肺癌惡性胸腔積液中稀有腫瘤細(xì)胞的鑒定與單細(xì)胞測(cè)序分析

吳保軍，王卓，董宇，鄧宇亮，施奇惠

?

肺癌惡性胸腔積液中稀有腫瘤細(xì)胞的鑒定與單細(xì)胞測(cè)序分析

吳保軍，王卓，董宇，鄧宇亮，施奇惠

上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院，系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240

腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性是指腫瘤細(xì)胞在基因組或表型水平上具有不同特征。在外界環(huán)境壓力或人為殺傷因素刺激下，腫瘤細(xì)胞具有不同的響應(yīng)方式，從而導(dǎo)致它們?cè)诩?xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移及耐藥能力等方面產(chǎn)生差別，尤其是一部分具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞能脫離原位組織并在遠(yuǎn)處器官形成轉(zhuǎn)移灶。因此，腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性為其發(fā)生轉(zhuǎn)移和耐藥提供了可能。傳統(tǒng)的腫瘤異質(zhì)性研究主要基于不同位置原位組織樣本中的群體細(xì)胞，缺乏單細(xì)胞層面的解析，尤其是對(duì)具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性研究。本研究建立了基于肺癌惡性胸腔積液中轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞研究路線，首先利用代謝標(biāo)志物鑒定惡性胸腔積液中高代謝活性的腫瘤細(xì)胞，其次通過(guò)單細(xì)胞Sanger測(cè)序揭示這些腫瘤細(xì)胞具有一致的驅(qū)動(dòng)基因突變特征，然后利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)腫瘤細(xì)胞染色體拷貝數(shù)變異進(jìn)行分析，從而揭示同一患者具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞即使具有相同的驅(qū)動(dòng)基因突變特征，但在基因組層面上仍具有異質(zhì)性，可進(jìn)一步細(xì)分為若干子群。本研究結(jié)果對(duì)于更深入地理解腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要意義。

肺癌；胸腔積液；腫瘤細(xì)胞；單細(xì)胞測(cè)序

肺癌是威脅人類(lèi)健康的主要疾病，其發(fā)病率及致死率在我國(guó)穩(wěn)居各項(xiàng)惡性腫瘤之首[1]。對(duì)于同一種癌癥，不同患者間的腫瘤具有很大的異質(zhì)性[2,3]；即使對(duì)于同一患者而言，由于基因組的不穩(wěn)定，其惡性腫瘤在增殖過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生不同的子代細(xì)胞亞群，它們?cè)诨蚪M[4]或表型[5]層面具有不同的分子與功能特征，不同的亞群其細(xì)胞增殖、侵襲轉(zhuǎn)移以及耐藥潛能方面都存在差異，尤其是存在一部分具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞能脫離原位組織并在遠(yuǎn)處器官形成轉(zhuǎn)移灶[6]，因此，腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性為其發(fā)生轉(zhuǎn)移和耐藥提供了可能。但傳統(tǒng)的腫瘤異質(zhì)性研究主要基于不同位置原位組織樣本中的群體細(xì)胞。雖然近年來(lái)迅速發(fā)展的高通量測(cè)序技術(shù)提高了腫瘤基因組解析的速度，但針對(duì)群體腫瘤細(xì)胞的基因組高通量測(cè)序不可避免的會(huì)引入大量非腫瘤細(xì)胞的遺傳信息。有研究表明，從實(shí)體瘤組織內(nèi)提取的腫瘤細(xì)胞，其中真正腫瘤細(xì)胞的DNA占總DNA的量不到50%，這樣整體平均化的測(cè)序結(jié)果使得很多頻率較低但非常重要的腫瘤基因組信息被湮沒(méi)[7]。單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)從根本上克服了這樣的局限，它能夠從單個(gè)細(xì)胞水平探究不同腫瘤細(xì)胞的基因組和轉(zhuǎn)錄組特征。Xu等[8]利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)揭示了腎癌細(xì)胞單核苷酸突變特性；Hou 等[9]同樣利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)探究了骨髓增殖性腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為腫瘤異質(zhì)性研究提供了全新的思路。而Navin等[10]利用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)繪制了200多個(gè)腫瘤細(xì)胞的進(jìn)化圖譜，可見(jiàn)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)在腫瘤生物學(xué)方面有著極大的應(yīng)用前景。

