沙門菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測方法的建立

田賽，郭衛(wèi)光，包仁龍，向瑩，張浩然，楊超杰，謝靖，劉鴻博，宋宏彬，邱少富，杜昕穎

中國人民解放軍疾病預(yù)防控制中心，北京100071

沙門菌是一種革蘭陰性菌，屬腸桿菌科，是常見的食源性腸道致病菌[1]。食用受污染的生肉、家禽、蛋類、乳制品等可使人發(fā)生食物中毒，由致病性沙門菌引起的人類疾病通常被稱為沙門菌病[2]。沙門菌病對全球特別是發(fā)展中國家的公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅，在中國沙門菌病占食源性疾病的40%～60%[3]。因此，快速、準(zhǔn)確地檢測沙門菌對沙門菌病的有效防治是十分必要的。沙門菌鑒定的傳統(tǒng)方法主要根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征、抗原特征、噬菌體特征等。細(xì)菌培養(yǎng)是鑒定腸道致病菌的金標(biāo)準(zhǔn)，但這一過程耗時(shí)較長，需3～5 d[4-5]?；诳乖褪删w檢測法只能針對活細(xì)菌，敏感性較低，容易出現(xiàn)假陰性情況，特異性差[6]。與傳統(tǒng)方法相比，基于核酸特異性序列分子方法的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 具有快速、敏感、特異且穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。我們根據(jù)沙門菌特異的外膜孔蛋白F基因（ompF）[7]的特異性序列設(shè)計(jì)合成引物及TaqMan 探針，建立了可快速檢測沙門菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。

1 材料與方法

1.1 材料

甲型副傷寒沙門菌，乙型副傷寒沙門菌，丙型副傷寒沙門菌，豬霍亂沙門菌，鼠傷寒沙門菌，腸炎沙門菌，旺茲沃思沙門菌，亞利桑納沙門菌，湯卜遜沙門菌，痢疾志賀菌，弗氏志賀菌，宋內(nèi)志賀菌，鮑氏志賀菌，副溶血弧菌，霍亂弧菌，大腸埃希菌EAEC、EPEC、ETEC、STEC，均為解放軍疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室保存。

基因組DNA 提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；2×GoldStar Best MasterMix和ddH2O 購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；沙門菌檢測試劑盒（探針法）購自卓誠惠生生物科技股份有限公司（XABT）；Eppendorf 5424 離心機(jī)；BAIYANG 400C 離心機(jī)；DeNovix DS-11 FX超微量紫外熒光分光光度計(jì)；Molecular Devices SpectraMax i3x酶標(biāo)儀；BIO-RAD CFX96熒光定量PCR儀。

1.2 引物與TaqMan 探針的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank 中沙門菌ompF基因的保守序列，用Primer Express 3.0 軟件設(shè)計(jì)引物和探針。上游引物為5'-CCTGGCAGCGGTGATCC-3'，下游引物為5'-AAATTTCTGCTGCGTTTGCG-3'，探針為FAM-TGCCCTGCTGGCTGCTGCA-BHQ1，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.3 模板的制備

采用DNA 提取試劑盒提取和熱變性法2種方法制備DNA 模板。用天根生物公司的DNA 提取試劑盒提取細(xì)菌的基因組DNA，提取方法參照說明書，用DeNovix 超微量紫外熒光分光光度計(jì)測定DNA的濃度和純度。熱變性制備DNA 模板的方法參照文獻(xiàn)[8]。

1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以沙門菌基因組DNA 為模板，用ompF基因的上下游引物Blast 相應(yīng)基因序列，采用生工生物公司基因合成技術(shù)連接到pUC57 載體上，合成對應(yīng)甘油菌。菌液用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基于37℃過夜培養(yǎng)，用天根生物公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。用DeNovix 超微量紫外熒光分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度后用ddH2O 對質(zhì)粒進(jìn)行1/10 梯度稀釋，濃度為1.0×100～1.0×10-8ng/μL。

1.5 熒光定量PCR 反應(yīng)體系的建立

熒光定量PCR 反應(yīng)體系為25 μL，包括2×GoldStar Best MasterMix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，探針（10 μmol/L）1 μL，模板2 μL，ddH2O 7.5 μL。用BIO-RAD CFX96 熒光定量PCR 儀按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增：95℃預(yù)變性10 min；95℃15 s，60℃40 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)延伸結(jié)束時(shí)（60℃）進(jìn)行熒光信號檢測。熒光通道選擇FAM。

1.6 熒光定量PCR檢測方法的特異性

以前述9種不同血清型沙門菌和10種其他腸道致病菌的基因組DNA 為模板，用上述熒光定量PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證方法的特異性。

1.7 熒光定量PCR檢測方法的敏感性

以2 μL 梯度稀釋的質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，用Excel 軟件分析模板濃度與Ct值之間的關(guān)系，以質(zhì)粒濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)、Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過趨勢線和相關(guān)系數(shù)對實(shí)時(shí)熒光TaqMan PCR檢測體系的檢測敏感性進(jìn)行評價(jià)。

