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      沙門菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測方法的建立

      2019-02-28 03:26:38田賽郭衛(wèi)光包仁龍向瑩張浩然楊超杰謝靖劉鴻博宋宏彬邱少富杜昕穎
      生物技術(shù)通訊 2019年6期
      關(guān)鍵詞:沙門定量基因組

      田賽,郭衛(wèi)光,包仁龍,向瑩,張浩然,楊超杰,謝靖,劉鴻博,宋宏彬,邱少富,杜昕穎

      中國人民解放軍疾病預(yù)防控制中心,北京100071

      沙門菌是一種革蘭陰性菌,屬腸桿菌科,是常見的食源性腸道致病菌[1]。食用受污染的生肉、家禽、蛋類、乳制品等可使人發(fā)生食物中毒,由致病性沙門菌引起的人類疾病通常被稱為沙門菌病[2]。沙門菌病對全球特別是發(fā)展中國家的公共衛(wèi)生構(gòu)成嚴(yán)重威脅,在中國沙門菌病占食源性疾病的40%~60%[3]。因此,快速、準(zhǔn)確地檢測沙門菌對沙門菌病的有效防治是十分必要的。沙門菌鑒定的傳統(tǒng)方法主要根據(jù)形態(tài)學(xué)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征、抗原特征、噬菌體特征等。細(xì)菌培養(yǎng)是鑒定腸道致病菌的金標(biāo)準(zhǔn),但這一過程耗時(shí)較長,需3~5 d[4-5]?;诳乖褪删w檢測法只能針對活細(xì)菌,敏感性較低,容易出現(xiàn)假陰性情況,特異性差[6]。與傳統(tǒng)方法相比,基于核酸特異性序列分子方法的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 具有快速、敏感、特異且穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。我們根據(jù)沙門菌特異的外膜孔蛋白F基因(ompF)[7]的特異性序列設(shè)計(jì)合成引物及TaqMan 探針,建立了可快速檢測沙門菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      甲型副傷寒沙門菌,乙型副傷寒沙門菌,丙型副傷寒沙門菌,豬霍亂沙門菌,鼠傷寒沙門菌,腸炎沙門菌,旺茲沃思沙門菌,亞利桑納沙門菌,湯卜遜沙門菌,痢疾志賀菌,弗氏志賀菌,宋內(nèi)志賀菌,鮑氏志賀菌,副溶血弧菌,霍亂弧菌,大腸埃希菌EAEC、EPEC、ETEC、STEC,均為解放軍疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室保存。

      基因組DNA 提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;2×GoldStar Best MasterMix和ddH2O 購自康為世紀(jì)生物科技有限公司;沙門菌檢測試劑盒(探針法)購自卓誠惠生生物科技股份有限公司(XABT);Eppendorf 5424 離心機(jī);BAIYANG 400C 離心機(jī);DeNovix DS-11 FX超微量紫外熒光分光光度計(jì);Molecular Devices SpectraMax i3x酶標(biāo)儀;BIO-RAD CFX96熒光定量PCR儀。

      1.2 引物與TaqMan 探針的設(shè)計(jì)與合成

      根據(jù)GenBank 中沙門菌ompF基因的保守序列,用Primer Express 3.0 軟件設(shè)計(jì)引物和探針。上游引物為5'-CCTGGCAGCGGTGATCC-3',下游引物為5'-AAATTTCTGCTGCGTTTGCG-3',探針為FAM-TGCCCTGCTGGCTGCTGCA-BHQ1,由上海生工生物工程股份有限公司合成。

      1.3 模板的制備

      采用DNA 提取試劑盒提取和熱變性法2種方法制備DNA 模板。用天根生物公司的DNA 提取試劑盒提取細(xì)菌的基因組DNA,提取方法參照說明書,用DeNovix 超微量紫外熒光分光光度計(jì)測定DNA的濃度和純度。熱變性制備DNA 模板的方法參照文獻(xiàn)[8]。

