某些亞群產生，僅有(29±4)%的軟骨細胞產生RANK，這些軟骨細胞分布在整個軟骨層，進一步深入研究發(fā)現(xiàn)，表達RANK的軟骨細胞其軟骨細胞標志物如蛋白聚糖，膠原酶-Ⅱ含量明顯增高。本實驗通過測量血清OPG含量，從側面間接反映大鼠OA時期軟骨代謝的改變，發(fā)現(xiàn)早期OPG含量一直下降，8 w后又稍上升，這些與上述結果符合，也與文獻報道的其他實驗結果類似〔8〕，這些均說明OPG在OA疾病進展中發(fā)揮著不可忽略的作用。OA早期，骨吸收為主要改變，OPG的抑制破骨細胞功能下降，破骨細胞功能加強，導致軟骨下骨皮質終板及骨小梁稀疏變薄，最終骨小梁失去彈性；后期，OPG含量逐漸增高，促進成骨細胞功能加強，關節(jié)形成骨贅，代償關節(jié)改變。提示OA軟骨下骨骨代謝不單純是骨吸收過程，其是骨吸收與骨形成共同作用，軟骨下骨較高的骨轉化率是其重要的特點。

正常骨組織代謝離不開神經系統(tǒng)有效的調控，骨組織中含有較多的神經分泌的NP類物質，如CGRP、SP、VIP、NPY等，這些物質的受體均在骨組織中表達，許多在體實驗研究發(fā)現(xiàn)，這些肽類物質調控著骨的代謝，影響骨細胞的生物學功能〔8〕。交感神經、感覺神經在骨小梁附近血管周圍交織成稠密的網織結構。實驗及臨床研究發(fā)現(xiàn)神經系統(tǒng)在骨的形成、生長、轉化及修復過程中具有很關鍵的作用〔9〕，這些神經元細胞在外周的生長與生存又需要外周信號的引導，在骨組織中承擔這一角色的是NGF，總而言之，正常骨代謝需要交感神經系統(tǒng)、感覺神經系統(tǒng)及骨組織內相應細胞的共同作用。本實驗結果說明在早期軟骨下骨骨吸收為主，而CGRP對骨組織主要的生理學作用為促進成骨細胞成骨作用，其通過促進成骨細胞環(huán)腺苷酸(c-AMP)形成，提高成骨活性，并刺激成骨細胞來源細胞增殖、分化。更深入研究〔10〕發(fā)現(xiàn)CGRP可增加胰島素樣生長因子(IGF)-1 mRNA的表達，使IGF-1合成增加，從而促進骨形成。CGRP尚具有抑制破骨細胞的功能，使骨吸收能力下降，降低血中鈣含量。骨折時，CGRP含量明顯上升，促進骨形成，抑制骨吸收，促進骨折的愈合。體外研究發(fā)現(xiàn)〔11〕，CGRP可抑制骨髓間充質干細胞向破骨細胞轉化，促進成骨細胞增殖，進而抑制骨吸收，促進骨形成。有研究表明〔12〕，CGRP還可通過促進血管內皮細胞增生來促進骨的血管化，而血管化又與軟骨下骨骨髓組織纖維化及OA疼痛相關。軟骨下骨骨髓組織纖維化與NGF的關系也很密切，其能誘使神經纖維長入骨組織中，加重OA疼痛癥狀。NGF能誘使血管及神經組織生成，有研究發(fā)現(xiàn)NGF受體可在成骨細胞上表達，NGF與之結合后，增強其成骨能力〔13〕。近期研究顯示，NGF在介導OA滑膜血管生成及疼痛方面有重要作用〔14〕，神經因子，特別是NGF在OA關節(jié)滑液及滑膜炎患者滑膜組織中表達，另一實驗證明人類軟骨細胞能合成NGF并在其表面表達高親和性NGF受體，在OA病程中，軟骨細胞NGF及其受體表達上調，表明NGF在OA病程中能促進軟骨細胞代謝〔15〕。

綜上，軟骨下骨在OA中的作用是當前研究的熱點，通過藥物作用于軟骨下骨，改善其代謝，維持其生物力學特性，或許是OA藥物治療的一個新的方向。采用前交叉韌帶切斷方法可成功制造大鼠OA模型，該實驗方法簡單，成功率高；血清OPG、軟骨下骨CGRP、NGF作為調節(jié)骨代謝因子，調控著OA軟骨下骨骨代謝，是OA疾病發(fā)生的重要因子；通過藥物調節(jié)軟骨下骨骨代謝有希望達到治療OA的目的。