環(huán)狀RNA在胃癌中的研究進展

曹博，丁麗華，衛(wèi)勃

1.解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 普通外科，北京100853；2.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 生物工程研究所，北京100850

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居世界第四，腫瘤相關死亡率位居世界第五[1]。我國是胃癌的“重災區(qū)”，發(fā)病率、死亡率居高不下[2]。由于我國醫(yī)療資源分布不均衡，胃癌早期篩查普及率低，多數(shù)患者就診時已處于進展期，手術治療難以實現(xiàn)根治，轉(zhuǎn)移率高，預后差。特別是由于飲食結構改變及社會壓力增加，近年來胃癌發(fā)病呈現(xiàn)出年輕化的傾向，并且青年患者腫瘤具有侵襲性強、體積大、分化程度低等惡性生物學特點[3]。胃癌作為具有鮮明地域特色的惡性腫瘤，給患者帶來極大的精神和身體負擔，嚴重制約我國經(jīng)濟和社會發(fā)展。因此，挖掘具有高度臨床價值的早期診斷標志物、預后判斷參考值和個體化治療靶點迫在眉睫。

環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是非編碼RNA 家族的重要成員。與傳統(tǒng)線性RNA的5'、3'端結構不同，circRNA 呈現(xiàn)連續(xù)的共價閉合環(huán)狀。1976年，Kolakofsky 首次在植物病毒內(nèi)探測到circRNA[4]，1979年Hsu 等在真核細胞中也發(fā)現(xiàn)了circRNA[5]，其后相當長的時間，circRNA 一直被認為是基因表達的“噪音”，不具備生理功能[6-7]。隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，circRNA的調(diào)控能力被逐漸揭示，對其產(chǎn)生機制的探索也有長足進步。Jeck 等利用高通量測序、生物信息學分析等技術，提出了circRNA 產(chǎn)生的2種方式，即套索驅(qū)動的環(huán)化模型和內(nèi)含子配對驅(qū)動的環(huán)化模型[8]。這一報道為剖析circRNA的來源與功能研究奠定了堅實的基礎。研究證明，多系統(tǒng)疾病的發(fā)生和進展與circRNA 異常表達密不可分[9-11]。胃癌與circRNA的關系研究作為新興的熱點，近年來出現(xiàn)“井噴式”增長，臨床轉(zhuǎn)化潛力不可估量。

1 circRNA 簡介

1.1 circRNA的生物學功能

circRNA的生物學調(diào)節(jié)功能可歸為4 類：作為“分子海綿”與microRNA（miRNA）互補結合，抑制其生物學功能[12-13]；與RNA 結合蛋白（RNA bind?ing protein，RBP）相互作用，影響RBP的相關信號通路[14]；在細胞核內(nèi)與RNA 聚合酶結合，順式調(diào)控親本基因轉(zhuǎn)錄[15]；作為模板直接編碼蛋白[16]。目前主要的研究熱點集中于circRNA的“分子海綿”吸附功能，極大地豐富了RNA 調(diào)控網(wǎng)絡。除單個circRNA的機制研究以外，基于生物信息技術的疾病circRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡也在如火如荼地構建中[17-19]，為后續(xù)關鍵性circRNA的篩選提供理論支撐。編碼功能的發(fā)現(xiàn)顛覆了科學界對于非編碼RNA的傳統(tǒng)認知。新近發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞系內(nèi)circFNDC3B 存在開放讀框，表達25kD的肽鏈[20]，這提示circRNA的生物學調(diào)節(jié)方式不僅局限于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)，大量未知功能有待探索。

1.2 circRNA的特點

circRNA的生物學特性如下：①穩(wěn)定性。反向拼接而成的連續(xù)、閉合環(huán)狀結構使circRNA 對RNA 核酸外切酶的降解不敏感[21]。circRNA 穩(wěn)定存在于多種極端環(huán)境，如尿液、胃液中，是臨床非侵襲性診斷方式的適宜標志物。②半衰期長。circRNA的半衰期通常大于48 h[6,8]，探測結果穩(wěn)定，具有參考性。③保守性。真核細胞circRNA具有高度保守的位點[22]，極大提升了穩(wěn)定干擾疾病相關circRNA表達水平的可行性。所以，憑借結構和功能的獨特優(yōu)勢，circRNA在胃癌的臨床診治中具有極大的潛力。