過(guò)去腫瘤異質(zhì)性研究主要聚焦于腫瘤組織的異質(zhì)性，比如對(duì)腫瘤組織的不同位置取樣進(jìn)行異質(zhì)性分析，缺乏對(duì)具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行深入的分析。眾所周知，轉(zhuǎn)移是腫瘤致死的最重要因素，因此非常有必要對(duì)轉(zhuǎn)移性的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞尺度上的分子分析，解析其異質(zhì)性[11,12]。由于肺癌患者常伴有惡性胸腔積液的產(chǎn)生，胸腔積液中所含有的腫瘤細(xì)胞是肺癌胸膜轉(zhuǎn)移的標(biāo)志[13]。因此，肺癌患者惡性胸腔積液中的腫瘤細(xì)胞代表了從腫瘤組織脫落、具有轉(zhuǎn)移能力的腫瘤細(xì)胞群體[14]。本研究以肺癌患者惡性胸腔積液中單個(gè)腫瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序檢測(cè)其基因組特征并分析這些腫瘤細(xì)胞在基因組層面上的異質(zhì)性。由于胸腔積液中細(xì)胞成分復(fù)雜，包含多種類(lèi)型的細(xì)胞，因此需首先使用本實(shí)驗(yàn)室前期開(kāi)發(fā)的高代謝活性惡性腫瘤細(xì)胞的鑒定方法，并以多重置換擴(kuò)增的單細(xì)胞基因組擴(kuò)增技術(shù)和高通量測(cè)序技術(shù)為主要技術(shù)路線，建立一整套轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞分析方案，從而進(jìn)一步解析腫瘤細(xì)胞在分子層面的異質(zhì)性，為更深入理解腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制提供更多信息。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

肺癌患者的胸腔積液樣本收集自上海市胸科醫(yī)院，5名患者均為非小細(xì)胞肺癌患者，臨床分期均為Ⅳ期，其中男性患者3名，女性患者2名，樣本收集及后續(xù)研究均通過(guò)倫理委員會(huì)審核，且在患者充分知情的情況下進(jìn)行。

1.2 微孔陣列芯片制作及表面修飾

參照本實(shí)驗(yàn)室前期開(kāi)發(fā)的微孔陣列芯片制作方法制作實(shí)驗(yàn)所需微孔陣列芯片[15]。將聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane, PDMS)的兩種組分按照1∶10質(zhì)量比充分?jǐn)嚢杌靹?，真空抽去氣泡，均勻倒于放置硅片模具?0 cm培養(yǎng)皿中。將皿置于80℃電熱烘箱中烘烤2 h。將PDMS從模具上剝離，按照設(shè)計(jì)的邊沿切割成具有400個(gè)小型數(shù)字編號(hào)區(qū)域，共計(jì)11萬(wàn)個(gè)直徑為30 μm微孔的長(zhǎng)方形芯片，然后與經(jīng)等離子體表面處理的玻片緊密貼合，最后使用2%的Matrigel對(duì)PDMS芯片的微孔區(qū)域進(jìn)行修飾。

1.3 高代謝活性腫瘤細(xì)胞的鑒定

臨床收集的肺癌患者胸腔積液樣本置于4℃條件下送至實(shí)驗(yàn)室。首先經(jīng)100 μm孔徑的細(xì)胞篩去除細(xì)胞聚團(tuán)和雜質(zhì)，然后在4℃條件下通過(guò)300離心5 min收集細(xì)胞沉淀，再加入一定量紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞沉淀并室溫避光裂解15 min。裂解結(jié)束后于4℃條件200離心5 min，用含0.1% BSA的HBSS重懸細(xì)胞，按照每1×107細(xì)胞加入20 μL CD45- APC抗體染色，室溫翻轉(zhuǎn)孵育，然后將細(xì)胞均勻鋪至事先處理好的PDMS微孔芯片上并用無(wú)糖Dulb-eccos Moddified Eagle Medium(DMEM)培養(yǎng)基洗去CD45-APC。在芯片上加入使用無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基配制2-NBDG染色液，使其濃度達(dá)到0.4 mmol/L，37℃避光條件下孵育10 min，再用預(yù)冷的HBSS溶液快速清洗芯片，在低溫下使用高內(nèi)涵顯微成像系統(tǒng)(ImageXpress. XLS. Molecular Devices公司, 美國(guó))對(duì)細(xì)胞進(jìn)行熒光成像。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室建立的方法鑒定芯片上的高代謝活性腫瘤細(xì)胞。

1.4 腫瘤單細(xì)胞回收與單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增

借助顯微操作平臺(tái)準(zhǔn)確回收高代謝活性腫瘤單細(xì)胞，將腫瘤單細(xì)胞移入含有4 μL PBS的PCR管中。使用REPLI-g single cell kit (Qiagen, 德國(guó))對(duì)單細(xì)胞全基因組進(jìn)行擴(kuò)增，具體實(shí)驗(yàn)操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。首先按照11∶1混合DLB與DTT配制單細(xì)胞裂解液，向腫瘤單細(xì)胞中加入3 μL細(xì)胞裂解液，65℃裂解10 min，加入3 μLStop solution終止裂解。按照表1配制單細(xì)胞基因組擴(kuò)增反應(yīng)液，向每個(gè)腫瘤單細(xì)胞樣本中加入40 μL單細(xì)胞基因組擴(kuò)增反應(yīng)液，具體成分為29 μL REPLI-g sc Reaction Buffer、9 μL H2O、2 μL scPhi29 DNA polymerase。PCR儀中30℃孵育5 h；65℃，3 min使酶滅活。

1.5 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物基因突變檢測(cè)

針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體基因(epidermal growth factor receptor,)的18、19、20和21外顯子分別設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)特異性擴(kuò)增引物用于基因突變檢測(cè)[16](引物見(jiàn)表2)。使用2×Ex-Premix擴(kuò)增目標(biāo)片段，配制反應(yīng)體系。具體PCR反應(yīng)程序：94℃，3 min；94℃，15 s，60℃，20 s，72℃，30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃，5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)凝膠電泳檢驗(yàn)，有明顯條帶則證明擴(kuò)增成功，剩余擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.6 單細(xì)胞全基因組測(cè)序