      1.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

      以沙門菌基因組DNA 為模板,用ompF基因的上下游引物Blast 相應(yīng)基因序列,采用生工生物公司基因合成技術(shù)連接到pUC57 載體上,合成對應(yīng)甘油菌。菌液用含氨芐青霉素的培養(yǎng)基于37℃過夜培養(yǎng),用天根生物公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒。用DeNovix 超微量紫外熒光分光光度計(jì)測定質(zhì)粒濃度后用ddH2O 對質(zhì)粒進(jìn)行1/10 梯度稀釋,濃度為1.0×100~1.0×10-8ng/μL。

      1.5 熒光定量PCR 反應(yīng)體系的建立

      熒光定量PCR 反應(yīng)體系為25 μL,包括2×GoldStar Best MasterMix 12.5 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL,探針(10 μmol/L)1 μL,模板2 μL,ddH2O 7.5 μL。用BIO-RAD CFX96 熒光定量PCR 儀按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增:95℃預(yù)變性10 min;95℃15 s,60℃40 s,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)延伸結(jié)束時(shí)(60℃)進(jìn)行熒光信號檢測。熒光通道選擇FAM。

      1.6 熒光定量PCR檢測方法的特異性

      以前述9種不同血清型沙門菌和10種其他腸道致病菌的基因組DNA 為模板,用上述熒光定量PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增,驗(yàn)證方法的特異性。

      1.7 熒光定量PCR檢測方法的敏感性

      以2 μL 梯度稀釋的質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增,用Excel 軟件分析模板濃度與Ct值之間的關(guān)系,以質(zhì)粒濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)、Ct值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過趨勢線和相關(guān)系數(shù)對實(shí)時(shí)熒光TaqMan PCR檢測體系的檢測敏感性進(jìn)行評價(jià)。

      以甲型副傷寒沙門菌為陽性對照,制備菌懸液,用SpectraMax i3x 酶標(biāo)儀測定D600nm值,取培養(yǎng)好的沙門菌菌液100 μL 用PBS 對菌液進(jìn)行1/10梯度稀釋,將稀釋液涂布在培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù),計(jì)算菌液濃度,選擇濃度100~106CFU/mL的菌液,用天根生物公司的DNA提取試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA,以2 μL 梯度提取的基因組DNA 為模板進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增,根據(jù)檢出Ct值和基因組DNA 對應(yīng)菌量濃度的對數(shù)值用Excel 軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到趨勢線和相關(guān)系數(shù),判斷實(shí)時(shí)熒光TaqMan PCR檢測體系的檢測敏感性。

      1.8 熒光定量PCR檢測方法的重復(fù)性

      以濃度分別為1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5ng/μL的質(zhì)粒為模板,進(jìn)行上述熒光定量PCR 擴(kuò)增,重復(fù)5 次。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析各組Ct值之間的變異系數(shù)(CV),評價(jià)實(shí)時(shí)熒光TaqMan PCR檢測體系的檢測重復(fù)性。

      提取濃度分別為105、104、103、102CFU/mL的菌液基因組DNA,以此為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,重復(fù)5 次。記錄各組Ct值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析得到CV,評價(jià)實(shí)時(shí)熒光TaqMan PCR檢測體系的檢測重復(fù)性。

      1.9 熒光定量PCR檢測方法的臨床應(yīng)用

      圖1 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      采用天根生物公司的DNA 提取試劑盒提取實(shí)驗(yàn)室采集的海鮮樣本消化腺基因組DNA,分別利用建立的沙門菌TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法及卓誠惠生沙門菌檢測試劑盒(探針法)對基因組DNA 進(jìn)行檢測,統(tǒng)計(jì)比較二者最終沙門菌陽性檢出率。

      2 結(jié)果

      2.1 反應(yīng)特異性

      采用熒光定量PCR 方法擴(kuò)增陽性對照質(zhì)粒、沙門菌及10種相關(guān)腸道病原菌的基因組DNA,結(jié)果見圖1。陽性質(zhì)粒和沙門菌基因組DNA 擴(kuò)增后呈S 型擴(kuò)增曲線,其他病原基因組DNA 及陰性對照均沒有擴(kuò)增,說明建立的熒光定量PCR檢測方法具有非常高的特異性。