2 circRNA與胃癌診斷

circRNA在胃癌細胞和正常細胞內(nèi)的含量均相對較高，某些circRNA與線性RNA 亞型水平相當，甚至與其線性mRNA 相比可升高10倍以上。所以，circRNA在病理組織內(nèi)的表達差異具有可探測性，尤其是隨著微滴式數(shù)字PCR 等新式技術的出現(xiàn)，某些極端環(huán)境下的痕量circRNA 也能實現(xiàn)精準探測。性狀的穩(wěn)定性、表達的差異性、探測的可行性均賦予circRNA 高度的臨床診斷潛力。近年來，許多課題組對胃癌及癌旁組織的表達譜進行了比對分析，篩選出一批差異顯著的circRNA，如circ_101504、circ_0026 等[23-24]，為后續(xù)推動臨床診斷應用提供了理論依據(jù)。一項Meta分析匯總了11 項有關胃癌組織和血液circRNA的診斷研究，綜合曲線下面積（area under curve，AUC）達0.81，綜合靈敏度和特異度均大于0.7[25]，提示circRNA 具有出色的胃癌診斷轉(zhuǎn)化潛力。

2.1 胃癌組織的circRNA

大部分研究集中于胃癌組織內(nèi)circRNA表達水平的探測及其臨床診斷意義的解析，效能判斷仍然沿用經(jīng)典的靈敏度、特異度及AUC 比較。表達差異較大的circRNA 集中位于chr1、chr2、chr3、chr9和chr17[26]，提示此類染色體相關基因可能在胃癌的發(fā)生和進展中存在機制關聯(lián)。目前胃癌組織內(nèi)診斷價值最高的circRNA 為circ_0001017，其在胃癌組織內(nèi)的表達明顯下調(diào)。對于區(qū)分不典型增生和正常組織方面，circ_0001017的靈敏度和特異度可達79.4%和81.1%，AUC值為0.871[27]，是診斷癌前病變的潛在標志物，為胃癌的早期篩查提供了新的思路。Li 等[28]分析了circ_002059的診斷價值，在區(qū)分胃癌和正常組織方面，其靈敏度、特異度和AUC值分別為0.81、0.62和0.73。該團隊進一步探測了不同溫度對應不同儲存時間下circ_002059的水平，結果顯示無明顯差異，進一步佐證了circRNA的高度穩(wěn)定性，可作為理想的胃癌診斷標志物。此外，circ_0003159、circ_0000190 等也被證明是潛在的胃癌診斷靶點[29-30]。

除鑒別異常組織外，許多circRNA與胃癌患者的臨床病理特征具有顯著相關性，可協(xié)助臨床醫(yī)師正確判斷病情和制定治療方案。胃癌組織內(nèi)circ_0074362 低表達與淋巴結轉(zhuǎn)移存在關聯(lián)[31]，可為術中冰凍病理判斷患者淋巴結受累程度、確定下一步手術方案提供參考。Shao 等[26]發(fā)現(xiàn)circ_0014717與多種臨床病理特征顯著相關，包括腫瘤分期、遠處轉(zhuǎn)移、經(jīng)典腫瘤標志物表達水平等，提示circ_0014717 具有評估患者病情、提升經(jīng)典腫瘤標志物診斷效能的潛力。