使用實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的針對(duì)22條染色體特定片段的擴(kuò)增引物對(duì)單細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)控，通過(guò)質(zhì)檢的單細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)建庫(kù)測(cè)序。單細(xì)胞全基因組測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建使用NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB，美國(guó))。首先使用3 μL NEBNest dsDNA fragmentase在片段化緩沖液中37℃反應(yīng)4 min，立即加入5 μL EDTA終止片段化；再使用0.65×恢復(fù)至室溫的Agencourt AMPure XP beads吸附>500 bp的DNA片段并棄去，使用0.1×Agencourt AMPure XP beads吸附300~500 bp大小的片段，經(jīng)現(xiàn)配的80%酒精洗滌兩次后，用無(wú)核酸酶水洗脫建庫(kù)DNA片段；使用Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo, 美國(guó))測(cè)定樣本濃度；末端修復(fù)階段使用樣本量為60~100 ng，并在End Prep Enzyme Mix作用下，20℃孵育30 min，65℃孵育30 min；修復(fù)后的平末端加A及接頭階段，使用NEB Next Adaptor在Blunt/TA Ligase Master Mix及Ligation Enhancer的作用下，DNA平末端加上腺嘌呤及連接有胸腺嘧啶的特異性接頭；為保證后續(xù)反應(yīng)，需將U型環(huán)狀特異性接頭剪開(kāi)形成雙鏈，加入3 μL USER Enzyme在37℃條件下孵育15 min完成酶切；為純化連上特異性接頭的DNA片段，使用0.8×恢復(fù)至室溫的Agencourt AMPure XP beads吸附目的DNA，使用現(xiàn)配的80%酒精洗去多余的接頭，并用16 μL無(wú)核酸酶水室溫孵育beads 2 min，置于磁力架吸附3 min，將上清移入0.2 mL PCR管中；全基因組測(cè)序文庫(kù)預(yù)擴(kuò)增階段使用Q5 DNA Polymerase PreMix體系，針對(duì)每一個(gè)不同的單細(xì)胞全基因組文庫(kù)引入不同的Index進(jìn)行標(biāo)記；文庫(kù)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Agencourt AMPure XP beads兩步法純化，使用現(xiàn)配的80%酒精洗滌beads兩次，再用20 μL無(wú)核酸酶水洗脫文庫(kù)DNA；最后使用Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo, 美國(guó))測(cè)定文庫(kù)濃度，Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, 美國(guó))檢測(cè)DNA片段分布，按照等摩爾質(zhì)量混合不同樣本文庫(kù)，高通量測(cè)序使用HiSeq X Ten平臺(tái)，按照PE150測(cè)序方案完成。

表1 單細(xì)胞基因組擴(kuò)增反應(yīng)液成分

表2 非小細(xì)胞肺癌EGFR基因檢測(cè)擴(kuò)增引物

1.7 數(shù)據(jù)質(zhì)控與分析

測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控采用MAPD值法?；贛ultiple absolute pairwise difference算法：MAPD=Median (log2nCNRi+1-log2nCNRi)，其中i代表單個(gè)窗口，MAPD值越大，噪音越大，數(shù)據(jù)質(zhì)量越差。本研究采用0.45為閾值，去除MAPD值大于0.45的樣本[17]。

以通過(guò)質(zhì)控的單細(xì)胞下一代測(cè)序(Next generation sequencing, NGS)數(shù)據(jù)為分析單元，使用FASTQC工具評(píng)估數(shù)據(jù)質(zhì)量，使用Trimmomatic-0.36程序[18]去除質(zhì)量不好的堿基和多余的接頭，采用處理PE測(cè)序模式數(shù)據(jù)的命令得到clean reads和數(shù)據(jù)處理日志。Clean reads獲取原則為切除首端堿基質(zhì)量小于3和末端堿基質(zhì)量小于3的堿基，Windows的size為4個(gè)堿基，切除平均堿基質(zhì)量小于15，舍棄小于36 bp的reads。針對(duì)每一個(gè)去除接頭和低質(zhì)量reads的單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)，使用BWA比對(duì)軟件[19](Burrows- Wheeler Alignment tool)將clean reads數(shù)據(jù)比對(duì)到UCSC hg19的參考基因組上并且輸出SAM文件。為了后續(xù)計(jì)算，用Samtools工具[20]將SAM文件壓縮成BAM文件，并進(jìn)行染色體排序。為了提高計(jì)算速度，用Samtools對(duì)其建立索引，然后使用Picard (Picard-tools-1.119)將測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中由PCR預(yù)擴(kuò)增引入的重復(fù)進(jìn)行標(biāo)記和刪除，排除PCR過(guò)程造成的干擾。處理完成的每一個(gè)單細(xì)胞NGS數(shù)據(jù)，我們采用500 kb長(zhǎng)度為窗口將其分割，記錄每一個(gè)窗口內(nèi)的reads數(shù)目，并對(duì)其進(jìn)行GC含量的標(biāo)準(zhǔn)化。最后，采用R語(yǔ)言中DNAcopy package[21]環(huán)狀二元分割法來(lái)計(jì)算染色體拷貝數(shù)，用于染色體拷貝數(shù)變異分析，最后用R語(yǔ)言畫(huà)圖可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 微孔陣列芯片設(shè)計(jì)

