克里米亞-剛果出血熱病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用

任南潔，趙路，袁志明，夏菡

中國(guó)科學(xué)院 武漢病毒研究所，湖北 武漢430071

CCHFV的基因組結(jié)構(gòu)和其他布尼亞病毒類似，由3節(jié)段負(fù)鏈RNA組成，分別是小片段（S）、中片段（M）、大片段（L），它們分別編碼病毒的核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，NP）、糖蛋白前體（glycoprotein precursor，GPC）和病毒RNA 依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）[5]。每個(gè)基因組片段中都包含1個(gè)開(kāi)放讀框（open reading frame，ORF），ORF的兩端為非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）。其中，L片段的基因組最大（～12 kb），遠(yuǎn)大于布尼亞病毒目中其他病毒的L片段，其編碼的RdRp 由4000 多個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為450×103。除RdRp的活性外，L片段編碼的蛋白還含有1個(gè)OTU（ovarian tumor，卵巢腫瘤）結(jié)構(gòu)域，可能與病毒逃逸宿主的先天免疫有關(guān)。M片段約為5.4 kb，其轉(zhuǎn)錄翻譯首先合成糖蛋白前體，然后在宿主來(lái)源的多種蛋白酶的作用下，剪切加工為病毒包膜上的糖蛋白GN和GC，以及非結(jié)構(gòu)蛋白mucin、GP38、NSM的前體[6]。GN和GC含有中和抗原決定簇，在病毒吸附和侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程中起重要作用，能誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生[7]，而具有這種免疫原性的M片段的快速突變和頻繁重排已有報(bào)道[8]。S片段大小為1.6 kb，編碼NP 蛋白和1個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（nonstructural proteins，NSs），NP 蛋白可以將病毒RNA和cDNA 包裝為核糖核蛋白顆粒（ribo?nucleoprotein particles，RNPs），并與病毒mRNA的5'UTR 以高親和力結(jié)合，然后促進(jìn)mRNA 翻譯[9]。

CCHFV基因組的S、M和L片段ORF 兩端的UTRs 足以用于病毒小基因組RNA的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和包裝[10]。UTRs 由可變區(qū)和高度保守的末端區(qū)域組成，末端保守的核苷酸能互補(bǔ)形成非共價(jià)閉合的二級(jí)結(jié)構(gòu)，與病毒聚合酶進(jìn)行相互作用。

反向遺傳學(xué)技術(shù)是以生物基因?yàn)橹饕芯繉?duì)象，基于對(duì)基因核苷酸序列的人為操作，探索基因調(diào)控的分子機(jī)制以及生命發(fā)生發(fā)展的本質(zhì)現(xiàn)象和規(guī)律等[11]。反向遺傳學(xué)系統(tǒng)可使我們?cè)O(shè)計(jì)病毒個(gè)別基因的特定突變，從而研究各個(gè)基因在病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、裝配和致病方面的具體功能。目前對(duì)于CCHFV 還有很多問(wèn)題待厘清，CCHFV的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)能極大地便于研究該病毒的復(fù)制循環(huán)、包裝釋放、宿主免疫入侵、病毒與宿主的相互作用機(jī)制等問(wèn)題。RNA病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)需要在cDNA 水平上操作基因，將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，拯救出具有感染性的活的子代病毒（野生型或突變型）[12]。但是，負(fù)鏈RNA病毒的基因組RNA在宿主細(xì)胞體內(nèi)不能啟動(dòng)感染循環(huán)，只有病毒的基因組RNA與NP、磷酸化蛋白以及RdRp共同形成功能性的RNP 之后，才具有感染性，因此負(fù)鏈RNA病毒反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的建立十分復(fù)雜困難[11]。而CCHFV 由于其編碼RdRp的L片段遠(yuǎn)大于其他布尼亞病毒，故其反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的構(gòu)建難度極大，自2003年成功構(gòu)建CCHFV 小基因組系統(tǒng)開(kāi)始，經(jīng)過(guò)10 多年的發(fā)展，直到2015年才構(gòu)建出CCHFV的全病毒拯救系統(tǒng)。