2.2 血液circRNA

依靠血液腫瘤標志物診斷癌癥是研究熱點之一。采集血液樣本的方式溫和，屬于非侵襲性手段，患者接受度較高，適宜用于癌癥的早期診斷和術后病情監(jiān)測。目前臨床常見的血液腫瘤標志物包括CEA、CA19-9、CA12-5 等[32]，但是其種類冗雜，靈敏度和特異度均不理想，當各項指標變化趨勢不一致時，臨床醫(yī)師很難根據(jù)結果進行正確判讀，無法滿足胃癌早期診斷和病情檢測的臨床需求，故亟待探索新型腫瘤標志物。

circRNA 作為一種穩(wěn)定性高、半衰期長的明星分子，有望成為未來具有高度診斷價值的胃癌標志物。文獻表明，血液circRNA的臨床診斷價值高于經(jīng)典血液腫瘤標志物，甚至優(yōu)于同類組織circRNA。Sun 等[33]分析了circ_0000520在血液中的診斷價值。結果顯示，其靈敏度、特異度、AUC為0.8967、0.8235、0.8444，顯著高于CEA、CA19-9等標志物。Huang 等[34]報道血液circ_0000745 探測靈敏度達0.855，但特異度相對較差，這可能是由于circRNA在人體各組織內(nèi)廣泛表達，circRNA的高水平背景干擾了對于胃癌特異性circ_0000745的探測。構建circRNA 分子診斷組也是研究方向之一，Li 等[27]將組織和血液內(nèi)的circ_0001017和circ_0061276 作為診斷組，靈敏度、特異度高達0.955和0.957，明顯高于各自分子的診斷效能，有效彌補了單一circRNA的診斷劣勢。

2.3 胃液circRNA

由于其時空特異性，胃液成分分析在理論上具有非常高的臨床轉(zhuǎn)化價值，但極端pH值的外環(huán)境致使大部分腫瘤標志物無法穩(wěn)定存在，不具備充分探測條件。隨著新式分子生物學技術的發(fā)展，circRNA 憑借獨特的生物學性質(zhì)在胃液診斷中嶄露頭角。慢性萎縮性胃炎是癌前病變之一，由于其癥狀和病理的不典型，是臨床鑒別的難點。Shao 等[26]發(fā)現(xiàn)胃液circ_0014717在鑒別慢性萎縮性胃炎和胃潰瘍、正常組織方面具有顯著意義，這提示積極推進胃液circRNA的臨床診斷轉(zhuǎn)化有助于提高胃癌的早期診斷和預防干預。

3 circRNA與胃癌預后判斷

胃癌患者預后判斷是臨床診治的重要一環(huán)，對預測生存時間、規(guī)避過度醫(yī)療、緩解醫(yī)患糾紛意義重大。臨床采用的預后判斷方式主要是病理分期和患者生存質(zhì)量，無法實現(xiàn)精準預測。預后判斷效果主要依靠生存分析（Kaplan-Meier 法）進行評價，并利用單因素和多因素分析法剖析某項因素對生存期的影響。新近研究證明，多種circRNA 可作為胃癌患者的獨立預后因子，與患者生存時間具有密切聯(lián)系，如circ_100269、circ_0001017和circ_0061276[27,35]。Zhang 等[36]報道circ_101057表達水平對早期胃癌患者的預后具有顯著指示意義。高水平circ_101057的早期胃癌患者總生存期（overall survival，OS）更長，對奧沙利鉑和5-氟尿嘧啶的化療更敏感，顯示circRNA在胃癌患者生存預測和化療方案指導方面有重要作用。Chen 等[37]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測circPVT1和PVT1 mRNA的表達可提升單一標志物的預測效能。與胃癌診斷相同，circRNA 分子也是未來預后判斷的發(fā)展方向。但需要注意的是，盲目累加cir?cRNA 僅會提高臨床醫(yī)師的判斷難度，增加醫(yī)療成本。如何挑選具有高判讀價值的circRNA 并將其有機組合，也是轉(zhuǎn)化過程中的難點之一。