本研究采用本實(shí)驗(yàn)室前期設(shè)計(jì)的微孔陣列芯片，該芯片包含11萬(wàn)個(gè)直徑為30 μm，深度為30 μm的微孔，分布于400個(gè)數(shù)字編號(hào)的方形區(qū)域中(圖1，A和B)。微孔區(qū)域經(jīng)過(guò)等離子修飾親水，并滴加上400 μL PBS保持親水性。

2.2 分選高代謝活性腫瘤單細(xì)胞

基于本實(shí)驗(yàn)室之前的研究，可通過(guò)熒光標(biāo)記的葡萄糖類(lèi)似物2-NBDG表征細(xì)胞的葡萄糖攝取能力，并將白細(xì)胞標(biāo)志物CD45表達(dá)陰性，2-NBDG高攝取的細(xì)胞鑒定為高代謝活性的疑似腫瘤細(xì)胞，其惡性可通過(guò)單細(xì)胞測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn)。圖2A所示為2號(hào)患者胸腔積液中細(xì)胞成像結(jié)果，F(xiàn)ITC通道強(qiáng)綠色熒光而APC通道無(wú)紅色熒光(CD45-，NBDG+)即為CD45陰性的高代謝活性疑似腫瘤細(xì)胞，APC通道有紅色熒光(CD45+)即表征白細(xì)胞，在5名患者胸腔積液中均發(fā)現(xiàn)此類(lèi)疑似腫瘤細(xì)胞。基于芯片設(shè)計(jì)的可尋址功能，使用顯微操作儀將目的細(xì)胞取出置于PBS中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(圖2B)。

圖1 微孔陣列芯片實(shí)物圖

A：芯片與干凈的玻片粘合，置于培養(yǎng)皿中固定；B：編號(hào)為“227”的方形區(qū)域，細(xì)胞較均勻鋪滿微孔。

圖2 胸腔積液中高代謝活性腫瘤細(xì)胞的鑒定及顯微操作挑取單細(xì)胞示意圖

A：2號(hào)患者3個(gè)典型的高代謝活性腫瘤細(xì)胞。BF表示明場(chǎng)下的成像圖，CD45-APC表示在APC通道的成像圖，2-NBDG-FITC表示在FITC通道的成像圖，Merge表示將明場(chǎng)以及各熒光通道疊加之后的成像效果圖；B：使用毛細(xì)玻璃管吸取和吹出目的細(xì)胞的示 意圖。

2.3 單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增及Sanger測(cè)序

通過(guò)顯微操作挑取的腫瘤單細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)凝膠電泳確認(rèn)單細(xì)胞擴(kuò)增成功。由于非小細(xì)胞肺癌中負(fù)責(zé)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的表皮生長(zhǎng)因子受體發(fā)生突變導(dǎo)致其表達(dá)量升高，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，而針對(duì)突變的患者使用酪氨酸激酶抑制劑藥物有著很好的效果，因此對(duì)其進(jìn)行針對(duì)基因的Sanger測(cè)序可以判定其靶向治療有效性，有著重大的臨床意義[22~24]。結(jié)果顯示：患者P2單細(xì)胞測(cè)序?yàn)?19Del (圖3A)，存在一個(gè)野生型(圖3B)，患者P1的腫瘤單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果為-L858R突變(圖3，C和D)，患者P3和P5為-19Del，患者P4為-L858R突變，5名患者惡性胸腔積液中高代謝活性腫瘤單細(xì)胞Sanger測(cè)序結(jié)果與臨床醫(yī)生提供的患者突變信息吻合。同時(shí)，在同一個(gè)患者的單細(xì)胞樣本中，用CD45?/2- NBDG+為標(biāo)準(zhǔn)篩選的高代謝活性腫瘤細(xì)胞，有一定比例的野生型，2號(hào)患者有1個(gè)單細(xì)胞是野生型，提示利用高代謝活性的標(biāo)準(zhǔn)篩選出的腫瘤細(xì)胞可能有著不存在驅(qū)動(dòng)基因突變的亞群；P1、P3、，P4和P5號(hào)患者所有高代謝活性腫瘤單細(xì)胞均帶有點(diǎn)突變。