以甲型副傷寒沙門菌為陽性對照，制備菌懸液，用SpectraMax i3x 酶標(biāo)儀測定D600nm值，取培養(yǎng)好的沙門菌菌液100 μL 用PBS 對菌液進(jìn)行1/10梯度稀釋，將稀釋液涂布在培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算菌液濃度，選擇濃度100～106CFU/mL的菌液，用天根生物公司的DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA，以2 μL 梯度提取的基因組DNA 為模板進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，根據(jù)檢出Ct值和基因組DNA 對應(yīng)菌量濃度的對數(shù)值用Excel 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到趨勢線和相關(guān)系數(shù)，判斷實(shí)時(shí)熒光TaqMan PCR檢測體系的檢測敏感性。

1.8 熒光定量PCR檢測方法的重復(fù)性

以濃度分別為1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5ng/μL的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行上述熒光定量PCR 擴(kuò)增，重復(fù)5 次。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析各組Ct值之間的變異系數(shù)（CV），評價(jià)實(shí)時(shí)熒光TaqMan PCR檢測體系的檢測重復(fù)性。

提取濃度分別為105、104、103、102CFU/mL的菌液基因組DNA，以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，重復(fù)5 次。記錄各組Ct值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到CV，評價(jià)實(shí)時(shí)熒光TaqMan PCR檢測體系的檢測重復(fù)性。

1.9 熒光定量PCR檢測方法的臨床應(yīng)用

圖1 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用天根生物公司的DNA 提取試劑盒提取實(shí)驗(yàn)室采集的海鮮樣本消化腺基因組DNA，分別利用建立的沙門菌TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法及卓誠惠生沙門菌檢測試劑盒（探針法）對基因組DNA 進(jìn)行檢測，統(tǒng)計(jì)比較二者最終沙門菌陽性檢出率。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)特異性

采用熒光定量PCR 方法擴(kuò)增陽性對照質(zhì)粒、沙門菌及10種相關(guān)腸道病原菌的基因組DNA，結(jié)果見圖1。陽性質(zhì)粒和沙門菌基因組DNA 擴(kuò)增后呈S 型擴(kuò)增曲線，其他病原基因組DNA 及陰性對照均沒有擴(kuò)增，說明建立的熒光定量PCR檢測方法具有非常高的特異性。

2.2 反應(yīng)敏感性

將陽性質(zhì)粒1/10 梯度稀釋至濃度依次為1.0×100～1.0×10-8ng/μL，用稀釋后的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，結(jié)果見圖2。當(dāng)質(zhì)粒濃度為1.0×100～1.0×10-7ng/μL 時(shí)，Ct值隨濃度降低而增大，表明在該范圍內(nèi)能準(zhǔn)確定量，最低檢出限為0.1 ng/L。根據(jù)反應(yīng)體系中的質(zhì)粒濃度和擴(kuò)增的Ct值，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.43x+14.135，相關(guān)系數(shù)為0.9978（圖3），表明沙門菌基因組DNA的濃度與Ct值相關(guān)。

以100～106CFU/mL菌液所提基因組DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，結(jié)果見圖4，除100CFU/mL 無擴(kuò)增曲線外，其他濃度均有擴(kuò)增曲線，表明反應(yīng)敏感性為10 CFU/mL。根據(jù)反應(yīng)體系中基因組DNA 對應(yīng)的菌量濃度和擴(kuò)增的Ct值，計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.2923x+41.425，相關(guān)系數(shù)為0.987（圖5），表明沙門菌基因組DNA的濃度與Ct值相關(guān)。

圖2 陽性質(zhì)粒敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 反應(yīng)重復(fù)性

選取1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5ng/μL 共5個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，對建立的反應(yīng)體系分別進(jìn)行5 次重復(fù)檢測，記錄各組檢測Ct值并計(jì)算變異系數(shù)，結(jié)果見表1?？梢钥闯觯@5個(gè)濃度熒光定量PCR檢測Ct值的變異系數(shù)均小于0.6%，說明建立的檢測方法重復(fù)性極高。

圖3 陽性質(zhì)粒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖4 菌株樣本敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖5 菌株樣本實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

選取菌液濃度為105、104、103、102CFU/mL 共4個(gè)濃度提取的基因組DNA，對建立的反應(yīng)體系分別進(jìn)行5 次重復(fù)檢測，并計(jì)算Ct值的變異系數(shù)，結(jié)果見表2。4個(gè)濃度熒光定量PCR檢測Ct值的變異系數(shù)均小于0.8%，可以看出建立的檢測方法重復(fù)性極高。