本文綜述了CCHFV 反向遺傳學(xué)的研發(fā)歷史及現(xiàn)狀，并簡(jiǎn)介了CCHFV 反向遺傳系統(tǒng)在病毒功能基因、藥物篩選和疫苗研制中的應(yīng)用。

1 CCHFV 反向遺傳系統(tǒng)研究進(jìn)展

1.1 CCHFV 小基因組系統(tǒng)的建立

2003年，F(xiàn)lick等建立了CCHFV的小基因組（minigenome）系統(tǒng)。他們利用人和鼠的RNA 聚合酶Ⅰ（polⅠ）的啟動(dòng)子構(gòu)建了帶有人工病毒RNA基因組片段的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，基因組片段又包含了病毒RNA 或其互補(bǔ)正義鏈、報(bào)告基因[綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（chloramphenicol acetyltransferase，CAT）]，以及病毒S片段的非編碼區(qū)（non-coding regions，NCRs）。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染不同的真核細(xì)胞后，可在細(xì)胞中觀察到報(bào)告基因的表達(dá)，并且在病毒傳代后，報(bào)告基因依然表達(dá)，證實(shí)了polⅠ系統(tǒng)可驅(qū)動(dòng)小基因組的包殼、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制，并且可將小基因組包裝為具有感染能力的子代病毒（圖1A）。該系統(tǒng)首次證明了polⅠ系統(tǒng)可用于布尼亞病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)建立，并且提供了研究CCHFV 生物學(xué)功能和預(yù)防治療措施的新途徑[13]。但是，由于這一系統(tǒng)依賴于CCHFV 輔助病毒，導(dǎo)致它的應(yīng)用依舊局限于高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室中，并且無(wú)法對(duì)病毒的L片段和S片段進(jìn)行更深入的研究。

2010年，Bergeron 等構(gòu)建了一個(gè)不依賴于CCHFV 輔助病毒的高效反向遺傳學(xué)系統(tǒng)。他們構(gòu)建了帶有T7 啟動(dòng)子的S、L片段ORFs的表達(dá)質(zhì)粒，和帶有GFP 或Gaussia 螢光素酶（Gluc）報(bào)告基因的小基因組，轉(zhuǎn)入可穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA 聚合酶的BSR-T7細(xì)胞，得到了具有復(fù)制能力，但不具有感染能力的病毒RNA（圖1B）[10]。這是正內(nèi)羅病毒家族成員中第一個(gè)不依賴于輔助病毒的小基因拯救系統(tǒng)，雖然該系統(tǒng)依然未能成功獲得具有感染能力的病毒，但是可以對(duì)CCHFV的L和S片段以及RNA 模板進(jìn)行基因修飾，進(jìn)而研究病毒的轉(zhuǎn)錄、復(fù)制和包裝機(jī)制。

2013年，趙九如等建立了一套不依賴輔助病毒，基于增強(qiáng)綠色熒光蛋白（enhanced GFP，EGFP）報(bào)告基因的CCHFV 小基因組拯救系統(tǒng)。他們將帶有S、L片段ORFs的輔助質(zhì)粒，和帶有S/M/L片段的UTRs 以及報(bào)告基因EGFP的小基因組共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，之后在熒光顯微鏡下觀察到了綠色熒光，證明該小基因組拯救成功（圖1B）[14]。

1.2 進(jìn)入和轉(zhuǎn)錄能力的病毒樣顆粒（transcriptionand entry-competent virus-like particle，tecVLP）

2015年，Bergeron 嘗試了CCHFV tecVLP系統(tǒng)的建立。病毒樣顆粒（virus-like particle，VLP）在形態(tài)學(xué)上與病毒相似，具有轉(zhuǎn)錄和進(jìn)入細(xì)胞的能力，但是不能表達(dá)病毒蛋白，所以只能模擬病毒單周期感染，無(wú)法產(chǎn)生感染性病毒，故可以在BSL-2 實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行研究。VLP 應(yīng)用廣泛，可用于抗病毒藥物篩選，檢測(cè)單克隆抗體效力，確定病毒重組的潛在分子決定因素，制作疫苗等。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 兩組患者均符合《中華外科雜志》編委會(huì)、中華醫(yī)學(xué)會(huì)外科分會(huì)肛腸外科學(xué)組2000年制定的《痔診治暫行標(biāo)準(zhǔn)》。