      2.2 反應(yīng)敏感性

      將陽性質(zhì)粒1/10 梯度稀釋至濃度依次為1.0×100~1.0×10-8ng/μL,用稀釋后的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增,結(jié)果見圖2。當(dāng)質(zhì)粒濃度為1.0×100~1.0×10-7ng/μL 時(shí),Ct值隨濃度降低而增大,表明在該范圍內(nèi)能準(zhǔn)確定量,最低檢出限為0.1 ng/L。根據(jù)反應(yīng)體系中的質(zhì)粒濃度和擴(kuò)增的Ct值,計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.43x+14.135,相關(guān)系數(shù)為0.9978(圖3),表明沙門菌基因組DNA的濃度與Ct值相關(guān)。

      以100~106CFU/mL菌液所提基因組DNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增,結(jié)果見圖4,除100CFU/mL 無擴(kuò)增曲線外,其他濃度均有擴(kuò)增曲線,表明反應(yīng)敏感性為10 CFU/mL。根據(jù)反應(yīng)體系中基因組DNA 對應(yīng)的菌量濃度和擴(kuò)增的Ct值,計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-3.2923x+41.425,相關(guān)系數(shù)為0.987(圖5),表明沙門菌基因組DNA的濃度與Ct值相關(guān)。

      圖2 陽性質(zhì)粒敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      2.3 反應(yīng)重復(fù)性

      選取1.0×10-1、1.0×10-2、1.0×10-3、1.0×10-4、1.0×10-5ng/μL 共5個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,對建立的反應(yīng)體系分別進(jìn)行5 次重復(fù)檢測,記錄各組檢測Ct值并計(jì)算變異系數(shù),結(jié)果見表1??梢钥闯觯@5個(gè)濃度熒光定量PCR檢測Ct值的變異系數(shù)均小于0.6%,說明建立的檢測方法重復(fù)性極高。

      圖3 陽性質(zhì)粒實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

      圖4 菌株樣本敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      圖5 菌株樣本實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

      選取菌液濃度為105、104、103、102CFU/mL 共4個(gè)濃度提取的基因組DNA,對建立的反應(yīng)體系分別進(jìn)行5 次重復(fù)檢測,并計(jì)算Ct值的變異系數(shù),結(jié)果見表2。4個(gè)濃度熒光定量PCR檢測Ct值的變異系數(shù)均小于0.8%,可以看出建立的檢測方法重復(fù)性極高。

      2.4 實(shí)際樣本的檢測

      2019年7月本實(shí)驗(yàn)室共接收海鮮樣本50 份,對海鮮樣本消化腺及人糞便樣本進(jìn)行前處理后,采用天根生物公司的DNA 提取試劑盒提取基因組DNA,利用建立的沙門菌TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法對基因組DNA 進(jìn)行快速檢測,最終檢出沙門菌陽性19 份(38.0%)。用卓誠惠生沙門菌檢測試劑盒(探針法)對基因組DNA 進(jìn)行檢測,最終檢出沙門菌陽性19 份(38.0%)。對比發(fā)現(xiàn)建立的沙門菌TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法與卓誠惠生沙門菌檢測試劑盒對沙門菌檢出陽性率相同,說明建立的檢測方法可以用于臨床應(yīng)用。