4 circRNA與胃癌治療

研究顯示，circRNA 是胃癌發(fā)生發(fā)展和命運轉(zhuǎn)歸的重要調(diào)節(jié)者，干擾circRNA在胃癌細胞中的表達，可有效抑制和逆轉(zhuǎn)各種惡性生物學行為，證明circRNA在胃癌治療中同樣具有出色的轉(zhuǎn)化潛力。目前的研究集中于circRNA 作為“分子海綿”吸附下游miRNA調(diào)控胃癌的機制拓展。

circNRIP1在胃癌細胞內(nèi)高表達，后續(xù)實驗發(fā)現(xiàn)circNRIP1/miR-149-5p/AKT1/mTOR 通路在胃癌的生長和侵襲中具有重要作用。文獻證明，AKT1/mTOR與胃癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epitheli?al-mesenchymal transition，EMT）、抗凋亡和多藥耐藥存在機制關聯(lián)[38]。敲低circNRIP1 可以在體內(nèi)、外水平抑制腫瘤的生長、增殖和轉(zhuǎn)移，是良好的臨床治療靶點[39-40]。FOXO3 是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，在多種腫瘤中扮演著抑癌因子的角色[41]。Lu 等證明circ_0001368 可以互補吸附miR-6506e5p，解除miR-6506e5p 對FOXO3的抑制作用，遏制胃癌細胞的惡性增殖和轉(zhuǎn)移能力[42]。除直接調(diào)控腫瘤細胞表型外，circRNA 也參與調(diào)控腫瘤性惡病質(zhì)。 ciRS-133 通過miR-133/PRDM16 通路促進胃癌患者白色脂肪向棕色脂肪轉(zhuǎn)化，提高患者代謝效率和氧耗量，最終導致惡病質(zhì)。相反，敲低ciRS-133 可以有效降低小鼠胃癌模型的氧耗量和產(chǎn)熱能力[43]。ciRS-133 抑制劑有望成為胃癌晚期患者治療的輔助用藥，延長患者生存期，改善生存質(zhì)量。

表1 胃癌circRNA作為microRNA“分子海綿”的機制總結

Liu 等[44]創(chuàng)新了以人造小分子干擾方式調(diào)節(jié)circRNA表達水平的思路。大量研究證明，miR-21 是胃癌惡性進展的參與者之一[45-47]。該團隊利用分子生物學手段構建了含有5個miR-21 吸附位點的人造circRNA（scRNA21）。具體方式如下：利用重疊PCR 擴增miR-21 互補結合位點，形成scRNA21的基本功能單位；擴增產(chǎn)物連接至含有T7 啟動子的環(huán)狀質(zhì)粒；單酶切質(zhì)粒，變?yōu)榫€性結構；利用T7 RNA 聚合酶大量擴增功能單位；磷酸酶去除5'端磷酸化；T4 多核苷酸激酶使RNA 分子具備穩(wěn)定連接能力；T4 連接酶使線性RNA 成環(huán)。scRNA21 通過抑制miR-21 降低細胞增殖，誘導細胞凋亡，Western 印跡顯示其下游抑癌蛋白DAXX表達上調(diào)，以上結果證明基于circRNA 結構的miR-21 抑制劑構建成功。人造circRNA 可以靈活調(diào)節(jié)miRNA抑制效率，精準性高，兼顧安全性和有效性，與RNA 干擾一同作為胃癌相關miRNA的干預方式，也是未來胃癌治療的發(fā)展方向之一。

5 結語

circRNA 具有穩(wěn)定性、特異性、保守性等優(yōu)勢，是近年基礎和臨床研究的明星分子之一，促進了胃癌早期診斷、病情監(jiān)測、預后判斷、個體化治療的發(fā)展步伐。尤其是胃液circRNA的發(fā)現(xiàn)和人造circRNA的構建，極大地拓展了胃癌診治的新思維。但是circRNA與胃癌的關系探索仍處于初級階段，尚無法達到臨床應用的基本要求。相信隨著生物探測技術的逐步優(yōu)化，胃癌發(fā)生發(fā)展和惡性轉(zhuǎn)歸的機制將逐漸闡明，circRNA 將成為胃癌臨床診治中的重要一環(huán)。