圖1 CCHFV小基因組系統(tǒng)

Bergeron 對(duì)傳統(tǒng)VLP 進(jìn)行了改進(jìn)，將CCHFV的NP 蛋白序列、密碼子優(yōu)化過(guò)的GPC 序列以及L蛋白序列分別連接在表達(dá)載體上，再加帶有噬菌體T7 聚合酶的表達(dá)載體，和帶有NanoLuc 螢光素酶（nanoluciferase）的小復(fù)制子，共5個(gè)質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，最終拯救出tecVLPs，并證明生成的tecVLPs與野生型CCHFV的形態(tài)一致，大小相對(duì)均勻（94±3 nm），可有效中和CCHFV 特異性單克隆抗體與藥物，并且證實(shí)了生成的tecVLPs能且只能感染細(xì)胞1 次（圖1C）[5]。這一tecVLP系統(tǒng)是一種安全、可靠、有效的分子研究方法，有助于在BSL-2 實(shí)驗(yàn)室中開(kāi)展CCHFV 高通量藥物篩選、抗體評(píng)估、感染分子機(jī)制等方面研究。

1.3 CCHFV 全病毒拯救系統(tǒng)的建立

在最初CCHFV 小基因組的拯救中，使用了輔助病毒進(jìn)行共感染或雙重感染，但是由于攜帶工程化基因組的病毒顆粒很難從輔助病毒中分離出來(lái)，因此建立反向遺傳學(xué)系統(tǒng)的最終目的是創(chuàng)建僅含質(zhì)?；騌NA、無(wú)需輔助病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)[12]。但由于CCHFV的L片段過(guò)大，轉(zhuǎn)染表達(dá)效率低，難以拯救，其全病毒拯救系統(tǒng)于2015年才陸續(xù)建立。

Bergeron 等首先于2015年嘗試了利用T7系統(tǒng)的小基因組來(lái)拯救野生型CCHFV，但發(fā)現(xiàn)僅將帶有T7 啟動(dòng)子的S、M、L片段的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞并不能拯救病毒，原因可能是過(guò)長(zhǎng)的L片段降低了重組RNPs的效率，或是L片段的mRNA在細(xì)胞核中發(fā)生異常剪接或提前終止。所以他們將L片段進(jìn)行了密碼子優(yōu)化來(lái)替代野生型，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測(cè)到了L片段復(fù)制的熒光信號(hào)，隨后通過(guò)調(diào)整各質(zhì)粒比例，獲得了具有感染性的重組CCHFV（圖2 右）。這一技術(shù)將有助于研究CCHFV的復(fù)制周期、發(fā)病機(jī)制和傳播[15]。

2017年，Stephen 等在Bergeron的基礎(chǔ)上，將S片段替換為ZsGreen1（ZsG）熒光蛋白基因，拯救出帶有報(bào)告基因的重組病毒（圖2 左上），可用于藥物篩選[16]。

2018年，夏菡等將NanoLuc基因與CCHFV M片段上的mucin 編碼框融合，拯救出可分泌表達(dá)NanoLuc 螢光素酶的重組病毒（圖2 左下）[17]。Na?noLuc 螢光素酶是目前性能最好的生物發(fā)光報(bào)告基因之一，其亮度比螢火蟲(chóng)螢光素酶（luciferase）高240倍，而大小僅為GFP的三分之二，可以最大限度地減少外源基因?qū)Σ《镜母蓴_[18]。

圖2 CCHFV全病毒拯救系統(tǒng)