      3 討論

      沙門菌為革蘭陰性腸道桿菌,是一種侵襲性細(xì)菌,能夠進(jìn)入多種宿主細(xì)胞,包括回腸黏膜上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞以及網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的其他細(xì)胞和組織[9],作為一種人類致病菌每年都會(huì)導(dǎo)致大量死亡和嚴(yán)重疾病病例,在全世界被廣泛關(guān)注。沙門菌通常通過糞口途徑感染個(gè)體,動(dòng)物或動(dòng)物制品是最常見的感染源,新鮮農(nóng)產(chǎn)品等間接受沙門菌污染的食品也會(huì)導(dǎo)致大量病例。由致病性沙門菌引起的疾病癥狀包括水樣腹瀉、惡心、腹痛、發(fā)燒和頭痛,在某些情況下能侵入人體成為系統(tǒng)性疾病[2]。老年人、極年幼者和免疫功能低下者發(fā)生并發(fā)癥和死亡的風(fēng)險(xiǎn)更高。因此,快速、準(zhǔn)確地檢測沙門菌,對臨床疾病的有效治療、防止疾病的傳播以及食品安全的保障具有重要意義。

      表1 陽性質(zhì)粒重復(fù)性檢測結(jié)果

      表2 菌株樣本重復(fù)性檢測結(jié)果

      實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是一種以PCR 為基礎(chǔ)建立的新技術(shù),該技術(shù)擴(kuò)增與檢測分析同時(shí)進(jìn)行,具有快速、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)[10-11]。之前Gallegos-Robles 等[12]將invA基因用于沙門菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。但由于invA基因是通過水平基因轉(zhuǎn)移獲得的SPI1 上的毒力基因,在沙門菌某些血清型中可能存在該基因不穩(wěn)定或缺失的情況[13]。因此,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對沙門菌進(jìn)行快速分子檢測,除了利用invA基因外,還應(yīng)考慮其他靶點(diǎn)。研究表明靶點(diǎn)ompF為所有血清型沙門菌都具有的外膜孔蛋白基因[7],經(jīng)在GenBank 中Blast 搜索發(fā)現(xiàn),與ompF基因高度同源的序列只有沙門菌,表明ompF基因針對沙門菌具有覆蓋度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。我們選用該基因的特異性序列設(shè)計(jì)了引物和TaqMan 探針,利用pUC57 載體構(gòu)建了重組陽性質(zhì)粒。確定PCR 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件后,同時(shí)對沙門菌陽性質(zhì)粒、9種不同型別的沙門菌,以及10種其他不含沙門菌的腸道病原菌基因組DNA 進(jìn)行了擴(kuò)增檢測,最終所有沙門菌及其陽性質(zhì)粒呈S 型擴(kuò)增曲線,其他細(xì)菌沒有擴(kuò)增,充分證明建立的沙門菌實(shí)時(shí)熒光定量Taq?Man PCR檢測方法具有高度特異性和覆蓋性。利用該方法分別對1/10 梯度稀釋的1.0×100~1.0×10-8ng/μL 范圍內(nèi)的陽性質(zhì)粒和100~106CFU/mL范圍內(nèi)的沙門菌基因組DNA 進(jìn)行了敏感性檢測及重復(fù)實(shí)驗(yàn),最終檢測靈敏度分別為1.0×10-7ng/μL和101CFU/mL,而且2種擴(kuò)增曲線與對應(yīng)模板濃度都呈很好的線性關(guān)系,重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值變異系數(shù)也都低于0.8%。2013年杜雄偉等[14]建立的肉制品中沙門菌invA基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR檢測方法的靈敏度為101CFU/mL,重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值變異系數(shù)為0.96%。與其對比,2種方法的檢測靈敏度一致,但我們建立的方法Ct值變異系數(shù)更低,充分證明了此次建立的方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。利用建立的方法與卓誠惠生沙門菌檢測試劑盒分別對實(shí)驗(yàn)室50 份實(shí)際海鮮樣本中沙門菌進(jìn)行檢測,最終2種檢測方法的陽性檢出率都為38.0%,說明建立的方法可有效應(yīng)用于臨床檢測、食品安全監(jiān)測等領(lǐng)域。

      綜上所述,本工作建立了沙門菌TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法,該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、方便快捷等優(yōu)點(diǎn),同時(shí)我們也已經(jīng)將該方法應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室日常保障檢測任務(wù)中,對沙門菌疫情防治具有重要意義。

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