2.4 高代謝活性腫瘤單細(xì)胞基因組拷貝數(shù)變異分析

對(duì)于通過(guò)22條染色體檢測(cè)的單細(xì)胞樣本(圖4A)，認(rèn)為其全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物覆蓋度較好適合進(jìn)行后續(xù)拷貝數(shù)變異分析。腫瘤細(xì)胞的基因組極不穩(wěn)定，容易發(fā)生基因組重排[25]，且重排基因組的大小都在1 kb以上，亞顯微結(jié)構(gòu)上體現(xiàn)出擴(kuò)增[26]或者缺失[27]的現(xiàn)象?；趯?shí)驗(yàn)室對(duì)單細(xì)胞建立的染色體拷貝數(shù)變異(copy number variants, CNV)分析路線，對(duì)每個(gè)患者的所有高代謝活性的腫瘤細(xì)胞都進(jìn)行了CNV分析。結(jié)果表明，P2、P3和P5患者都是-19Del突變類(lèi)型，但3者的CNV變異情況存在很大差異(圖4，B~D)。P3患者的5個(gè)腫瘤細(xì)胞均存在驅(qū)動(dòng)基因突變但是在基因組水平上沒(méi)有大范圍的變異情況可能屬于早期轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，P2患者腫瘤細(xì)胞可細(xì)分為2個(gè)亞群，可能代表了轉(zhuǎn)移能力不同的兩個(gè)群體，P5患者存在較好的一致性，但其基因組變異譜與P2和P3均不同；P1患者的10個(gè)單細(xì)胞基因組拷貝數(shù)變異一致性好，大部分染色體都發(fā)生了擴(kuò)增或者缺失，認(rèn)為此類(lèi)腫瘤細(xì)胞的突變比較多，惡性程度比較高(圖4E)；P4患者在驅(qū)動(dòng)基因突變檢測(cè)上有很好的一致性，但是從CNV水平看每個(gè)單細(xì)胞的拷貝數(shù)變異都有較大的異質(zhì)性(圖4F)。

3 討論

腫瘤異質(zhì)性是目前腫瘤治療面臨的最大難題，同一癌種在不同患者之間存在基因或表型的差異，且在一個(gè)患者腫瘤不同區(qū)域也存在分子層面的顯著差異[28]。有研究表明，患者體內(nèi)實(shí)體瘤本身就是由含有不同基因或表型特征的亞克隆細(xì)胞群體組成[29]，它們?cè)谠鲋乘俣?、侵襲轉(zhuǎn)移能力等方面都具有顯著差異，當(dāng)所處微環(huán)境[30,31]發(fā)生改變時(shí)，一部分不能適應(yīng)的腫瘤細(xì)胞失巢凋亡[32]，而另一部分則存活下來(lái)，更有一部分潛在轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞在外界不利因子的壓力下，突破屏障進(jìn)入到循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。自腫瘤異質(zhì)性首次被提出之后，越來(lái)越多的臨床醫(yī)生開(kāi)始關(guān)注腫瘤異質(zhì)性與患者的治療方案之間的關(guān)系。臨床上對(duì)突變的晚期肺癌患者使用靶向藥物可以殺死突變腫瘤細(xì)胞，但是通?；颊邥?huì)在幾個(gè)月內(nèi)表現(xiàn)出藥物抵抗性，需不斷更換治療方案以延長(zhǎng)其生存期，藥物等外界環(huán)境刺激還可能會(huì)誘導(dǎo)體內(nèi)部分轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞從原位脫落實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。因此深入解析腫瘤異質(zhì)性是解釋腫瘤耐藥、侵襲和轉(zhuǎn)移機(jī)制的關(guān)鍵。

圖3 肺癌患者惡性胸腔積液中高代謝活性腫瘤細(xì)胞Sanger測(cè)序結(jié)果

A：2號(hào)患者2-NBDG高攝取的單細(xì)胞，Sanger測(cè)序?yàn)榛?9Del；B：2號(hào)患者2-NBDG高攝取的單細(xì)胞，Sanger測(cè)序?yàn)橐吧?；C，D：為1號(hào)患者2-NBDG高攝取的兩個(gè)不同單細(xì)胞，Sanger測(cè)序均為基因21號(hào)外顯子L858R點(diǎn)突變。

圖4 單細(xì)胞全基因組質(zhì)控及染色體拷貝數(shù)變異分析

A：?jiǎn)渭?xì)胞全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量評(píng)估。泳道1：DNA marker；泳道2~23：分別表示22條染色體上特定基因片段的擴(kuò)增產(chǎn)物；B：2號(hào)患者CNV結(jié)果，其突變類(lèi)型為19Del；C：3號(hào)患者CNV結(jié)果，其突變類(lèi)型為19Del；D：5號(hào)患者CNV結(jié)果，其突變類(lèi)型為19Del；E：1號(hào)患者CNV結(jié)果，其突變類(lèi)型為L(zhǎng)858R；F：4號(hào)患者CNV結(jié)果，其突變類(lèi)型為L(zhǎng)858R。每一橫排為一個(gè)單細(xì)胞的22對(duì)常染色體及一對(duì)性染色體拷貝數(shù)變異情況，每條染色體的綠色標(biāo)注為正常的2倍體，紅色標(biāo)注為染色體拷貝數(shù)發(fā)生擴(kuò)增，藍(lán)色標(biāo)注為染色體拷貝數(shù)發(fā)生缺失。