2 CCHFV 反向遺傳系統(tǒng)的應(yīng)用

2.1 用于病毒基因功能的研究

CCHFV 異常巨大的L片段編碼的L 蛋白組成復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)其N端存在一些非經(jīng)典L 蛋白功能的結(jié)構(gòu)域，是在其他布尼亞病毒的基因組中未發(fā)現(xiàn)的。L 蛋白的第1～169 位氨基酸殘基已被證明足以去除泛素（Ub）和類泛素蛋白[10]，在正鏈和負(fù)鏈RNA病毒的研究中，都曾發(fā)現(xiàn)具有相似活性的病毒OTU 域，其表達(dá)的去泛素化酶可以水解病毒的多聚蛋白，是某些病毒復(fù)制所必需的。而B(niǎo)ergeron 等通過(guò)突變L 蛋白OTU 域的活性位點(diǎn)，構(gòu)建了L-OTU 蛋白酶失活的變體小基因組，將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞后并未發(fā)現(xiàn)突變體與野生型之間的差別，說(shuō)明病毒RdRp的活性不受OTU 蛋白酶活性的影響，OTU 蛋白酶的活性對(duì)病毒RNA的復(fù)制并不是必需的[19]。

2013年，趙九如等利用建立的重組CCHFV 拯救系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)L、M、S 兩端的UTRs在小基因組的表達(dá)中是必不可少的，并且L、M、S片段的UTRs活性水平呈逐漸降低的趨勢(shì)。經(jīng)系統(tǒng)分析，LUTRs 可以耐受某些核苷酸的突變，M-UTRs與其ORFs 具有相似的進(jìn)化樹(shù)結(jié)構(gòu)，S片段的5'UTRs與ORFs的進(jìn)化樹(shù)幾乎相同，而3'UTRs 則形成了新的分化群。這一系統(tǒng)為研究CCHFV 復(fù)制周期、致病機(jī)制和進(jìn)化模式提供了基礎(chǔ)[14]。

2.2 用于抗病毒藥物的篩選和鑒定

因?yàn)镃CHFV 屬于第一類病原微生物，缺乏可用于生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室的高通量藥物篩選系統(tǒng)，極大地限制了對(duì)其藥物的研發(fā)和評(píng)估，而CCHFV 小基因組系統(tǒng)的建立正好解決了這一問(wèn)題。

2010年，Bergeron利用他們構(gòu)建的基于T7啟動(dòng)子系統(tǒng)的CCHFV 小基因組系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)利巴韋林可以通過(guò)抑制細(xì)胞RNA 聚合酶的活性，來(lái)抑制小基因組報(bào)告基因蛋白的合成，從而抑制CCHFV的小基因組的復(fù)制，證明利巴韋林對(duì)CCHFV的作用是特異性的，也說(shuō)明該系統(tǒng)可以用于抗病毒藥物的篩選[10]。這種方法相對(duì)于使用活的CCHFV的主要優(yōu)點(diǎn)之一是不需要在高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行試驗(yàn)，極大地促進(jìn)了CCHFV 抗病毒藥物篩選的發(fā)展。但是，關(guān)于利巴韋林的效果在隨后的研究中也有較大爭(zhēng)議，有研究表明利巴韋林在感染早期使用有臨床效果[20]，但也有分析提示利巴韋林的療效較差且不穩(wěn)定[21-23]。

2017年，Stephen 等利用構(gòu)建的含報(bào)告基因的CCHFV/ZsG，建立了一種高通量篩選CCHFV 抗病毒藥物的方法。該方法通過(guò)檢測(cè)受感染細(xì)胞的熒光減少量來(lái)量化抗病毒化合物的病毒抑制效果。之后，他們發(fā)現(xiàn)2'-脫氧-2'-氟胞苷的抗病毒效果是利巴韋林的200倍，且與法匹拉韋（favipi?ravir）有協(xié)同作用，可以抑制CCHFV的復(fù)制而不引起細(xì)胞毒性[16]。這一發(fā)現(xiàn)不僅建立了利用報(bào)告病毒來(lái)高通量篩選抗病毒藥物的方法，可以更快速地確定有效治療方案，而且也可以用于CCHFV生命周期的研究。