2.4 實(shí)際樣本的檢測

2019年7月本實(shí)驗(yàn)室共接收海鮮樣本50 份，對海鮮樣本消化腺及人糞便樣本進(jìn)行前處理后，采用天根生物公司的DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，利用建立的沙門菌TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法對基因組DNA 進(jìn)行快速檢測，最終檢出沙門菌陽性19 份（38.0%）。用卓誠惠生沙門菌檢測試劑盒（探針法）對基因組DNA 進(jìn)行檢測，最終檢出沙門菌陽性19 份（38.0%）。對比發(fā)現(xiàn)建立的沙門菌TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法與卓誠惠生沙門菌檢測試劑盒對沙門菌檢出陽性率相同，說明建立的檢測方法可以用于臨床應(yīng)用。

3 討論

沙門菌為革蘭陰性腸道桿菌，是一種侵襲性細(xì)菌，能夠進(jìn)入多種宿主細(xì)胞，包括回腸黏膜上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的其他細(xì)胞和組織[9]，作為一種人類致病菌每年都會(huì)導(dǎo)致大量死亡和嚴(yán)重疾病病例，在全世界被廣泛關(guān)注。沙門菌通常通過糞口途徑感染個(gè)體，動(dòng)物或動(dòng)物制品是最常見的感染源，新鮮農(nóng)產(chǎn)品等間接受沙門菌污染的食品也會(huì)導(dǎo)致大量病例。由致病性沙門菌引起的疾病癥狀包括水樣腹瀉、惡心、腹痛、發(fā)燒和頭痛，在某些情況下能侵入人體成為系統(tǒng)性疾病[2]。老年人、極年幼者和免疫功能低下者發(fā)生并發(fā)癥和死亡的風(fēng)險(xiǎn)更高。因此，快速、準(zhǔn)確地檢測沙門菌，對臨床疾病的有效治療、防止疾病的傳播以及食品安全的保障具有重要意義。

表1 陽性質(zhì)粒重復(fù)性檢測結(jié)果

表2 菌株樣本重復(fù)性檢測結(jié)果

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是一種以PCR 為基礎(chǔ)建立的新技術(shù)，該技術(shù)擴(kuò)增與檢測分析同時(shí)進(jìn)行，具有快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)[10-11]。之前Gallegos-Robles 等[12]將invA基因用于沙門菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。但由于invA基因是通過水平基因轉(zhuǎn)移獲得的SPI1 上的毒力基因，在沙門菌某些血清型中可能存在該基因不穩(wěn)定或缺失的情況[13]。因此，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對沙門菌進(jìn)行快速分子檢測，除了利用invA基因外，還應(yīng)考慮其他靶點(diǎn)。研究表明靶點(diǎn)ompF為所有血清型沙門菌都具有的外膜孔蛋白基因[7]，經(jīng)在GenBank 中Blast 搜索發(fā)現(xiàn)，與ompF基因高度同源的序列只有沙門菌，表明ompF基因針對沙門菌具有覆蓋度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。我們選用該基因的特異性序列設(shè)計(jì)了引物和TaqMan 探針，利用pUC57 載體構(gòu)建了重組陽性質(zhì)粒。確定PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件后，同時(shí)對沙門菌陽性質(zhì)粒、9種不同型別的沙門菌，以及10種其他不含沙門菌的腸道病原菌基因組DNA 進(jìn)行了擴(kuò)增檢測，最終所有沙門菌及其陽性質(zhì)粒呈S 型擴(kuò)增曲線，其他細(xì)菌沒有擴(kuò)增，充分證明建立的沙門菌實(shí)時(shí)熒光定量Taq?Man PCR檢測方法具有高度特異性和覆蓋性。利用該方法分別對1/10 梯度稀釋的1.0×100～1.0×10-8ng/μL 范圍內(nèi)的陽性質(zhì)粒和100～106CFU/mL范圍內(nèi)的沙門菌基因組DNA 進(jìn)行了敏感性檢測及重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終檢測靈敏度分別為1.0×10-7ng/μL和101CFU/mL，而且2種擴(kuò)增曲線與對應(yīng)模板濃度都呈很好的線性關(guān)系，重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值變異系數(shù)也都低于0.8%。2013年杜雄偉等[14]建立的肉制品中沙門菌invA基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測方法的靈敏度為101CFU/mL，重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值變異系數(shù)為0.96%。與其對比，2種方法的檢測靈敏度一致，但我們建立的方法Ct值變異系數(shù)更低，充分證明了此次建立的方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。利用建立的方法與卓誠惠生沙門菌檢測試劑盒分別對實(shí)驗(yàn)室50 份實(shí)際海鮮樣本中沙門菌進(jìn)行檢測，最終2種檢測方法的陽性檢出率都為38.0%，說明建立的方法可有效應(yīng)用于臨床檢測、食品安全監(jiān)測等領(lǐng)域。

綜上所述，本工作建立了沙門菌TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)我們也已經(jīng)將該方法應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室日常保障檢測任務(wù)中，對沙門菌疫情防治具有重要意義。