葡萄糖高攝取的腫瘤細(xì)胞代表了惡性胸腔積液中高代謝活性的細(xì)胞亞群[33]，這部分細(xì)胞通過(guò)大量糖酵解方式獲取能量[34,35]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究認(rèn)為它們是具有高轉(zhuǎn)移潛能的細(xì)胞亞群，因此本研究以肺癌患者惡性胸腔積液中的高代謝活性細(xì)胞為研究對(duì)象對(duì)深入解析腫瘤異質(zhì)性及轉(zhuǎn)移機(jī)制有著重要意義。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：突變類(lèi)型均為-L858R的患者(P1和P4)，同一個(gè)患者多個(gè)高代謝活性腫瘤細(xì)胞的拷貝數(shù)變異存在高度一致性，但是患者之間基因組水平上的拷貝數(shù)變異存在極大的差異，P1患者在染色體拷貝數(shù)擴(kuò)增現(xiàn)象多于缺失，而P4患者的擴(kuò)增和缺失現(xiàn)象都非常明顯；同樣突變類(lèi)型均為-19Del的患者(P2、P3和P5)，同一個(gè)患者的多個(gè)高代謝活性腫瘤細(xì)胞的拷貝數(shù)變異存在差異，可細(xì)分為若干亞群，患者之間的CNV變異類(lèi)型也完全不一樣，由此推測(cè)這樣的差異可能是導(dǎo)致患者出現(xiàn)的不同轉(zhuǎn)移和耐藥情況的原因。針對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞之前的研究主要有兩種觀點(diǎn)，其一是這種差異來(lái)自于原位灶本來(lái)就不同的細(xì)胞亞克隆[36]，另一種觀點(diǎn)認(rèn)為是具有高度干性的腫瘤細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)移之后再形成的不同分子特點(diǎn)[37,38]。從同一個(gè)患者(P2和P5)的多個(gè)腫瘤細(xì)胞CNV結(jié)果看，可細(xì)分成不同的細(xì)胞亞群，雖然其突變類(lèi)型一致，但是其基因組上明顯的分群現(xiàn)象可能與腫瘤后期進(jìn)展相關(guān)。惡性胸腔積液中高代謝活性腫瘤細(xì)胞應(yīng)該同時(shí)具備這兩種情況。本研究認(rèn)為一些早期轉(zhuǎn)移的患者(P3)其基因組水平變異是比較平的，顯著區(qū)別于P1和P4高度變異的情況，這對(duì)于臨床醫(yī)生針對(duì)性治療和最大程度使患者獲益有極大的幫助。

綜上所述，本研究建立了一整套針對(duì)肺癌患者惡性胸腔積液中轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞分析方案。利用代謝標(biāo)志物分選高代謝活性腫瘤細(xì)胞避免了胸腔積液中其他雜細(xì)胞的遺傳信息干擾，從單細(xì)胞角度解析了同一患者多個(gè)轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞在基因組水平上的一致性，而相同驅(qū)動(dòng)基因的患者之間存在顯著差異，認(rèn)為其差異可能導(dǎo)致患者在轉(zhuǎn)移和耐藥方面存在差異；而同一患者不同的細(xì)胞亞群可能是早期轉(zhuǎn)移患者仍然存在潛在過(guò)渡態(tài)細(xì)胞群體。本文對(duì)于腫瘤異質(zhì)性的研究尤其是對(duì)轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性研究將有望對(duì)肺癌患者臨床治療，耐藥監(jiān)測(cè)和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供更精確的生物學(xué)信息。

[1] Yu HX, Han ZG, Wang Y, Xin H. The clonal evolution and therapeutic approaches of lung cancer., 2014, 70(1): 63–71.

[2] Aparicio S, Mardis E. Tumor heterogeneity: next-generation sequencing enhances the view from the pathologist’s microscope., 2014, 15(9): 463.

[3] Swanton C. Intratumor Heterogeneity: evolution through Space and Time., 2012, 72(19): 4875–4882.

[4] Wang LW, Wang L, Li N. Clinical cancer genomics and personalized treatment., 2010, 15(6): 481–486.王理偉, 王雷, 李寧. 臨床腫瘤基因組學(xué)與腫瘤個(gè)體化治療. 臨床腫瘤學(xué)雜志, 2010, 15(6): 481–486.

[5] Peng QP, Liang HJ. Specific phenotype for glycolysis in malignant tumor cells and its significance.l, 2009, 14(5): 470–473.彭秋平, 梁后杰. 糖酵解代謝在惡性腫瘤細(xì)胞中的特異性表型及其意義. 臨床腫瘤學(xué)雜志, 2009, 14(5): 470– 473.

[6] Khoo BL, Grenci G, Lin YB, Lee SC, Han J, Lim CT. Expansion of patient-derived circulating tumor cells from liquid biopsies using a CTC microfluidic culture device., 2018, 13(1): 34–58

[7] Gerlinger M, Rowan A, Horswell S, Math M, Larkin J, Endesfelder D, Gronroos E, Martinez P, Matthews N, Stewart A, Tarpey P, Varela I, Phillimore B, Begum S, McDonald NQ, Butler A, Jones D, Raine K, Latimer C, Santos CR, Nohadani M, Eklund AC, Spencer-Dene B, Clark G, Pickering L, Stamp G, Gore M, Szallasi Z, Downward J, Futreal PA, Swanton C. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing., 2012, 366(10): 883–892.