2018年，夏菡等利用拯救出的可分泌表達(dá)NanoLuc 螢光素酶的重組病毒，對(duì)比了弗林蛋白酶抑制劑與利巴韋林的抗病毒效果，發(fā)現(xiàn)弗林蛋白酶抑制劑的效果差于利巴韋林，不適合作為CCHFV的抗病毒候選藥物繼續(xù)進(jìn)行深入評(píng)估，但也證實(shí)該系統(tǒng)可用于抗病毒藥物的體外快速初篩，為抗CCHFV 藥物研發(fā)提供了技術(shù)支持[17]。

后2種系統(tǒng)均使用了帶有報(bào)告基因的重組病毒，仍然需要在高等級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室中操作，所以這也制約了其使用范圍。

2.3 用于疫苗候選株的研究

目前，CCHFV 還沒(méi)有獲準(zhǔn)使用的有效的預(yù)防疫苗，其惟一的疫苗是一種滅活病毒制劑，但由于其安全性問(wèn)題，僅在保加利亞投入使用，并未在其他高危人群國(guó)家中獲準(zhǔn)使用[24-25]。

由于M片段編碼的GPC 蛋白已被證明其產(chǎn)生的免疫反應(yīng)對(duì)小鼠有重要的保護(hù)作用[26]，所以疫苗研發(fā)大多圍繞GPC 蛋白展開(kāi)。2017年，Aura等構(gòu)建了編碼M片段糖蛋白前體基因的DNA 疫苗結(jié)構(gòu)，并對(duì)其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化。隨后，他們利用之前構(gòu)建的CCHFV的VLP比較和量化了優(yōu)化后的DNA 疫苗在2個(gè)具有相同遺傳背景的小鼠模型實(shí)驗(yàn)中的體液反應(yīng)和保護(hù)效果，發(fā)現(xiàn)密碼子優(yōu)化過(guò)的M片段DNA 疫苗具有較高的免疫原性，且可以在2種小鼠模型中都產(chǎn)生CCHFV 特異性的免疫反應(yīng)及中和性抗體。雖然具體保護(hù)機(jī)制尚不清楚，且該疫苗是否能對(duì)基因距離較遠(yuǎn)的CCHFV 毒株提供交叉保護(hù)性免疫仍有待觀察，但該研究為進(jìn)一步了解CCHFV DNA 疫苗的保護(hù)能力提供了依據(jù)，并將有助于開(kāi)發(fā)更加有效的CCHFV 疫苗[27]。

3 結(jié)語(yǔ)

反向遺傳學(xué)作為一門(mén)新興的分子生物學(xué)研究方法和技術(shù)，極大地推動(dòng)了病毒學(xué)研究的發(fā)展，以往經(jīng)典遺傳學(xué)無(wú)法解決的問(wèn)題，借助反向遺傳學(xué)這一技術(shù)平臺(tái)都可以被較好地揭示[28]。而CCHFV 作為第一類病原微生物，其反向遺傳學(xué)的研究受實(shí)驗(yàn)條件的限制而發(fā)展緩慢，歷經(jīng)10 余年才終于完成全病毒的拯救。該系統(tǒng)不僅為CCH?FV 分子生物領(lǐng)域的研究提供了良好的工具，便于開(kāi)展基因功能以及病毒致病機(jī)制等方面的研究，而且在抗病毒藥物篩選和新型疫苗開(kāi)發(fā)等實(shí)際應(yīng)用方面都具有極大的價(jià)值。但是，目前關(guān)于CCHFV 反向遺傳學(xué)仍有許多問(wèn)題，如某些病毒蛋白的重要功能、病毒毒力的決定性遺傳因素、病毒基因組UTR 區(qū)域?qū)Σ《緩?fù)制轉(zhuǎn)錄的影響機(jī)制、合理且可用于臨床的疫苗，以及疫苗實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立等，這些問(wèn)題仍需要進(jìn)一步探討來(lái)給予合理解釋。