[8] Xu X, Hou Y, Yin XY, Bao L, Tang AF, Song LT, Li FQ, Tsang S, Wu K, Wu HJ, He WM, Zeng L, Xing MJ, Wu RH, Jiang H, Liu X, Cao DD, Guo GW, Hu XD, Gui YT, Li ZS, Xie WY, Sun XJ, Shi M, Cai ZM, Wang B, Zhong MM, Li JX, Lu ZH, Gu N, Zhang XQ, Goodman L, Bolund L, Wang J, Yang HM, Kristiansen K, Dean M, Li YR, Wang J. Single-cell exome sequencing reveals single-nucleotide mutation characteristics of a kidney tumor., 2012, 148(5): 886–895.

[9] Hou Y, Song LT, Zhu P, Zhang B, Tao Y, Xu X, Li FQ, Wu K, Liang J, Shao D, Wu HJ, Ye XF, Ye C, Wu RH, Jian M, Chen Y, Xie W, Zhang RR, Chen L, Liu X, Yao XT, Zheng HC, Yu C, Li QB, Gong ZL, Mao M, Yang X, Yang L, Li JX, Wang W, Lu ZH, Gu N, Wang J. Single-Cell exome sequencing and monoclonal evolution of a-Negative myeloproliferative neoplasm., 2012, 148(5): 873– 885.

[10] Navin N, Kendall J, Troge J, Andrews P, Rodgers L, McIndoo J, Cook K, Stepansky A, Levy D, Esposito D, Muthuswamy L, Krasnitz A, McCombie WR, Hicks J, Wigler M. Tumour evolution inferred by single-cell sequencing., 2011, 472(7341): 90–94.

[11] Valastyan S, Weinberg RA. Tumor metastasis: molecular insights and evolving paradigms., 2011, 147(2): 275– 292.

[12] Yang YL, Chu JY, Wang MR. Tumor genetic heterogeneity.,2013, 35(1): 1–9.楊壹羚, 褚嘉祐,王明榮. 腫瘤遺傳異質(zhì)性. 遺傳, 2013, 35(1): 1–9.

[13] Fenton KN, Richardson JD. Diagnosis and management of malignant pleural effusions., 1995, 170(1): 69–74.

[14] Roberts ME, Neville E, Berrisford RG, Antunes G, Ali NJ, BTS Pleural Disease Guideline Group. Management of a malignant pleural effusion: British thoracic society pleural disease guideline 2010., 2010, 65 (Suppl. 2): ii32– ii40.

[15] Tang Y, Wang Z, Li ZM, Kim J, Deng YL, Li Y, Heath JR, Wei W, Lu S, Shi QH. High-throughput screening of rare metabolically active tumor cells in pleural effusion and peripheral blood of lung cancer patients., 2017, 114 (10): 2544–2549.

[16] Sun S, Deng YL. Single-cell detection of EGFR gene mutation in circulating tumor cells in lung cancer., 2015, 37(12): 1251–1257.

孫帥, 鄧宇亮. 肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞的單細(xì)胞EGFR基因突變檢測(cè). 遺傳, 2015, 37(12): 1251–1257.

[17] Cai X, Evrony GD, Lehmann HS, Elhosary PC, Mehta BK, Poduri A, Walsh CA. Single-Cell, Genome-wide sequencing identifies clonal somatic Copy-Number variation in the human brain., 2015, 10(4): 645.

[18] Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for illumina sequence data., 2014, 30(15): 2114–2120.

[19] Li H, Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform., 2009, 25(14): 1754–1760.

[20] Li H, Handsaker B, Wysoker A, Fennell T, Ruan J, Homer N, Marth G, Abecasis G, Durbin R. The sequence alignment/ map format and samtools., 2009, 25(16): 2078–2079.

[21] Venkatraman ES, Olshen AB. A faster circular binary segmentation algorithm for the analysis of array CGH data., 2007, 23(6): 657–663.

[22] Maemondo M, Inoue A, Kobayashi K, Sugawara S, Oizumi S, Isobe H, Gemma A, Harada M, Yoshizawa H, Kinoshita I, Fujita Y, Okinaga S, Hirano H, Yoshimori K, Harada T, Ogura T, Ando M, Miyazawa H, Tanaka T, Saijo Y, Hagiwara K, Morita S, Nukiwa T. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR., 2010, 362(25): 2380–2388.

[23] Cappuzzo F, Hirsch FR, Rossi E, Bartolini S, Ceresoli GL, Bemis L, Haney J, Witta S, Danenberg K, Domenichini I, Ludovini V, Magrini E, Gregorc V, Doglioni C, Sidoni A, Tonato M, Franklin WA, Crino L, Bunn PA, Varella-Garcia M. Epidermal growth factor receptor gene and protein and gefitinib sensitivity in non-small-cell lung cancer., 2005, 97(9): 643–655.

[24] Asahina H, Yamazaki K, Kinoshita I, Sukoh N, Harada M, Yokouchi H, Ishida T, Ogura S, Kojima T, Okamoto Y, Fujita Y, Dosaka-Akita H, Isobe H, Nishimura M. A phase II trial of gefitinib as first-line therapy for advanced non-small cell lung cancer with epidermal growth factor receptor mutations., 2006, 95(8): 998–1004.

[25] Stankiewicz P, Lupski JR. Genome architecture, rearrangements and genomic disorders., 2002, 18(2): 74–82.

[26] Litt M, Luty JA. A hypervariable microsatellite revealed byamplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene., 1989, 44(3): 397–401.

[27] Saxonov S, Berg P, Brutlag DL. A genome-wide analysis of CpG dinucleotides in the human genome distinguishes two distinct classes of promoters., 2006, 103(5): 1412–1417.

[28] Wang DC, Wang W, Zhu B, Wang X. Lung cancer heterogeneity and new strategies for drug therapy., 2017, 58: 531–546.

[29] Greaves M, Maley CC. Clonal evolution in cancer., 2012, 481(7381): 306–313.

[30] He YL, Ying Y, Xu YL, Su JF, Luo H, Wang HF. Effects of Lycium barbarum polysaccharide on tumor microenvironment T-lymphocyte subsets and dendritic cells in H22-bearing mice., 2005, 3(5): 374–377.

何彥麗, 應(yīng)逸, 許艷麗, 蘇俊芳, 羅惠, 王惠峰. 枸杞多糖對(duì)荷瘤小鼠腫瘤微環(huán)境T淋巴細(xì)胞亞群及樹(shù)突狀細(xì)胞的影響. 中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報(bào), 2005, 3(5): 374–377.

[31] Liotta LA, Kohn EC. The microenvironment of the tumour-host interface., 2001, 411(6835): 375–379.

[32] Douma S, van Laar T, Zevenhoven J, Meuwissen R, van Garderen E, Peeper DS. Suppression of anoikis and induction of metastasis by the neurotrophic receptor TrkB., 2004, 430(7003): 1034–1039.

[33] Pantel K, Alix-panabières C. Functional studies on viable circulating tumor cells., 2015, 62(2): 328–334.

[34] Vaupel P, Kallinowski F, Okunieff P. Blood flow, oxygen and nutrient supply, and metabolic microenvironment of human tumors: a review., 1989, 49(23): 6449– 6465.

[35] Kalmus J, Okunieff P, Vaupel P. Effect of intraperitoneal versus intravenous glucose administration on laser Doppler flow in murine FSaII tumors and normal skin., 1989, 49(22): 6313–6317.

[36] Shackleton M, Quintana E, Fearon ER, Morrison SJ. Heterogeneity in cancer: cancer stem cells versus clonal evolution., 2009, 138(5): 822–829.

[37] Singh SK, Clarke ID, Terasaki M, Bonn VE, Hawkins C, Squire J, Dirks PB. Identification of a cancer stem cell in human brain tumors., 2003, 63(18): 5821– 5828.

[38] Heidt DG, Li C, Dalerba P, Burant CF, Zhang L, Adsay V, Wicha M, Clarke MF, Simeone DM. Identification of pancreatic cancer stem cells., 2007, 67(3): 1030–1037.

Identification and single-cell sequencing analysis of rare tumor cells in malignant pleural effusion of lung cancer patients

Baojun Wu, Zhuo Wang, Yu Dong, Yuliang Deng, Qihui Shi

Tumor heterogeneity refers to distinct genomic or phenotypic characteristics of tumor cells. Under the environmental or drug stress, tumor cells exhibit different responses, corresponding to different properties of cell proliferation, invasion, metastasis and drug resistance. In particular, a small fraction of tumor cells are capable of detaching from primary tumor sites and initiating distant metastases. Thus, tumor heterogeneity sets the basis for tumor resistance and metastasis. Traditional methods in studying tumor heterogeneity are mainly based on bulk cells from different locations in primary tumors, lacking analysis at the single-cell level and of metastatic tumor cells. This study establishes a single-cell method to study metastatic tumor cells in malignant pleural effusions of lung cancer patients. Metabolically active tumor cells in malignant pleural effusions are firstly identified with a metabolic marker 2-NBDG, a fluorescent glucose analog. These metabolically active tumor cells are confirmed to harbor the same driver oncogenic mutations by Sanger sequencing, followed by high-throughput sequencing to analyze copy number variation profiles. Our results show metastatic tumor cells in pleural effusion have the same driver mutations but different features in copy number variation patterns. The study provides new insights to understand the mechanism of tumor metastasis.

lung cancer; pleural effusion; tumor cells; single-cell sequencing

2018-10-31;

2018-12-27

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：21775103, 81501613)和上海交通大學(xué)“醫(yī)工交叉基金”項(xiàng)目(編號(hào)：YG2017QN54)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 21775103, 81501613) and Medical Engineering Cross Research Fund of Shanghai Jiao Tong University(No. YG2017QN54)]

吳保軍，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向：循環(huán)腫瘤細(xì)胞單細(xì)胞測(cè)序。E-mail: wbaojun@sjtu.edu.cn

施奇惠，教授，研究方向：液體活檢與單細(xì)胞測(cè)序。E-mail: qihuishi@sjtu.edu.cn

10.16288/j.yczz.18-230

2019/1/14 13:15:26

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190114.1315.008.html

(責(zé)任編委: 周鋼橋)